牛婷婷　吳琍　侯琳　仇碧茹　趙曉暉　李金洋

［摘要］ 目的 探討miR-429對乳腺癌細(xì)胞增殖和遷移的影響及其機(jī)制。方法 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）法和免疫印跡法，分別檢測乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-468、BT-549細(xì)胞及正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A的eIF4E mRNA和蛋白相對表達(dá)量。在MCF-7細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-429 mimics（A組）、mimics NC（B組）、miR-429 inhibitors（C組）及inhibitors NC（D組），采用RT-qPCR法、CCK8法、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和免疫印跡法檢測A～D組細(xì)胞miR-429表達(dá)情況、細(xì)胞增殖和遷移情況、eIF4E mRNA和蛋白相對表達(dá)量。在293T細(xì)胞中轉(zhuǎn)染eIF4E-3′UTR-Wt+miR-429 mimics（E組）、eIF4E-3′UTR-Wt+mimics NC（F組）、eIF4E-3′UTR-Mut+miR-429 mimics（G組）、eIF4E-3′UTR-Mut+mimics NC（H組），檢測E～H組細(xì)胞相對熒光素酶活性，分析miR-429對eIF4E的靶向調(diào)控作用。結(jié)果 RT-qPCR與免疫印跡檢測結(jié)果顯示，MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-468、BT-549細(xì)胞中的eIF4E mRNA以及蛋白的相對表達(dá)量均明顯高于正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A（F=74.414、1 981.243，P<0.01）。RT-qPCR法檢測結(jié)果顯示，A組細(xì)胞的miR-429相對表達(dá)量明顯高于B組（t=25.390，P<0.01），而eIF4E mRNA相對表達(dá)量明顯低于B組（t=－6.363，P<0.05），C組細(xì)胞miR-429相對表達(dá)量明顯低于D組（t=－4.652，P<0.05），而eIF4E mRNA相對表達(dá)量明顯高于B組（t=－2.928，P<0.05）。CCK8實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果顯示，與B組細(xì)胞相比，A組細(xì)胞第24、48、72小時(shí)時(shí)的增殖活力明顯降低（F=26.148～40.997，P<0.01）；與D組細(xì)胞相比，C組細(xì)胞第24、48、72小時(shí)增殖活力明顯增高（F=6.410～82.593，P<0.05）。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)顯示，A組細(xì)胞愈合率明顯低于B組（t=－22.584，P<0.01），C組細(xì)胞愈合率明顯高于D組（t=11.464，P<0.01）。免疫印跡法檢測結(jié)果顯示，A組細(xì)胞中eIF4E蛋白相對表達(dá)量明顯低于B組（t=－20.355，P<0.01），C組細(xì)胞eIF4E蛋白相對表達(dá)量明顯高于D組（t=3.622，P<0.01）。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，各組細(xì)胞相對熒光素酶活性比較差異具有顯著性（F=366.823，P<0.05），而且E組細(xì)胞相對熒光素酶活性顯著低于F組（t=－42.961，P<0.01）。結(jié)論 miR-429或通過靶向調(diào)控eIF4E基因進(jìn)而抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖和遷移。

［關(guān)鍵詞］ 乳腺腫瘤；微RNAs；真核細(xì)胞起始因子4E；細(xì)胞增殖；細(xì)胞運(yùn)動(dòng)

［中圖分類號］ R737.9

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］ A

EFFECT OF miR-429 ON THE PROLIFERATION AND MIGRATION OF BREAST CANCER CELLS AND ITS MECHANISM＼ NIU Tingting， WU Li， HOU Lin， QIU Biru， ZHAO Xiaohui， LI Jinyang （Department of Breast Surgery， The Affiliated Hospital of Qingdao University， Qingdao 266003， China）

［ABSTRACT］ Objective To investigate the effect of miR-429 on the proliferation and migration of breast cancer cells and its mechanism. Methods RT-qPCR and Western blotting were used to measure the relative mRNA and protein expression levels of eIF4E in breast cancer MCF-7， MDA-MB-231， MDA-MB-468， and BT-549 cells and normal breast epithelial MCF-10A cells. MCF-7 cells were transfected with miR-429 mimics （group A）， mimics NC （group B）， miR-429 inhibitors （group C）， and inhibitors NC （group D）， and RT-qPCR， CCK-8 assay， wound healing assay， and Western blotting were used to measure the expression of miR-429， cell proliferation and migration， and the relative mRNA and protein expression levels of eIF4E in groups A-D. The 293T cells were transfected with eIF4E-3′UTR-Wt+miR-429 mimics （group E）， eIF4E-3′UTR-Wt+mimics NC （group F）， eIF4E-3′UTR-Mut+miR-429 mimics （group G）， and eIF4E-3′UTR-Mut+mimics NC （group H）， and relative luciferase activity was measured for groups E-H. The targeted regulatory effect of miR-429 on eIF4E was analyzed. Results RT-qPCR and Western blotting showed that the relative mRNA and protein expression levels of eIF4E in MCF-7， MDA-MB-231， MDA-MB-468， and BT-549 cells were significantly higher than those in normal breast epithelial MCF-10A cells （F=74.414，1 981.243，P<0.01）. RT-qPCR showed that compared with group B， group A had a significantly higher relative expression level of miR-429 （t=25.390，P<0.01） and a significantly lower relative mRNA expression level of eIF4E （t=-6.363，P<0.05）; group C had a signi-ficantly lower relative expression level of miR-429 than group D （t=-4.652，P<0.05） and a significantly higher relative mRNA expression level of eIF4E than group B （t=-2.928，P<0.05）. CCK8 assay showed that compared with group B， group A had a significant reduction in proliferation activity at 24， 48， and 72 hours （F=26.148-40.997，P<0.01）， and compared with group D， group C had a significant increase in proliferation activity at 24， 48， and 72 hours （F=6.410-82.593，P<0.05）. Wound healing assay showed that group A had a significantly lower healing rate than group B （t=-22.584，P<0.01）， and group C had a significantly higher healing rate than group D （t=11.464，P<0.01）. Western blotting showed that group A had a significantly lower relative protein expression level of eIF4E than group B （t=-20.355，P<0.01）， and group C had a significantly higher relative protein expression level of eIF4E than group D （t=3.622，P<0.01）. Dual-luciferase reporter assay showed that there was a significant difference in relative luciferase activity between groups （F=366.823，P<0.05）， and group E had a significantly lower relative luciferase activity than group F （t=-42.961，P<0.01）. ConclusionThis study shows that miR-429 may inhibit the proliferation and migration of breast cancer cells through targeted regulation of the eIF4E gene.

［KEY WORDS］ Breast neoplasms; MicroRNAs; Eukaryotic initiation factor-4E; Cell proliferation; Cell movement

乳腺癌的發(fā)病率遠(yuǎn)高于其他女性腫瘤，嚴(yán)重威脅著女性生命健康，已成為全球第一大常見腫瘤^[1]。微小RNA（miRNA）是在真核生物中內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的一類小分子非編碼RNA，其作用機(jī)制為通過與目的基因mRNA的3′非翻譯區(qū)（UTR）堿基互補(bǔ)配對結(jié)合，以轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)的方式調(diào)控靶基因的表達(dá)水平，影響細(xì)胞增殖、遷移等的生物學(xué)行為^[2]。miR-429屬于miRNA-200家族，作為癌基因或抑癌基因在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用^[3-4]。相關(guān)研究表明miR-429在乳腺癌中呈低表達(dá)，扮演抑癌基因的角色^[5]。真核細(xì)胞翻譯起始因子4E（eIF4E）可在翻譯起始時(shí)特異性識別結(jié)合真核mRNA的5′端帽子結(jié)構(gòu)^[6]，通過使5′UTR解旋影響mRNAs的代謝、加工、運(yùn)輸、翻譯等，在帽依賴的翻譯起始階段發(fā)揮限制調(diào)控作用，調(diào)控蛋白質(zhì)合成^[7-9]。近年研究發(fā)現(xiàn)，eIF4E在乳腺癌組織中可能呈高表達(dá)，且其表達(dá)水平與乳腺癌的發(fā)生、浸潤和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)^[10]。目前關(guān)于miR-429在乳腺癌發(fā)生進(jìn)展中的調(diào)控機(jī)制尚不明確。本研究主要驗(yàn)證和探討miR-429與eIF4E在乳腺癌中的靶向關(guān)系及其在乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移中的作用，以求為乳腺癌的早期診斷、治療提供新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑

人正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A、人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231、MDA-MB-468、MCF-7、BT-549以及293T細(xì)胞獲自青島大學(xué)醫(yī)學(xué)部分子生物學(xué)與生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室。DMEM培養(yǎng)基購于武漢普諾賽生命科技有限公司，胰蛋白酶消化液、青/鏈霉素混合液、CCK-8試劑盒、蛋白濃度測定試劑盒購于自北京索萊寶生物科技有限公司，雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒購買于北京全式金生物；轉(zhuǎn)染試劑RNAi購于上海漢恒生物科技有限公司，Trizol Reagent購于美國Invitrogen公司，eIF4E抗體購于英國Abcam公司，GAPDH單克隆抗體購于武漢愛博泰克生物科技有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

將MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-468、BT-549、MCF-10A、293T細(xì)胞置于含體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清和青/鏈霉素溶液的DMEM培養(yǎng)基中（其中青霉素濃度為1 000 U/L，鏈霉素濃度為1 mg/L），于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO₂的細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，傳1～2代且待細(xì)胞融合度達(dá)到80%～90%時(shí)備用。在6孔板中培養(yǎng)MCF-7細(xì)胞，當(dāng)其融合度達(dá)到60%～70%時(shí)，細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染miR-429 mimics（A組）、mimics NC（B組）、inhibitors（C組）以及inhibitors NC（D組）。構(gòu)建eIF4E-野生型（Wt）和eIF4E-突變型（Mut）重組質(zhì)粒，接種239T細(xì)胞于6孔板中，37 ℃下培養(yǎng)，待其融合度約達(dá)40%時(shí)，分別轉(zhuǎn)染eIF4E-3′UTR-Wt+miR-429 mimics（E組）、eIF4E-3′UTR-Wt+mimics NC（F組）、eIF4E-3′UTR-Mut+miR-429 mimics（G組）以及eIF4E-3′UTR-Mut+mimics NC（H組）。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）法和免疫印跡法檢測乳腺癌細(xì)胞MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-468、BT-549以及正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A中eIF4E mRNA、蛋白相對表達(dá)量

使用Trizol試劑提取MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-468、BT-549、MCF-10A細(xì)胞RNA，逆轉(zhuǎn)錄構(gòu)建cDNA，eIF4E mRNA以GAPDH為內(nèi)參照，采用RT-qPCR法檢測各細(xì)胞系eIF4E mRNA的表達(dá)。上機(jī)反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；然后95 ℃變性10 s，60 ℃退火/延伸30 s，共循環(huán)40次。各樣本重復(fù)檢測3次，以2^－△△CT方法計(jì)算eIF4E mRNA相對表達(dá)量。各引物序列見表1。

以RIPA裂解液裂解提取上述細(xì)胞中的蛋白，BCA試劑盒測定蛋白濃度，然后在SDS-PAGE上80 V電泳30 min，轉(zhuǎn)膜，室溫下以50 g/L脫脂奶粉封閉2 h，加入內(nèi)參GAPDH一抗（1∶1 000）、目的基因eIF4E一抗（1∶2 000），4 ℃下過夜，1×TBST洗膜3次，每次10 min；二抗室溫孵育1 h，用1×TBST洗膜3次，每次10 min；ECL發(fā)光液1∶1加到PVDF膜上，室溫放置1 min，采用成像系統(tǒng)顯影、拍照并測量灰度值，以計(jì)算eIF4E蛋白的相對表達(dá)量。eIF4E蛋白相對表達(dá)量=eIF4E蛋白條帶灰度值/內(nèi)參GAPDH蛋白條帶灰度值。

1.4 CCK-8法檢測A～D組細(xì)胞增殖活力

收集轉(zhuǎn)染后各組MCF-7細(xì)胞以2 000個(gè)/孔接種至96孔板，37 ℃常規(guī)培養(yǎng)，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，待細(xì)胞貼壁后轉(zhuǎn)染，第0、24、48、72小時(shí)時(shí)分別向各孔細(xì)胞中加入10 μL CCK8檢測試劑，細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h，酶標(biāo)儀測定波長450 nm處各孔吸光（A）值，以吸光度值反映細(xì)胞的增殖活力。

1.5 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測A～D組細(xì)胞遷移能力

準(zhǔn)備6孔板，用馬克筆在6孔板背后畫橫線，橫線相隔1 cm。將A～D組細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)，待細(xì)胞生長至鋪滿整孔時(shí)，用200 μL槍頭垂直于6孔板背后橫線劃痕，此時(shí)可出現(xiàn)一條無細(xì)胞區(qū)域，用無血清培養(yǎng)基沖洗除去所有被刮下的細(xì)胞及碎片，在6孔板中每孔加入2 mL無血清培養(yǎng)基，拍照顯微鏡在第0、24小時(shí)時(shí)拍攝劃痕愈合的情況，并計(jì)算愈合率。愈合率=（24 h痕跡面積－0 h痕跡面積）/0 h痕跡面積×100%。

1.6 E～H組細(xì)胞雙熒光素酶報(bào)告基因活性檢測

在37 ℃下培養(yǎng)E～H組細(xì)胞48 h，收集各組細(xì)胞并接種于96孔板中。裂解細(xì)胞，離心取上清液備用，使用雙熒光素酶報(bào)告基因試劑盒于多功能酶標(biāo)儀中測定螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的活性值，并計(jì)算相對熒光素酶的活性值。相對熒光素酶的活性值=螢火蟲熒光素酶活性值/海腎熒光素酶活性值。

1.7 RT-qPCR法檢測A～D組細(xì)胞中miR-429、eIF4E mRNA相對表達(dá)量

使用Trizol試劑提取A～D組細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄構(gòu)建cDNA，miR-429以U6為內(nèi)參照，eIF4E mRNA以GAPDH為內(nèi)參照，采用RT-qPCR法檢測各組細(xì)胞miR-429及eIF4E mRNA的表達(dá)。上機(jī)反應(yīng)條件同1.3。各引物序列見表1。

1.8 免疫印跡法測定A～D組MCF-7細(xì)胞eIF4E蛋白相對表達(dá)量

收集A～D組MCF-7細(xì)胞，RIPA裂解液裂解提取蛋白，BCA試劑盒測定蛋白濃度。采用免疫印跡法檢測各組細(xì)胞eIF4E蛋白的表達(dá)量。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 26.0軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以Image J軟件處理圖像。所有實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3次，結(jié)果取均值。各細(xì)胞系中eIF4E mRNA及蛋白均以MCF-10A作為對照，A、C組miR-429、eIF4E mRNA及蛋白以B、D組為對照，將數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理。正態(tài)分布的計(jì)量資料以x?±s表示，兩組比較采用t檢驗(yàn)，多組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，兩組不同時(shí)間比較采用重復(fù)測量設(shè)計(jì)方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各乳腺癌細(xì)胞系及正常乳腺上皮細(xì)胞eIF4E mRNA及蛋白表達(dá)情況

RT-qPCR法檢測結(jié)果顯示，乳腺癌MDA-MB-468、MCF-7、BT549、MDA-MB-231細(xì)胞以及正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A的eIF4E mRNA相對表達(dá)量分別為2.077±0.119、1.443±0.055、1.175±0.064、1.113±0.041、1.000±0.057，各組比較差異有顯著性（F=74.414，P<0.01）。免疫印跡結(jié)果顯示，上述各細(xì)胞系中eIF4E蛋白相對表達(dá)量分別為3.483±0.025、2.675±0.038、2.038±0.019、1.635±0.039、1.000±0.027，各組比較差異有顯著性（F=1 981.243，P<0.01）。

2.2 A～D組細(xì)胞miR-429相對表達(dá)量比較

RT-qPCR結(jié)果顯示，A～D組細(xì)胞miR-429相對表達(dá)量分別為41.565±2.259、1.000±0.048、0.578±0.087、1.000±0.094，各組細(xì)胞miR-429相對表達(dá)量比較差異均具有顯著性（F=647.102，P<0.01）；其中A組較B組細(xì)胞miR-429相對表達(dá)量顯著增高（t=25.390，P<0.01），C組較D組細(xì)胞miR-429的相對表達(dá)量顯著降低（t=－4.652，P<0.05），說明轉(zhuǎn)染成功，可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3 A～D組細(xì)胞增殖活力比較

重復(fù)測量設(shè)計(jì)的方差分析結(jié)果顯示，時(shí)間、組別、時(shí)間與組別交互作用對A、B組MCF-7細(xì)胞增殖活力均具有顯著的影響（F_時(shí)間=1 146.338，F(xiàn)_組別=39.809，F(xiàn)_{時(shí)間*組別}=14.510，P<0.01）。單獨(dú)效應(yīng)分析結(jié)果顯示，A組細(xì)胞第0、24小時(shí)時(shí)的增殖活力相比，B組細(xì)胞第0、24小時(shí)時(shí)的增殖活力相比，差異均有顯著性（F=332.338、827.901，P<0.01）；培養(yǎng)至第24、48、72小時(shí)時(shí)，A組細(xì)胞增殖活力明顯低于B組（F=26.148～40.997，P<0.01）。重復(fù)測量設(shè)計(jì)的方差分析結(jié)果顯示，時(shí)間、組別、時(shí)間與組別交互作用對C、D組MCF-7細(xì)胞增殖活力均具有明顯的影響（F_時(shí)間=682.353，F(xiàn)_組別=32.159，F(xiàn)_{時(shí)間*組別}=4.321，P<0.01）。單獨(dú)效應(yīng)分析結(jié)果顯示，C組細(xì)胞第0、24小時(shí)時(shí)的增殖活力相比，D組細(xì)胞第0、24小時(shí)時(shí)的增殖活力相比，差異均具有顯著性（F=756.132、209.376，P<0.01）；培養(yǎng)至第24、48、72小時(shí)時(shí)，C組細(xì)胞的增殖活力較D組顯著性增強(qiáng)（F=6.410～82.593，P<0.05）。見表2。

2.4 A～D組細(xì)胞遷移能力比較

細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，A～D組的細(xì)胞愈合率分別為16.497±0.419、31.806±0.862、39.293±0.715、31.428±0.656，各組細(xì)胞愈合率比較差異有顯著性（F=392.425，P<0.01）；其中A組細(xì)胞較B組細(xì)胞愈合率明顯降低（t=－22.584，P<0.01）；而C組細(xì)胞較D組細(xì)胞愈合率明顯增高（t=11.464，P<0.01）。見圖1。

2.5 E～H組細(xì)胞雙熒光素酶報(bào)告基因活性檢測

雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測結(jié)果顯示，E～H組細(xì)胞相對熒光素酶活性值分別為0.503±0.008、0.997±0.014、0.995±0.031、0.995±0.011，各組細(xì)胞相對熒光素酶活性比較差異均具有顯著性（F=366.823，P<0.05）；其中E組較F組細(xì)胞相對熒光素酶活性顯著性下調(diào)（t=－42.961，P<0.01），G組與H組細(xì)胞比較相對熒光素酶活性無顯著性變化（P>0.05）。

2.6 A～D組細(xì)胞eIF4E mRNA相對表達(dá)量比較

RT-qPCR法結(jié)果顯示，A～D組細(xì)胞eIF4E mRNA的相對表達(dá)量分別為0.304±0.050、1.000±0.144、1.727±0.328、1.000±0.126，各組細(xì)胞中eIF4E mRNA相對表達(dá)量比較差異有顯著性（F=18.342，P<0.01）；其中A組較B組細(xì)胞eIF4E mRNA的相對表達(dá)量顯著降低（t=－6.363，P<0.05），C組較D組細(xì)胞eIF4E mRNA的相對表達(dá)量顯著升高（t=－2.928，P<0.05）。

2.7 A～D組eIF4E蛋白相對表達(dá)量比較

免疫印跡結(jié)果顯示，A～D組細(xì)胞eIF4E蛋白相對表達(dá)量分別為0.309±0.012、1.000±0.046、1.166±0.058、1.000±0.028，各組細(xì)胞eIF4E蛋白相對表達(dá)量比較差異具有顯著性（F=178.306，P<0.01）；其中A組較B組細(xì)胞eIF4E蛋白相對表達(dá)量顯著降低（t=－20.355，P<0.01），C組較D細(xì)胞eIF4E蛋白的相對表達(dá)量顯著升高（t=3.622，P<0.05）。見圖2。

3 討論

乳腺癌是一種十分常見女性惡性腫瘤，目前其發(fā)病率呈逐年上升趨勢，因此發(fā)現(xiàn)并了解參與乳腺癌發(fā)生發(fā)展的可能基因位點(diǎn)，探討乳腺癌發(fā)生的分子機(jī)制，具有十分重要的意義^[11]。

miRNA通過與目的基因mRNA的3′UTR堿基互補(bǔ)配對結(jié)合，降解或抑制靶基因轉(zhuǎn)錄，從而抑制轉(zhuǎn)錄后蛋白質(zhì)的翻譯，負(fù)性調(diào)節(jié)基因表達(dá)，影響癌細(xì)胞生物學(xué)功能^{[2-3，12]}。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-429在多種腫瘤中存在表達(dá)并發(fā)揮調(diào)控作用。如miR-429在腎細(xì)胞癌^[13]、胰腺導(dǎo)管腺癌^[14]、子宮頸癌^[15]等腫瘤中呈低表達(dá)，可發(fā)揮抑癌基因作用；但在肺癌^[16]、前列腺癌^[17]、子宮內(nèi)膜癌^[18]等腫瘤中呈高表達(dá)，發(fā)揮癌基因作用。目前相關(guān)的研究發(fā)現(xiàn)，miR-429可通過調(diào)控Bcl-2、LRP1、ZEB1/ZEB2等靶基因來參與細(xì)胞增殖^[4]、侵襲及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等過程^[19]。

研究發(fā)現(xiàn)，eIF4E的過表達(dá)在體外可促進(jìn)細(xì)胞的增殖和惡性轉(zhuǎn)化，在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中則可促進(jìn)小鼠腫瘤的形成并增加腫瘤侵襲性^[20]。eIF4E作為正常的翻譯起始因子存在于所有正常細(xì)胞中，但在多種惡性腫瘤中被檢測到其高表達(dá)，因此eIF4E可能作為癌基因在腫瘤發(fā)病中起著重要作用^[21]。eIF4E表達(dá)水平與腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)，elF4E表達(dá)升高時(shí)可以促進(jìn)一部分eIF4E敏感性的基因（如c-Myc^[22]、VEGF^[23]以及MMP-9等）的出核和翻譯啟動(dòng)，進(jìn)而促進(jìn)癌基因表達(dá)。eIF4E蛋白磷酸化在eIF4E致癌機(jī)制中起決定性的作用^[6]，eIF4E的磷酸化水平在多種腫瘤中升高并與腫瘤進(jìn)展和預(yù)后相關(guān)。研究證實(shí)，磷酸化的eIF4E可以使腫瘤細(xì)胞獲得最大的侵襲和轉(zhuǎn)移潛能^[24-25]，轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞中磷酸化eIF4E水平遠(yuǎn)高于非侵襲性或非轉(zhuǎn)移性細(xì)胞^[26]。miR-429是否參與調(diào)控eIF4E磷酸化過程以及是否能夠調(diào)控磷酸化eIF4E蛋白參與腫瘤細(xì)胞惡性行為，有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證和探討。

本研究采用生物信息學(xué)方法預(yù)測miR-429與eIF4E靶向關(guān)系，結(jié)果顯示eIF4E基因3′UTR與miR-429存在互補(bǔ)配對的結(jié)合位點(diǎn)；E組細(xì)胞較F組細(xì)胞相對熒光素酶活性顯著下調(diào)，雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)表明miR-429與eIF4E間存在結(jié)合作用；A組細(xì)胞較B組細(xì)胞miR-429表達(dá)水平增高，細(xì)胞增殖及遷移能力被顯著抑制，eIF4E mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著降低；而C組細(xì)胞較D組細(xì)胞miR-429表達(dá)被抑制，細(xì)胞增殖、遷移能力明顯增強(qiáng)，eIF4E mRNA和蛋白表達(dá)水平升高。故而證明miR-429通過靶向eIF4E調(diào)控乳腺癌的增殖、遷移能力，從而抑制乳腺癌的發(fā)生發(fā)展。miR-429與eIF4E基因3′UTR互補(bǔ)結(jié)合以實(shí)現(xiàn)調(diào)控作用，調(diào)控機(jī)制可能為miR-429抑制或降解eIF4E mRNA，進(jìn)而抑制翻譯產(chǎn)生eIF4E蛋白，最終減少翻譯起始復(fù)合物的形成，影響基因5′UTR解旋，減少其他相關(guān)癌蛋白的合成。

綜上所述，miR-429可通過靶向調(diào)控eIF4E抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖和遷移，從而抑制乳腺癌發(fā)生進(jìn)展。生物信息學(xué)預(yù)測發(fā)現(xiàn)miR-429參與調(diào)控多個(gè)靶基因以及信號通路，其調(diào)控更多靶基因的機(jī)制以及eIF4E促癌的機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

作者聲明：牛婷婷、侯琳、吳琍參與了研究設(shè)計(jì)；牛婷婷、吳琍、仇碧茹、趙曉暉、李全洋參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發(fā)表該論文，且均聲明不存在利益沖突。

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（本文編輯 范睿心 厲建強(qiáng)）