李妍 劉曄 李婷婷 宗斌 高鵬玉 徐全臣

［摘要］ 目的 通過檢測(cè)高咬合狀態(tài)下小鼠牙齦組織中血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（VEGF）及β-catenin表達(dá)的變化，探討VEGF及Wnt/β-catenin信號(hào)通路在牙齦組織改建中的作用。方法 選取4周齡昆明種雄性小鼠30只，隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，每組15只小鼠。通過拔除小鼠右側(cè)上頜全部磨牙的方法建立實(shí)驗(yàn)組小鼠高咬合模型。分別于術(shù)后第3、7、14、28、56天，每組每次隨機(jī)選取3只小鼠麻醉后處死，分離左側(cè)下頜第一磨牙及牙齦組織，使用蘇木精-伊紅（HE）染色觀察牙齦組織結(jié)構(gòu)的變化，使用免疫組化染色方法檢測(cè)牙齦組織中VEGF以及β-catenin表達(dá)的變化。結(jié)果 HE染色顯示，實(shí)驗(yàn)組拔牙后第14天牙齦組織明顯增厚，血管數(shù)量增多。免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示，對(duì)照組不同時(shí)間點(diǎn)牙齦組織中VEGF、β-catenin表達(dá)比較，差異無顯著性（P＞0.05）。實(shí)驗(yàn)組不同時(shí)間點(diǎn)牙齦組織中VEGF、β-catenin表達(dá)比較，差異有顯著性（F=250.4、343.9，P＜0.01）。除拔牙后第56天外，兩組其余時(shí)點(diǎn)牙齦組織VEGF、β-catenin表達(dá)比較差異均有顯著性（F=5.7～38.4，P＜0.05）。結(jié)論 高咬合狀態(tài)下，牙齦組織中VEGF及β-catenin表達(dá)的變化影響牙齦組織的改建。

［關(guān)鍵詞］ 咬合力；牙齦；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子類；Wnt信號(hào)通路；β連環(huán)素；模型，動(dòng)物；小鼠

［中圖分類號(hào)］ R781.4；R322.41? ? ［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］ A

［ABSTRACT］ Objective To investigate the role of vascular endothelial growth factor （VEGF） and the Wnt/β-catenin signaling pathway in gingival tissues remodeling by measuring the changes in VEGF and β-catenin expression in mouse gingival tissues under hyperocclusion.? Methods Thirty male Kunming mice aged four weeks were randomly divided into control group （n=15） and experimental group （n=15）. All the right maxillary molars of mice in the experimental group were extracted to establish a hyperocclusion model. On the 3rd， 7th， 14th， 28th， and 56th days after operation， three mice in each group were randomly selected and sacrificed under anesthesia. Their left mandibular first molars with the gingival tissues were isolated. Hematoxylin-eosin （HE） staining was performed to observe the histological changes of the gingiva， and immunohistochemical staining was used to measure the changes in VEGF and β-catenin expression in the gingival tissues.? Results The HE staining showed that in the experimental group， the thickness of gingival tissues and the number of blood vessels increased on day 14 after tooth extraction. The results of immunohistochemical examination showed that in the control group， there were no significant differences in the expression of VEGF and β-catenin in the gingival tissues between different time points （P>0.05）; while in the experimental group， there were significant differences in that between different time points （F=250.4，343.9，P<0.01）. At all time points except the 56th day after tooth extraction， there were significant differences in the expression of VEGF and β-catenin in the gingival tissues between the two groups （F=5.7-38.4，P<0.05）.? Conclusion Under hyperocclusion， changes in the expression of VEGF and β-catenin in gingival tissues affect the remodeling of gingival tissues.

［KEY WORDS］ Bite force; Gingiva; Vascular endothelial growth factors; Wnt signaling pathway; beta catenin; Models， animal; Mice

咬合力是維持牙周內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的主要因素，對(duì)牙周膜（PDL）的發(fā)育、成熟、形態(tài)和功能的維持以及牙槽骨的改建等起重要作用[1-2]。然而，臨床上也常常觀察到導(dǎo)致咬合力異常增高的情況，如牙齒早接觸、磨牙癥等。咬合力異常對(duì)PDL和牙槽骨的影響已有大量報(bào)道[3-6]，但是對(duì)牙齦組織改建的影響卻鮮有研究。血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（VEGF）是一種重要的促血管生成因子，其表達(dá)與咬合力的刺激密切相關(guān)[7-8]。研究證實(shí)VEGF在機(jī)械力刺激的牙周組織改建中起重要作用[9]。Wnt/β-catenin信號(hào)通路是一條高度保守的信號(hào)通路，對(duì)于維持牙周組織內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)有重要意義[10-12]。我們?cè)谇捌谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)，咬合力的改變可以引發(fā)PDL以及牙槽骨的一系列適應(yīng)性改建，而Wnt/β-catenin信號(hào)通路在這一過程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用[13-14]。本研究通過建立小鼠高咬合模型，觀察高咬合狀態(tài)下小鼠牙齦組織中VEGF和β-catenin表達(dá)的變化情況，并進(jìn)一步探討Wnt/β-catenin信號(hào)通路在小鼠牙齦組織改建中的作用。

1 材料和方法

1.1 主要試劑及設(shè)備

DAB顯色試劑盒、SABC試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），兔抗人EBNA-1單克隆抗體以及兔抗人EBNA-2單克隆抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司），光學(xué)倒置顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組以及動(dòng)物模型的建立

4周齡雄性昆明種小鼠（購(gòu)買自青島大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室）30只，體質(zhì)量（25±5）g，無齲壞，無牙周組織疾病，牙列完整。所有動(dòng)物均常規(guī)飼養(yǎng)于青島大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，保持室溫25 ℃，室內(nèi)濕度56%，12-12 h明暗交替環(huán)境，標(biāo)準(zhǔn)飲食，自由飲水。將小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，每組15只小鼠。小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，麻醉狀態(tài)下拔除實(shí)驗(yàn)組小鼠右側(cè)上頜3顆磨牙。對(duì)照組僅進(jìn)行麻醉處理。

1.3 標(biāo)本制備

分別于拔牙后第3、7、14、28、56天，每組每次隨機(jī)選取3只小鼠麻醉下處死小鼠。以40 g/L多聚甲醛行心臟灌注固定。取出左側(cè)下頜骨磨牙區(qū)骨段（含牙齦組織），浸泡于40 g/L多聚甲醛緩沖液中，于4 ℃環(huán)境中加強(qiáng)固定24 h；然后將標(biāo)本移至EDTA中脫鈣3～4周，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，沿左側(cè)下頜第一磨牙近遠(yuǎn)中方向連續(xù)5 μm厚切片，切片行蘇木精-伊紅（HE）染色及免疫組織化學(xué)染色。

1.4 HE染色

牙齦組織切片行常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，切片置于蘇木精中染色5 min，氨水中返藍(lán)30 s，然后置于伊紅溶液中染色2 min；隨后切片行梯度乙醇脫水，二甲苯透明，用中性樹膠封片，將切片置于顯微鏡下觀察。

1.5 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)牙齦組織中VEGF及β-catenin的表達(dá)

牙齦組織切片行常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，室溫下將稀釋的一抗滴加到切片上，孵育12 h。用含卵白蛋白的PBS稀釋二抗，滴加到切片上，在室溫下孵育30 min。將切片置于DAB溶液中孵育1～5 min，然后蘇木精復(fù)染，中性樹膠封片。于顯微鏡下觀察下頜第一磨牙舌側(cè)牙齦結(jié)締組織，以細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒定義為陽性細(xì)胞。光鏡下，每張切片隨機(jī)選取3個(gè)高倍視野（1 000倍），計(jì)數(shù)視野內(nèi)陽性細(xì)胞總數(shù)，并計(jì)算陽性細(xì)胞表達(dá)率。陽性細(xì)胞表達(dá)率=陽性細(xì)胞總數(shù)／細(xì)胞總數(shù)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用Image-Pro Plus 6.0 圖像分析軟件包處理數(shù)據(jù)，陽性細(xì)胞率以±s表示，組間比較采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，以P ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)? 果

2.1 高咬合狀態(tài)對(duì)牙齦組織形態(tài)學(xué)的影響

HE染色結(jié)果顯示，拔牙后第14 天實(shí)驗(yàn)組小鼠牙齦組織較對(duì)照組明顯增厚，血管數(shù)量增多（圖1）。

2.2 高咬合狀態(tài)對(duì)牙齦組織中VEGF表達(dá)的影響

時(shí)間、組別、時(shí)間與組別交互作用對(duì)兩組牙齦組織VEGF表達(dá)有明顯的影響（F時(shí)間 =184.8，F(xiàn)組別 =844.7，F(xiàn)交互 =188.2，P＜0.01）。對(duì)照組不同時(shí)間點(diǎn)牙齦組織VEGF陽性表達(dá)率相比較差異無顯著性（P＞0.05）。實(shí)驗(yàn)組不同時(shí)間點(diǎn)牙齦組織VEGF陽性表達(dá)率比較差異有顯著性（F=250.4，P＜0.01）。除拔牙后第56天外，兩組其余時(shí)點(diǎn)牙齦組織VEGF陽性表達(dá)率比較差異均具有顯著性（F=5.7～20.8，P＜0.05）。見圖2A～F、表1。

2.3 高咬合狀態(tài)對(duì)牙齦組織中Wnt/β-catenin信號(hào)通路的影響

時(shí)間、組別、時(shí)間與組別交互作用對(duì)兩組牙齦組織β-catenin的陽性表達(dá)率具有明顯的影響（F時(shí)間=204.4，F(xiàn)組別=379.7，F(xiàn)交互=206.0，P＜0.01）。對(duì)照組不同時(shí)間點(diǎn)牙齦組織β-catenin陽性表達(dá)率比較差異無顯著意義（P＞0.05）。實(shí)驗(yàn)組不同時(shí)間點(diǎn)牙齦組織β-catenin陽性表達(dá)率比較差異具有顯著意義（F=343.9，P＜0.01）。除拔牙后第56天，兩組其余時(shí)間點(diǎn)牙齦組織β-catenin陽性表達(dá)率均差異顯著（F=5.9～38.4，P＜0.05）。見圖2G～L、表2。

3 討? 論

3.1 高咬合狀態(tài)對(duì)牙齦組織中VEGF表達(dá)的影響

在牙周組織中，VEGF主要表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞、成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞以及成纖維細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，參與牙周組織的改建與修復(fù)。VEGF是主要的血管生成因子，能夠以自分泌因子的形式，作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)新生血管的形成；同時(shí)，VEGF也能夠以旁分泌因子的形式，作用于成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞以及成纖維細(xì)胞，增強(qiáng)細(xì)胞活性，促進(jìn)細(xì)胞的增殖和分化，從而生成新生骨組織及膠原纖維[15-19]。研究發(fā)現(xiàn)，在正畸牙移動(dòng)過程中，受壓的PDL細(xì)胞能夠產(chǎn)生VEGF，促進(jìn)血管生成，同時(shí)，在骨吸收陷窩的破骨細(xì)胞中也可觀察到VEGF的表達(dá)，VEGF通過調(diào)節(jié)局部血液循環(huán)和骨代謝來促進(jìn)PDL內(nèi)在平衡，在牙周改建中發(fā)揮關(guān)鍵作用[20]。通過構(gòu)建咬合功能恢復(fù)的動(dòng)物模型，MOTOKAWA等[21]發(fā)現(xiàn)咬合刺激可調(diào)節(jié)PDL細(xì)胞中VEGF的表達(dá)，從而誘導(dǎo)破骨細(xì)胞增殖，導(dǎo)致牙槽骨吸收。本研究在牙齦組織中也發(fā)現(xiàn)了類似的改變，高咬合狀態(tài)下，牙齦組織中的VEGF表達(dá)增加，從而促進(jìn)了血管生成，建立了有效的血液循環(huán)，為牙齦改建提供充足的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。VEGF的增加意味著血管及組織的新生，這與本研究觀察到牙齦組織的增厚相一致。本研究實(shí)驗(yàn)組VEGF的表達(dá)在拔牙后第14天時(shí)達(dá)峰值，然后逐漸下降，第56天時(shí)與對(duì)照組比較無明顯差異，提示在高咬合狀態(tài)作用下，牙齦組織通過一系列的改建作用，最終適應(yīng)了高咬合狀態(tài)，達(dá)到了新的生理平衡。

3.2 高咬合狀態(tài)對(duì)牙齦組織中Wnt/β-catenin信號(hào)通路的影響

Wnt/β-catenin信號(hào)通路可以通過介導(dǎo)機(jī)械信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和分化，對(duì)維持PDL和牙槽骨穩(wěn)態(tài)具有重要意義[22-26]。研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)典的Wnt通路能夠介導(dǎo)PDL細(xì)胞中的壓力信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，通過其下游靶點(diǎn)調(diào)控成骨分化，并在體外通過平衡成骨細(xì)胞核因子κB受體活化受體和骨保護(hù)素的表達(dá)參與破骨形成[27]。牙齦成纖維細(xì)胞是牙齦組織中的主要應(yīng)力細(xì)胞，靜壓力通過影響牙齦成纖維細(xì)胞中的糖原合成酶激酶-3β/β-catenin信號(hào)軸與α-平滑肌肌動(dòng)蛋白的表達(dá)，將機(jī)械信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)樯镄盘?hào)，引發(fā)一系列生理活動(dòng)，從而參與牙齦組織的改建過程[28]。在本研究中，高咬合狀態(tài)下，牙齦組織中β-catenin表達(dá)增加，并持續(xù)升高至拔牙后第14天，然后下降。這一結(jié)果與本課題組之前在PDL中觀察到的結(jié)果相一致[13]。提示高咬合狀態(tài)可能是通過調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路來影響牙齦組織的改建。

3.3 Wnt／β-catenin信號(hào)通路對(duì)牙周組織改建影響

本課題組前期的研究觀察到，在高咬合狀態(tài)下，PDL和牙槽骨初期表現(xiàn)為組織的破壞和細(xì)胞的凋亡，然而隨著時(shí)間推移，組織的修復(fù)和細(xì)胞的增殖顯示優(yōu)勢(shì)，最終呈現(xiàn)為PDL纖維增粗、排列致密和牙槽骨密度的增加，這些結(jié)果提示牙周組織通過改建來適應(yīng)高咬合狀態(tài)。課題組進(jìn)一步利用轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)細(xì)胞系追蹤技術(shù)，證明了Wnt/β-catenin信號(hào)通路對(duì)PDL和牙槽骨中的一系列組織和細(xì)胞學(xué)的改變起調(diào)控作用[13]。本實(shí)驗(yàn)中，高咬合狀態(tài)的刺激引發(fā)牙齦組織中β-catenin和VEGF的表達(dá)增強(qiáng)，兩者都呈現(xiàn)出先升高后降低的變化趨勢(shì)，提示在牙齦組織中，增強(qiáng)的咬合力可能同樣通過Wnt/β-catenin信號(hào)通路調(diào)控VEGF的表達(dá)，從而影響牙齦組織的改建，以適應(yīng)新的咬合狀態(tài)，維護(hù)牙周組織的健康。這一研究結(jié)果與其他學(xué)者所報(bào)道的Wnt/β-catenin信號(hào)通路在VEGF表達(dá)和血管生成過程中發(fā)揮重要作用的結(jié)論相一致[29-30]。

綜上所述，高咬合狀態(tài)可能通過Wnt/β-catenin信號(hào)通路調(diào)節(jié)牙齦組織中VEGF的表達(dá)，影響牙齦組織的改建，具體機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

倫理批準(zhǔn)和動(dòng)物權(quán)利聲明：本研究涉及的所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均已通過青島大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的審核批準(zhǔn)（文件號(hào)QYFYWZLL-26090）。所有實(shí)驗(yàn)過程均遵照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》進(jìn)行。受試對(duì)象或其親屬已經(jīng)簽署知情同意書。

作者聲明：李妍、劉曄、徐全臣參與了研究設(shè)計(jì)；李妍、劉曄、李婷婷、宗斌、高鵬玉、徐全臣參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發(fā)表該論文。所有作者均聲明不存在利益沖突。

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（本文編輯 耿波 厲建強(qiáng)）