李會聰 吳紅果 魯衍強(qiáng) 王艷超 王秋菊 胡季芳 楊琦

［摘要］ 目的 分析郟縣漢族育齡女性葉酸代謝關(guān)鍵酶5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）基因和甲硫氨酸合成酶還原酶（MTRR）基因相關(guān)位點(diǎn)多態(tài)性分布的特點(diǎn)，旨在為孕婦增補(bǔ)葉酸提供參考。方法 采集2017—2019年在郟縣婦幼保健院接受孕期檢查的554例女性的口腔黏膜細(xì)胞樣本，提取DNA，采用相關(guān)PCR法對MTRR基因A66G位點(diǎn)、MTHFR基因A1298C、C677T位點(diǎn)多態(tài)性進(jìn)行檢測并分析。結(jié)果 所有樣本基因位點(diǎn)多態(tài)性分布符合遺傳平衡定律。其中MTHFR基因C677T位點(diǎn)TT型、CT型、CC型占比分別為42.8%、43.3%、13.9%；MTHFR基因A1298C位點(diǎn)AA型、AC型、CC型占比分別為77.3%、22.0%、0.7%；MTRR基因A66G位點(diǎn)AA型、AG型、GG型占比分別為56.7%、36.6%、6.7%。郟縣漢族育齡女性MTHFR基因C677T和A1298C兩位點(diǎn)連鎖有7種組合，頻率最高的是TT/AA（42.8%），無TT/AC和TT/CC組合，兩位點(diǎn)間存在強(qiáng)連鎖不平衡（D′=0.984，r2=0.233）。結(jié)論 郟縣漢族育齡女性MTHFR、MTRR基因位點(diǎn)多態(tài)性特征與其他地區(qū)漢族女性有所區(qū)別，具有地域特異性，其中MTHFR基因C677T位點(diǎn)中，TT基因型占比較高，如妊娠期女性為該基因類型，在其妊娠期間應(yīng)適當(dāng)增加葉酸量，并根據(jù)實(shí)際情況增加增補(bǔ)天數(shù)。

［關(guān)鍵詞］ 亞甲基四氫葉酸還原酶（NADPH）；甲硫氨酸合成酶還原酶；多態(tài)性，單核苷酸；葉酸；孕婦

［中圖分類號］ R173；R394.5? ? ［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］ A

［ABSTRACT］ Objective To analyze the distribution characteristics of the gene polymorphisms of key enzymes related to folate metabolism [5，10-methylenetetrahydrofolate reductase （MTHFR） and methionine synthase reductase （MTRR）] in women of reproductive age of the Han nationality in Jia County， China， and to provide a reference for folate supplementation for pregnant women.? Methods A total of 554 women who underwent examinations during pregnancy in Jia County Maternal and Child Health Hospital from 2017 to 2019 were enrolled. Oral mucosal cell samples were collected from them， followed by DNA extraction. PCR was used to examine MTRR （A66G） and MTHFR （A1298C and C677T） polymorphisms.? Results The distribution of polymorphisms of all the samples accorded with the law of genetic equilibrium. The proportions of TT， CT， and CC genotypes at the C677T locus of the MTHFR gene were 42.8%， 43.3%， and 13.9%， respectively. The proportions of AA， AC， and CC ge-notypes at MTHFR A1298C were 77.3%， 22.0%， and 0.7%， respectively. The proportions of AA， AG， and GG genotypes at MTRR A66G were 56.7%， 36.6%， and 6.7%， respectively. There were seven combinations of MTHFR C677T and A1298C ge-notypes among the Han women of reproductive age in Jia County. TT/AA was the most frequent combination， which accounted for 42.8%. No TT/AC or TT/CC combination was found. There was a strong linkage disequilibrium between the two loci （D′=0.984，r2=0.233）.? Conclusion Different from those of Han women in other regions， Han women of reproductive age in Jia County show regional specificity in MTHFR and MTRR polymorphisms. There is a high proportion of the TT genotype at MTHFR C677T， with which genotype women should appropriately increase the dose and duration of folate supplementation according to actual situation during pregnancy.

［KEY WORDS］ Methylenetetrahydrofolate reductase （NADPH2）; Methionine synthase reductase; Polymorphism， single nucleotide; Folic acid; Pregnant women

葉酸是人體重要的營養(yǎng)素之一，參與人體DNA合成、甲基化等生理過程。在人體葉酸代謝的過程中，很多酶發(fā)揮重要作用，其中包括甲硫氨酸合成酶還原酶（MTRR）以及5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）等[1-5]，基因位點(diǎn)多態(tài)性的存在是酶具有不同活性的重要原因之一，同時(shí)也導(dǎo)致其具有的葉酸利用能力不同，可對機(jī)體中的葉酸水平等產(chǎn)生重要影響，進(jìn)而使機(jī)體出現(xiàn)多種不同臨床表現(xiàn)，如妊娠期高血壓、出生缺陷等[6-9]。本研究選擇郟縣的漢族女性作為研究對象，檢測其MTHFR基因C677T、A1298C位點(diǎn)和MTRR基因A66G位點(diǎn)的多態(tài)性分布，為該區(qū)域育齡女性葉酸增補(bǔ)方案提供依據(jù)?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2017—2019年于郟縣婦幼保健院進(jìn)行孕期檢查的漢族健康育齡女性共554例，平均年齡為（27.77±4.76）歲。

1.2 檢測方法

采集受檢者口腔黏膜細(xì)胞樣本，提取DNA，使用探針技術(shù)對MTRR基因和MTHFR基因相關(guān)位點(diǎn)多態(tài)性進(jìn)行檢測，同時(shí)使用熒光定量PCR儀讀取結(jié)果并記錄，利用squence detection software軟件確定基因分型結(jié)果。使用的主要設(shè)備、試劑等均由ABI公司生產(chǎn)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用HaploView 4.2軟件進(jìn)行連鎖不平衡水平（LD）分析。并對理論頻數(shù)與預(yù)計(jì)頻數(shù)進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)? 果

2.1 Hardy-Weinberg平衡分析

對入組對象的MTRR基因和MTHFR 基因位點(diǎn)多態(tài)性進(jìn)行分析，并且對理論頻數(shù)與預(yù)計(jì)頻數(shù)進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，結(jié)果顯示兩者分布符合遺傳平衡（P＞0.05）。見表1。

2.2 基因型頻率分析

郟縣漢族育齡女性MTHFR基因C677T位點(diǎn)CC型、CT型及TT型占比分別為13.9%、43.3%、42.8%；MTHFR基因A1298C位點(diǎn)AA型、AC型及CC型占比分別為77.3%、22.0%、0.7%；MTRR基因A66G位點(diǎn)AA型、AG型以及GG型占比分別為56.7%、36.6%、6.7%。

2.3 等位基因頻率分析

郟縣漢族育齡女性MTHFR基因C677T C、T等位基因所占頻率分別為35.6%、64.4%，MTHFR基因A1298C A、C等位基因所占頻率則分別為88.3%、11.7%，MTRR基因A66G A、G等位基因所占頻率分別為75.0%、25.0%。

2.4 MTHFR基因C677T和A1298C連鎖及單倍型分析

兩個(gè)基因位點(diǎn)之間存在著7種不同組合的連鎖情況，其中TT/AA頻率最高（42.8%），然后頻率依次為CT/AA（27.6%）、CT/AC（15.5%）、CC/AA（6.9%）、CC/AC（6.5%）、CC/CC（0.5%）、CT/CC（0.2%），但兩個(gè)基因位點(diǎn)間不存在TT/AC和TT/CC組合。

MTHFR基因C677T和A1298C兩個(gè)位點(diǎn)構(gòu)建的單倍型總共存在4種組合：TA（64.3%）、CA（23.9%）、CC（11.6%）、TC（0.1%），LD分析結(jié)果顯示，兩位點(diǎn)間存在強(qiáng)連鎖不平衡（D′=0.984，r2=0.233）。

3 討? 論

在女性妊娠過程中，如果葉酸補(bǔ)充不充分，則可能會導(dǎo)致出生缺陷的情況出現(xiàn)，為了有效預(yù)防該情況的出現(xiàn)，有必要讓妊娠期女性適當(dāng)進(jìn)行葉酸的補(bǔ)充。在21世紀(jì)初期我國就頒布了一系列政策用于農(nóng)村育齡女性葉酸的補(bǔ)充，但是不同地區(qū)的出生缺陷預(yù)防效果依然存在差異。原因之一是不同地區(qū)具有不同的民俗習(xí)慣，包括飲食等，原因之二是生活在不同地區(qū)的人具有不同的基因位點(diǎn)多態(tài)性，因此導(dǎo)致不同地區(qū)的人群葉酸代謝能力不同。對不同民族、地區(qū)的人群葉酸代謝途徑進(jìn)行的研究顯示，代謝葉酸關(guān)鍵酶的基因位點(diǎn)存在多態(tài)性，對其進(jìn)行更加深入的研究可為臨床干預(yù)奠定基礎(chǔ)，從而讓不同地區(qū)育齡女性能個(gè)性化增補(bǔ)葉酸。

在人體代謝葉酸的過程中，有很多酶可發(fā)揮關(guān)鍵作用，其中包括MTHFR和MTRR，基因位點(diǎn)多態(tài)性的原因?qū)е铝嗣富钚缘牟煌Ｈ鏜THFR基因第5個(gè)外顯子上677位置的C與T的不同，可引起編碼氨基酸由Ala變?yōu)閂al，導(dǎo)致酶活性和熱穩(wěn)定性下降，若以攜帶MTHFR基因C677T CC基因型的個(gè)體的酶活性為100%，則攜帶CT基因型的個(gè)體的酶活性為71%，而基因型為TT的個(gè)體的酶活性只有34%[10]。女性處于妊娠期時(shí)，其極易發(fā)生葉酸缺乏。葉酸缺乏除膳食攝入不足和孕期需求量增加以外，還與患者的遺傳物質(zhì)密切相關(guān)，即使在每天補(bǔ)充400 μg葉酸的基礎(chǔ)上，仍有一部分孕婦因基因位點(diǎn)多態(tài)性導(dǎo)致無法在該時(shí)期補(bǔ)充足夠的葉酸，進(jìn)而引起葉酸需求量的不足。育齡婦女在妊娠前和妊娠期進(jìn)行葉酸代謝相關(guān)基因位點(diǎn)多態(tài)性檢測，可從分子水平上將葉酸利用能力差的人群篩查出來，為醫(yī)生指導(dǎo)孕婦進(jìn)行葉酸個(gè)性化補(bǔ)充提供科學(xué)依據(jù)。針對葉酸代謝障礙人群，從葉酸服用的時(shí)長和劑量上進(jìn)行強(qiáng)化，以降低不良孕產(chǎn)、出生缺陷如神經(jīng)管畸形、先天性心臟病等的出現(xiàn)概率[11]。在不同地區(qū)，本研究涉及到的基因位點(diǎn)均具有多態(tài)性分布特點(diǎn)[12]。本研究顯示，在郟縣漢族女性MTHFR基因中，T等位基因頻率為64.4%，TT頻率為42.8%，明顯高于已經(jīng)報(bào)道的新疆阿克蘇地區(qū)[13]、遼寧沈陽市[14]、浙江麗水市[15]、貴州貴陽市[16]以及廣東佛山市[17]等地的漢族女性數(shù)據(jù)，同時(shí)也高于河南其他地區(qū)，例如鄭州[18]、新鄉(xiāng)[19]等，說明本地區(qū)的女性對于葉酸利用能力普遍較低，應(yīng)實(shí)行個(gè)體化的葉酸增補(bǔ)方案，即對于MTHFR基因C677T TT高風(fēng)險(xiǎn)人群，可以適量增加葉酸補(bǔ)服劑量400～800 μg，同時(shí)延長葉酸增補(bǔ)時(shí)間；對于其他基因型，也可以結(jié)合臨床生化指標(biāo)，靈活調(diào)整方案。

總之，本研究結(jié)果顯示，郟縣的漢族育齡女性MTHFR基因C677T高風(fēng)險(xiǎn)型位點(diǎn) TT占比較高，如育齡女性具有該基因型則無法充分利用葉酸。因此，有必要篩查育齡女性該基因位點(diǎn)，識別葉酸利用能力低下人群，進(jìn)行個(gè)體化干預(yù)及重點(diǎn)人群孕期管理，進(jìn)而降低新生兒出生缺陷等情況出現(xiàn)概率。

倫理批準(zhǔn)和知情同意：本文研究所有內(nèi)容已經(jīng)獲得中國疾病預(yù)防控制中心婦幼保健中心婦幼保健分子遺傳醫(yī)學(xué)研究專項(xiàng)計(jì)劃的審核批準(zhǔn)。所有試驗(yàn)過程均遵照《人體醫(yī)學(xué)研究的倫理準(zhǔn)則》 的條例進(jìn)行。受試對象或其親屬已經(jīng)簽署知情同意書。

作者聲明：李會聰、 吳紅果、王艷超、王秋菊參與了研究設(shè)計(jì)；李會聰、魯衍強(qiáng)、胡季芳、楊琦參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發(fā)表該論文。所有作者均聲明不存在利益沖突。

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（本文編輯 耿波 厲建強(qiáng)）