韓雨薇 王晨辰 梁國(guó)標(biāo) 李曉明

【摘要】 目的 探討伊馬替尼對(duì)大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血（SAH）后早期腦損傷（EBI）的影響及其可能的作用機(jī)制。方法 采用頸內(nèi)動(dòng)脈穿刺法構(gòu)建SAH模型，Sprague-Dawley雄性大鼠分為假手術(shù)組、模型組和伊馬替尼給藥組。SAH模型制作30 min后，腹腔注射一次給予伊馬替尼50 mg/kg。24 h后對(duì)出血情況，神經(jīng)功能評(píng)分，平衡木評(píng)分，腦水腫和伊文思藍(lán)滲出進(jìn)行考察；Western blot考察過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ），Toll樣受體4（TLR4），白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）和腫瘤壞死因子α（TNF-α）的表達(dá)量；TUNEL染色考察凋亡的情況。結(jié)果 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明伊馬替尼能夠顯著減輕SAH后的神經(jīng)損傷和腦損傷。在SAH大鼠模型中，伊馬替尼給藥顯著增加PPARγ表達(dá)，抑制TLR4及炎癥因子TNF-α，IL-1β的表達(dá)從而抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生。結(jié)論 伊馬替尼能夠激活PPARγ，從而抑制炎癥反應(yīng)減輕SAH后的EBI。

【關(guān)鍵詞】 伊馬替尼；蛛網(wǎng)膜下腔出血；PPARγ；炎癥

【中圖分類(lèi)號(hào)】 R965;R651 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A 【文章編號(hào)】 1672-7770（2023）01-0057-05

Abstract： Objective To explore the effect of imatinib on early brain injury（EBI） after subarachnoid hemorrhage（SAH） in rats. Methods The SAH model was established by internal carotid artery puncture. Sprague-Dawley male rats were divided into sham operation group， model group and imatinib administration group. After the SAH model was made for 30 minutes 50 mg/kg of imatinib was given by intraperitoneal injection. After 24 hours， hemorrhage， neurological function score， balance beam score， cerebral edema and Evans blue exudation were investigated. Western blot examined the peroxisome proliferator activated receptors γ（PPARγ）， toll-like receptor 4（TLR4）， interleukin-1 beta（IL-1β） and tumor necrosis factor（TNF-α）. TUNEL staining was used to investigate apoptosis. Results The results showed that imatinib can significantly reduce nerve injury and brain injury after SAH. In the SAH rat model， imatinib administration significantly increased the expression of PPARγ and inhibited the expressions of TLR4 and inflammatory factors TNF-α and IL-1β， thereby inhibiting the occurrence of apoptosis. Conclusion Imatinib can activate PPARγ to inhibit inflammatory reaction and alleviate EBI after SAH.

Key words： imatinib; subarachnoid hemorrhage; PPARγ; inflammation

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81971133）；沈陽(yáng)市科技計(jì)劃項(xiàng)目（20-205-4-098）；中國(guó)博士后面上基金（2020M673679）

作者單位：110016 沈陽(yáng)，北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院神經(jīng)外科

通信作者：李曉明

蛛網(wǎng)膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage，SAH）是一種病死率高、致殘率高的危重疾病，并且SAH患者的預(yù)后很差［1-2］。早期腦損傷（early brain injury，EBI）被認(rèn)為是SAH患者預(yù)后不良的主要原因之一。在EBI過(guò)程中，動(dòng)脈瘤破裂可導(dǎo)致顱內(nèi)壓升高、腦血流量減少和全腦缺血，這些生理變化導(dǎo)致血腦屏障破壞、神經(jīng)炎癥、氧化反應(yīng)和隨后的細(xì)胞死亡［3］。其中，炎癥和細(xì)胞凋亡被認(rèn)為是SAH后EBI的主要原因［4］。

過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）屬于核激素受體超家族，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮抗炎作用［5］。已有報(bào)道表明，PPARγ在調(diào)節(jié)炎癥和免疫反應(yīng)以及保護(hù)細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激方面具有重要作用［5-7］。PPAR-γ激動(dòng)劑在中風(fēng)、阿爾茨海默病、感染、脊髓損傷和創(chuàng)傷性腦損傷等神經(jīng)炎癥性疾病中的治療潛力受到特別關(guān)注［8-12］。 PPARγ激活劑伊馬替尼（imatinib），一種被批準(zhǔn)用于治療慢性粒細(xì)胞白血病和其他惡性腫瘤的抗腫瘤藥物［13］。有報(bào)道稱(chēng)，PPARγ激活劑伊馬替尼抑制Tenascin-C表達(dá)預(yù)防大鼠SAH后腦血管痙攣［14］，但伊馬替尼在SAH后EBI中仍未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究將討論P(yáng)PARγ激動(dòng)劑伊馬替尼是否對(duì)大鼠SAH后的EBI有保護(hù)作用。此外，本研究將討論伊馬替尼可能的保護(hù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 伊馬替尼（北京諾華公司），二甲基亞砜（DMSO，美國(guó)Sigma公司），PPARγ，NF-κB，IL-β，TNF-α（美國(guó)Cell Signaling Technology公司），TLR4，β-actin（美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司），BCA蛋白定量試劑盒，蛋白酶磷酸酶抑制劑，RIPA裂解液，SDS-PAGE凝膠配制試劑盒，ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒，5×loading buffer（碧云天生物技術(shù)公司）。IL-β和TNF-α ELISA試劑盒（南京建成生物技術(shù)有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組給藥 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物符合美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院于1996年出版的《National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals》。Sprague Dawley雄性大鼠，8周，購(gòu)自北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（中國(guó)沈陽(yáng)），實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)0005095。恒溫，給予充足食物和水。大鼠隨機(jī)分為3組，每組30只：假手術(shù)組（Sham），模型組（SAH），模型+伊馬替尼（imatinib）。SAH模型制作30 min后，腹腔注射給予伊馬替尼50 mg/kg［14］。

1.3 模型制作 每只動(dòng)物腹腔注射戊巴比妥鈉40 mg/kg麻醉。從頸外動(dòng)脈殘端向左側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈插入一條銳化的4-0單絲尼龍線，穿透左側(cè)大腦前動(dòng)脈和大腦中動(dòng)脈的分叉處。假手術(shù)大鼠接受相同的手術(shù)，只是在沒(méi)有穿刺的情況下拔除縫線。

1.4 SAH嚴(yán)重程度評(píng)分 如前所述，將基底池分為6個(gè)節(jié)段，根據(jù)蛛網(wǎng)膜下腔出血量將每個(gè)節(jié)段劃分為0～3級(jí)。通過(guò)將分?jǐn)?shù)相加，得到的總分從0～18不等［15］。

1.5 神經(jīng)功能評(píng)分 采用兩種方法對(duì)神經(jīng)功能缺損進(jìn)行盲法評(píng)估。評(píng)估由六個(gè)測(cè)試組成，分?jǐn)?shù)可以是0～3或1～3。這六項(xiàng)測(cè)試包括：自發(fā)活動(dòng)，0分：不活動(dòng)；1分：僅可移動(dòng)；2分：能觸壁，不到3面；3分：自由運(yùn)動(dòng)，觸到籠子至少3面；四肢運(yùn)動(dòng)的對(duì)稱(chēng)性，0分：肢體不能運(yùn)動(dòng)；1分：肢體極度無(wú)力，僅有輕微活動(dòng)；2分：肢體無(wú)力，運(yùn)動(dòng)遲緩；3分：四肢對(duì)稱(chēng)，與正常無(wú)差異；前爪伸展，0分：無(wú)動(dòng)作；1分：僅有輕度伸展；2分：較正常差；3分：同SAH前；攀登，1分：不能攀爬，滾下；2分：攀爬困難；3分：爬行容易，抓籠有力；身體本體感覺(jué)，1分：無(wú)反應(yīng)；2分：僅有輕微反應(yīng)；3分：迅速轉(zhuǎn)頭，對(duì)側(cè)對(duì)稱(chēng)；對(duì)胡須刺激的反應(yīng)，1分：無(wú)反應(yīng)；2分：輕微反應(yīng)；3分：雙側(cè)對(duì)稱(chēng)反應(yīng)。最高分為18分，最低分為3分。分?jǐn)?shù)越高，功能越強(qiáng)［15］。平衡木測(cè)試研究了動(dòng)物在狹窄的木梁（2.25）上行走60秒的能力：四分，行走≥20 cm；三分，20 cm≥行走≥10 cm；兩分，行走≥10 cm但墜落；一分，行走10 cm；零分，行走10 cm以內(nèi)墜落。計(jì)算5分鐘內(nèi)連續(xù)三次試驗(yàn)的最高得分［16］。分?jǐn)?shù)越高，表明這兩種方法的功能都更強(qiáng)。

1.6 腦水含量 腦水含量通過(guò)濕重/干重方法進(jìn)行評(píng)估［17］。迅速收集大腦并將其分為左右半球及小腦。所有樣品立即稱(chēng)量以獲得濕重，并在105 ℃下脫水72 h后再次稱(chēng)重以獲得干重。計(jì)算每個(gè)標(biāo)本的腦含水量為（濕重-干重）/濕重×100%。

1.7 伊文思藍(lán)檢測(cè) 通過(guò)伊文思藍(lán)外滲試驗(yàn)評(píng)估血腦屏障的血腦屏障滲透性［18］。在SAH后23 h，麻醉大鼠左側(cè)股靜脈注射伊文思藍(lán)染料（2%；5 mL/kg）。取腦左右半球及小腦。稱(chēng)重后浸泡在甲酰胺中（10 mL/g），60 ℃孵育，用分光光度計(jì)測(cè)量滲出物在620 nm處的吸光度。

1.8 Western blot檢測(cè) 腦組織用RIPA裂解液裂解提取蛋白，并用BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。等量的蛋白質(zhì)（60 μg）在SDS-聚丙烯胺上電泳并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%BSA封閉，然后與一抗在4 ℃下孵育過(guò)夜PPARγ（1∶400），TLR4（1∶200），NF-κB（1∶400），β-actin（1∶200）。在室溫下與對(duì)應(yīng)的二抗兔抗和鼠抗孵育1 h，用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒顯影，并用Image J定量分析。

1.9 TUNEL染色 在SAH后24 h將大鼠深度麻醉，并向心內(nèi)灌注60 mL冰冷的PBS和60 mL 10％的多聚甲醛。收集全腦，然后在10％多聚甲醛中固定24 h，然后在30％蔗糖溶液中固定72 h。在-80 ℃下冷凍后，將大腦切成4 μm厚的冠狀切片。將腦切片PBS洗3次每次10 min，含0.3%TritonX-100的5%BSA封閉1 h。加入對(duì)應(yīng)的TUNEL檢測(cè)液37 ℃避光孵育1 h。抗體熒光顯微鏡（尼康）拍照。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)以Mean±S.E.M.表示，使用SPSS 19.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，然后進(jìn)行Tukey檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較。以P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 伊馬替尼對(duì)SAH評(píng)分和神經(jīng)功能評(píng)分的影響SAH 24 h后，對(duì)SAH出血程度進(jìn)行評(píng)分。評(píng)分結(jié)果顯示，模型組評(píng)分顯著增加出血嚴(yán)重，伊馬替尼給藥后能夠明顯減輕SAH的出血情況，降低SAH評(píng)分（圖1B）。與假手術(shù)組相比，SAH后神經(jīng)功能評(píng)分和平衡木評(píng)分明顯受損，而伊馬替尼給藥可顯著改善SAH后神經(jīng)學(xué)評(píng)分（圖1C-D）。

2.2 伊馬替尼對(duì)SAH后腦水腫和血腦屏障的影響與假手術(shù)組相比，SAH后腦含水量增加，伊馬替尼能夠降低腦含水量（圖2A）。為了評(píng)估血腦屏障的完整性，靜脈注射伊文思藍(lán)，并對(duì)滲出量進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明伊馬替尼能夠降低SAH后伊文思藍(lán)的滲出量（圖2B），改善血腦屏障。

2.3 伊馬替尼對(duì)SAH后PPARγ和TLR4表達(dá)量的影響 Western blot結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，SAH后PPARγ表達(dá)量無(wú)顯著變化，而伊馬替尼給藥能夠顯著增加PPARγ的表達(dá)（P<0.05）。SAH后TLR4表達(dá)顯著上調(diào)，而伊馬替尼給藥能夠降低TLR4的表達(dá)量。

2.4 伊馬替尼對(duì)SAH后炎癥因子TNF-α和IL-1β的表達(dá)影響 本研究采用Western blot和ELISA方法檢測(cè)炎癥因子TNF-α和IL-1β的表達(dá)情況，Western blot和ELISA均顯示SAH后，炎癥因子TNF-α和IL-1β的表達(dá)量增加，而伊馬替尼給藥能夠抑制SAH誘導(dǎo)的TNF-α和IL-1β的表達(dá)（圖4）。

2.5 伊馬替尼對(duì)SAH后細(xì)胞凋亡的影響 本研究利用TUNEL染色考察了伊馬替尼對(duì)SAH后細(xì)胞凋亡的影響。SAH后TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目增加，伊 馬替尼給藥減少了TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目，抑制了細(xì)胞凋亡的發(fā)生（圖5）。

3 討 論

伊馬替尼是一種被批準(zhǔn)用于治療慢性粒細(xì)胞白血病和其他惡性腫瘤的抗腫瘤藥物［13］。它抑制幾種酪氨酸激酶，包括PDGFR-α，并且已經(jīng)被證明可以減輕缺血性中風(fēng)和纖溶酶原激活劑治療后的腦水腫［19］。此外，伊馬替尼聯(lián)合抑制PDGFR-α在腦出血小鼠模型中改善了血腦屏障的完整性［20］。然而，伊馬替尼在SAH中的作用及作用機(jī)制尚未闡明。因此，本研究將討論伊馬替尼在SAH中的作用以及其可能的作用機(jī)制。

本研究中，為了檢測(cè)伊馬替尼對(duì)SAH后EBI的影響，對(duì)神經(jīng)功能評(píng)分、腦水腫和伊文思藍(lán)滲出率進(jìn)行考察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，伊馬替尼給藥能夠顯著改善腦含水量和血腦屏障功能，并且提高神經(jīng)功能評(píng)分。說(shuō)明伊馬替尼對(duì)SAH后EBI具有保護(hù)作用。另外，為了檢測(cè)伊馬替尼保護(hù)SAH后EBI的作用機(jī)制，本研究對(duì)PPARγ、TLR4、TNF-α和IL-1β的表達(dá)進(jìn)行了考察。觀察到伊馬替尼給藥后PPARγ表達(dá)增加，TLR4表達(dá)減少，抑制炎癥因子TNF-α和IL-1β的表達(dá)。此外，采用了ELISA方法檢測(cè)了TNF-α和IL-1β的表達(dá)量，伊馬替尼抑制炎癥因子TNF-α和IL-1β的表達(dá)。為了進(jìn)一步闡明伊馬替尼對(duì)SAH后細(xì)胞凋亡的影響，進(jìn)行了TUNEL染色。染色結(jié)果說(shuō)明，伊馬替尼能夠抑制SAH后的細(xì)胞凋亡。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PPARγ激活對(duì)SAH后EBI具有保護(hù)作用，伊馬替尼可能通過(guò)上調(diào)PPARγ減少TLR4的表達(dá)從而抑制炎癥反應(yīng)發(fā)揮抗凋亡作用。

目前的研究有幾個(gè)局限性。首先，沒(méi)有考察SAH后72 h的腦水腫和神經(jīng)功能缺損情況，這個(gè)時(shí)間點(diǎn)的變化情況有待被研究。其次，SAH后的血腦屏障通透性和腦水腫程度可以用更具創(chuàng)新性的方法來(lái)評(píng)估，例如磁共振成像。

綜上所述，伊馬替尼通過(guò)激活PPARγ減少TLR4的表達(dá)抑制SAH后炎癥和凋亡的發(fā)生，維持血腦屏障的完整性。雖然伊馬替尼保護(hù)SAH后EBI的作用機(jī)制仍需進(jìn)一步闡明，但本研究認(rèn)為靶向PPARγ可能是改善SAH后EBI的關(guān)鍵策略。

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（收稿2021-07-15 修回2022-02-26）