韓文龍，鄭 聰，曹可心，張路陽，徐曉雯，謝 可，祖瓊瑤，徐世曉

（1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 煙草學(xué)院，河南 鄭州 450002；2.福建南平煙草公司，福建 南平 353000；3.河南省煙草公司許昌市公司，河南 許昌 461000）

煙草（Nicotiana tomentosiformisL.）腺毛是存在于煙草葉片上的一種特殊的多細(xì)胞結(jié)構(gòu)，能夠合成和分泌煙草重要的香氣物質(zhì)，對煙草的抗逆性和質(zhì)量具有非常重要的作用[1]。煙草葉片的腺毛包括長柄腺毛、短柄腺毛以及保護(hù)毛[2]。其中，長柄腺毛和短柄腺毛合成煙草重要的致香物質(zhì)西柏三烯二醇[3]。研究表明，煙草腺毛密度與煙草葉片中α-和β-西柏三烯二醇的含量呈正相關(guān)[4]。因此，通過調(diào)控?zé)煵菹倜l(fā)育有助于提高和改善煙葉香氣。

煙草腺毛的發(fā)育受多個(gè)基因調(diào)控，WANG 等[5]研究發(fā)現(xiàn)，敲除煙草NtCycB2（Cyclin B2）基因促進(jìn)煙草長柄腺毛的形成，過表達(dá)NtCycB2基因抑制煙草長柄腺毛的生成；劉一華[6]研究發(fā)現(xiàn)，NtGIS（Glabeous inflorescence stems）基因過表達(dá)株系腺毛密度高于野生型（Wild type，WT），NtGIS基因干擾株系腺毛密度顯著低于WT；崔麗鵬[7]研究發(fā)現(xiàn)，NtJAZ3（Jasmonate-zim-domain protein 3）基因負(fù)調(diào)控?zé)煵荻嗉?xì)胞腺毛的發(fā)育。另外，煙草腺毛的發(fā)育也受植物激素的調(diào)控[8-12]。婁亞楠等[10]和馮琦等[11]研究發(fā)現(xiàn)，外施茉莉酸甲酯可以提高煙草葉片腺毛密度；賀凌霄等[12]研究發(fā)現(xiàn)，外施赤霉素（GA3）可以提高煙草葉片腺毛的長度和密度。

NtCPS2基因是賴柏當(dāng)類物質(zhì)順-冷杉醇（Cisabieion）的關(guān)鍵合成基因，在煙草腺毛中特異性表達(dá)[13]。賀凌霄等[14]研究發(fā)現(xiàn)，NtCPS2基因編輯后代GA3合成相關(guān)基因表達(dá)量提高，GA3含量增加。順-冷杉醇和GA3都是煙草重要的二萜類物質(zhì)[15]，兩者的代謝途徑存在共同的合成底物香葉基香葉基焦磷 酸（Geranylgeranyl-PP，GGPP）[16]。目 前，關(guān) 于NtCPS2基因的研究多集中于其對順-冷杉醇合成途徑的影響方面，而NtCPS2基因與煙草腺毛發(fā)育及其分泌物合成的關(guān)系尚不明確。為此，以編輯NtCPS2基因的8306 純合編輯系（KD）和WT 為材料[17]，分別將KD 與WT 放置在正常生長條件下以及外施GA3和矮壯素處理的生長條件下，比較KD 和WT的葉片腺毛密度、西柏三烯二醇含量、GA3含量以及相關(guān)調(diào)控基因表達(dá)量的差異，以期明確NtCPS2基因?qū)煵菹倜l(fā)育及西柏三烯二醇合成的影響，為調(diào)控?zé)煵菹倜l(fā)育和香氣物質(zhì)的合成提供新思路。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為煙草8306 野生型WT 和純合編輯系KD。其中，KD 是在分析8306NtCPS2基因CDS（編碼區(qū)序列）和基因組序列的基礎(chǔ)上，在第2 外顯子區(qū)域設(shè)計(jì)了2 個(gè)gRNA 靶位點(diǎn)序列，構(gòu)建RNA 載體，經(jīng)過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化得到的在靶位點(diǎn)上成功發(fā)生突變[17]的第二代純合編輯系。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選用飽滿的8306 WT 和KD 種子，用1%KMnO4溶液浸泡消毒30 min 后，用蒸餾水洗凈煙草種子表面的KMnO4溶液并播種于方形培養(yǎng)皿中，待種子發(fā)芽后移栽至裝滿基質(zhì)（pH 值5.5～7.0、腐植酸含量≥5.0%、有機(jī)質(zhì)含量≥25.0%）的黑色方形培養(yǎng)盆（高10 cm、直徑8 cm）中。然后放入28 ℃恒溫光照培養(yǎng)箱（12 h 光照/12 h 黑暗、濕度60%）中培養(yǎng)，待煙苗四葉一心時(shí)分別噴施0.025 mmol/L GA3及矮壯素（A），對照（CK）噴施蒸餾水。

1.3 測定指標(biāo)及方法

1.3.1 腺毛形態(tài)和密度 在噴施后30 d 時(shí)，各處理均選取3 株長勢均勻的煙株，取生長狀態(tài)相近的中部葉片3 片，用2 g/L 羅丹明B 溶液進(jìn)行染色處理，染色后用VHX-600V 超景深顯微鏡（日本基恩士公司）觀察煙草葉片腺毛形態(tài)，并統(tǒng)計(jì)腺毛密度，每個(gè)葉片統(tǒng)計(jì)3個(gè)視野的腺毛密度。

1.3.2 西柏三烯二醇和順-冷杉醇含量 在噴施后20 d時(shí)，各處理均選取5株長勢均勻的煙株，取中間部位葉片5 片，保證葉片面積一致，去除葉片主脈，置于500 mL 的二氯甲烷溶液中進(jìn)行浸提。收集浸提液后加入內(nèi)標(biāo)物質(zhì)（1 mL正-17-烷醇），用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)濃縮至50 mL 后進(jìn)行衍生化反應(yīng)，用GCMS 檢測法進(jìn)行分析并定性，最后根據(jù)內(nèi)標(biāo)物質(zhì)含量進(jìn)行西柏三烯二醇和順-冷杉醇含量的定量分析。

1.3.3 GA3含量 在噴施后20 d 時(shí)，各處理均選取長勢均勻的WT和KD中間部位葉片混樣0.5 g，迅速用液氮冷凍后，放置于-80 ℃超低溫冰箱中保存待測，隨后采用間接酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）[18]進(jìn)行GA3含量測定。

1.3.4 GGPP 含量 在噴施后20 d 時(shí)，各處理均選取長勢均勻的WT和KD中間部位葉片混樣0.5 g，迅速用液氮冷凍后，放置于-80 ℃超低溫冰箱中保存，隨后采用間接酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）[18]進(jìn)行GGPP含量測定。

1.3.5 基因表達(dá)量 在噴施后20 d 時(shí)，各處理均選取長勢均勻的WT和KD中間部位葉片混樣0.1 g，采用總RNA 提取試劑盒（索萊寶生物公司）提取樣品葉片中總RNA，放置于-80 ℃超低溫冰箱中保存。利用PCR 儀將待測RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，儲存在-20 ℃冰箱中備用。

對赤霉素合成基因CPS（Ent-copalyl diphosphate synthase）、GA20ox（GA20-oxidase），順-冷杉醇合成基因NtCPS2，GGPP 合成基因DXR（1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase），西柏三烯二醇合成基因CYC（Cembratrien-ol synthetase）、CYP71D16，腺毛負(fù)調(diào)控基因NtCycB2進(jìn)行表達(dá)量分析，引物序列（表1）采用Roche LCPDS2軟件設(shè)計(jì)，并由上海捷瑞生物工程有限公司合成。實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）擴(kuò)增采用諾唯贊生物公司的TaqPro Universal SYBR qPCR Master Mix。20 μL 體系：2×TaqPro Universal SYBR qPCR Master Mix 10 μL，cDNA 0.4 μL，水8.8 μL，10 μmol/L正、反向引物各0.4 μL。qRT-PCR 程序：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃10 s、60 ℃30 s，40 個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法對基因表達(dá)量進(jìn)行計(jì)算。

表1 熒光定量PCR引物序列Tab.1 Sequences of primers for fluorescence quantitative PCR

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2016 軟件進(jìn)行計(jì)算和作圖，使用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理WT和KD中順-冷杉醇含量及其關(guān)鍵合成基因NtCPS2表達(dá)量分析

由圖1 可知，在CK 組中KD 順-冷杉醇含量及NtCPS2基因相對表達(dá)量均顯著低于WT，說明在編輯NtCPS2基因后順-冷杉醇含量顯著降低。外施GA3后，WT的順-冷杉醇含量和NtCPS2基因相對表達(dá)量均顯著降低；外施矮壯素后，KD 和WT的順-冷杉醇含量和NtCPS2基因相對表達(dá)量總體上均顯著升高。說明GA3代謝途徑和順-冷杉醇生物合成之間存在一定的聯(lián)系。

圖1 不同處理KD和WT中順-冷杉醇含量（A）及其關(guān)鍵合成基因NtCPS2相對表達(dá)量（B）Fig.1 The content of cis-abieion（A）and relative expression level of its key synthetic gene NtCPS2（B）in KD and WT under different treatments

2.2 不同處理WT和KD中GA3含量及其關(guān)鍵合成基因表達(dá)量分析

由圖2A 可知，對于CK，與WT 相比，KD 中GA3含量升高25%；外施GA3后，KD 和WT 中GA3含量均顯著增加，平均升高50%；外施矮壯素后，KD 和WT中GA3含量均顯著降低，平均降低25%。由圖2B—C可知，對于CK，KD中GA3關(guān)鍵合成基因CPS、GA20ox相對表達(dá)量均顯著高于WT；外施GA3后，KD 和WT 中GA3關(guān)鍵合成基因CPS、GA20ox相對表達(dá)量均顯著升高；外施矮壯素后，KD 和WT 中GA3關(guān)鍵合成基因CPS、GA20ox相對表達(dá)量均顯著降低。整體上KD升高和下降的幅度大于WT。

2.3 不同處理WT和KD葉面腺毛形態(tài)和密度及其關(guān)鍵合成基因表達(dá)量分析

由圖3A—B 可知，對于CK，KD 的葉片腺毛密度和長度均高于WT，平均升高28%，說明編輯NtCPS2基因后煙草葉片腺毛密度和長度增加；外施GA3后，KD 和WT 腺毛密度均顯著增加，平均增加50%；外施矮壯素后，KD 和WT 腺毛密度均顯著減少，平均減少56%。說明內(nèi)源GA3含量的變化影響煙草葉片腺毛發(fā)育。圖3C 表明，對于CK，編輯NtCPS2基因后KD 的NtCycB2基因相對表達(dá)量顯著低于WT；外施GA3后，KD 和WT 的NtCycB2基因相對表達(dá)量均顯著下降，KD 下降幅度大于WT；外施矮壯素后，KD 和WT 的NtCycB2基因相對表達(dá)量均顯著升高，KD 升高幅度大于WT。此結(jié)果與葉片腺毛密度變化結(jié)果基本一致。

圖3 不同處理KD和WT葉片腺毛形態(tài)（A）、密度（B）及其負(fù)調(diào)控基因NtCycB2相對表達(dá)量（C）Fig.3 The morphology（A）and number（B）of glandular hairs and the relative expression level of its negative regulator gene NtCycB2（C）in KD and WT under different treatments

2.4 不同處理WT和KD葉片腺毛西柏三烯二醇含量及其合成基因的表達(dá)量分析

圖4A 表明，對于CK，KD 的葉片腺毛西柏三烯二醇含量高于WT，提高約25%，說明編輯NtCPS2基因提高了煙草葉片腺毛西柏三烯二醇分泌物含量；外施GA3后，KD 和WT 西柏三烯二醇含量均顯著增加，平均增加50%；外施矮壯素后，KD 和WT 西柏三烯二醇含量均顯著減少，平均減少46%。說明內(nèi)源GA3含量的變化不僅影響煙草葉片腺毛發(fā)育，而且提高了煙草葉片西柏三烯二醇的分泌量。圖4B—C 表明，對于CK，編輯NtCPS2基因后KD 的CYC和CYP71D16基因相對表達(dá)量均高于WT；外施GA3后，KD 和WT 的CYC和CYP71D16基因相對表達(dá)量均顯著升高；外施矮壯素后，KD 和WT 的CYC和CYP71D16基因相對表達(dá)量均顯著降低。整體上KD 升高和下降的幅度大于WT，這與西柏三烯二醇含量變化結(jié)果一致。

圖4 不同處理WT和KD西柏三烯二醇含量（A）及其合成基因CYC（B）和CYP71D16（C）相對表達(dá)量Fig.4 The content of cembranoids（A）and relative expression level of its synthetic genes CYC（B）and CYP71D16（C）in WT and KD under different treatments

2.5 不同處理WT和KD中GGPP含量及其關(guān)鍵合成基因DXR表達(dá)量分析

由圖5 可知，對于CK，KD 的GGPP 含量以及其關(guān)鍵合成基因DXR相對表達(dá)量均高于WT；外施GA3后，KD 和WT 的GGPP 含量和DXR基因相對表達(dá)量均顯著升高；外施矮壯素后，KD 和WT的GGPP含量以及DXR基因相對表達(dá)量均顯著下降。KD 的GGPP 含量以及DXR基因相對表達(dá)量升高或降低的幅度大于WT。

圖5 不同處理WT和KD的GGPP含量（A）及其關(guān)鍵合成基因DXR相對表達(dá)量（B）Fig.5 GGPP content（A）and relative expression level of its key synthetic gene DXR（B）in WT and KD under different treatments

3 結(jié)論與討論

本研究結(jié)果表明，與WT 相比，KD 的內(nèi)源GA3含量升高。GA3和順-冷杉醇生物合成途徑存在共同底物GGPP，GGPP 在CPS 合酶的催化下參與GA3生物合成途徑[19]，在CPS2 合酶的催化下參與順-冷杉醇合成途徑[20]。NtCPS2基因編碼CPS2，在編輯NtCPS2基因后，NtCPS2基因表達(dá)量下降，CPS2 活性降低，一方面減少了CPS2 對底物GGPP 的競爭，另一方面順-冷杉醇合成途徑受阻，間接導(dǎo)致底物GGPP 含量升高，更多的GGPP 參與GA3生物合成途徑，內(nèi)源GA3含量升高，這與賀凌霄等[14]的研究結(jié)果一致。

本研究結(jié)果表明，與WT 相比，KD 葉片腺毛密度增加，葉片腺毛分泌物西柏三烯二醇含量增加，同時(shí)KD 內(nèi)源GA3含量升高，推測編輯NtCPS2基因影響了內(nèi)源GA3的生物合成，進(jìn)而影響了煙草腺毛的發(fā)育。因此，對KD 和WT 外施GA3和矮壯素，結(jié)果表明，與CK 相比，外施GA3后，KD 和WT 的內(nèi)源GA3含量顯著增加，葉片腺毛密度顯著增加，NtCycB2基因表達(dá)量顯著降低；外施矮壯素后，KD和WT 的內(nèi)源GA3含量降低，葉片腺毛密度減少，NtCycB2基因表達(dá)量顯著升高。說明內(nèi)源GA3含量是影響煙草腺毛發(fā)育的因素之一。研究表明，GA3對擬南芥腺毛的生長和發(fā)育有重要的作用[21]。周忠靜[22]研究發(fā)現(xiàn)，GA3的合成和運(yùn)輸對擬南芥腺毛的發(fā)育具有重要的調(diào)控作用。GA3信號傳導(dǎo)影響腺毛生長相關(guān)關(guān)鍵基因的啟動，研究表明，GL1（Glabrous 1）和TTG（Transparent testa glabra）基因是調(diào)控腺毛發(fā)育的2 個(gè)關(guān)鍵基因，其中GL1 蛋白序列與受GA3調(diào) 控 的 Myb（V-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog）家族轉(zhuǎn)錄因子同源，TTG基因?qū)ο倜l(fā)育的調(diào)控作用可被與GA 信號傳導(dǎo)有關(guān)的R（R1R2R3）基因所代替[23-26]，煙草腺毛的發(fā)育調(diào)控機(jī)制與擬南芥存在一定的相似性，本研究發(fā)現(xiàn)，NtCPS2基因通過調(diào)控內(nèi)源GA3的生物合成和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)而影響煙草腺毛發(fā)育。劉一華[6]的研究結(jié)果表明，在煙草中外施GA3導(dǎo)致煙草葉片腺毛密度顯著增加，而用VIGS 技術(shù)干擾GA3生物合成基因GA20ox后，干擾材料內(nèi)源GA3含量降低，葉片腺毛密度顯著降低，這與本研究結(jié)果一致。WANG 等[5]研究發(fā)現(xiàn)，煙草NtCycB2基因負(fù)調(diào)控?zé)煵菹倜l(fā)育，過表達(dá)NtCycB2基因，煙草葉片腺毛密度降低，沉默NtCycB2基因，煙草葉片腺毛密度升高，這與本研究結(jié)果一致。

本研究發(fā)現(xiàn)，與WT 相比，KD 葉片腺毛分泌物西柏三烯二醇含量顯著升高。西柏三烯二醇是煙草重要的香氣物質(zhì)，其主要由煙草葉片腺毛合成和分泌，一方面KD 葉片腺毛密度增加，西柏三烯二醇含量升高；另一方面，編輯NtCPS2基因后，西柏三烯二醇關(guān)鍵合成基因CYC、CYP71D16表達(dá)量升高，西柏三烯二醇含量增加。研究發(fā)現(xiàn)，煙葉表面腺毛密度與葉片腺毛分泌物含量呈正相關(guān)[27]。煙株內(nèi)GA3含量升高，有助于煙草葉片腺毛分泌物西柏三烯醇的積累[28]。外施GA3提高了煙草葉片腺毛密度，外施矮壯素減少了葉片腺毛的密度[12]。此外，GA3也是二帖類化合物的一種[29]，其與西柏三烯二醇具有共同底物GGPP，外施GA3提高了煙株內(nèi)源GA3含量，進(jìn)而節(jié)省了底物GGPP 在GA3合成途徑中的消耗，提高了GGPP 含量，進(jìn)而提高了西柏三烯二醇合成關(guān)鍵基因CYC、CYP71D16的表達(dá)量，西柏三烯二醇含量增加。外施矮壯素則降低了內(nèi)源GA3含量，植物為了維持內(nèi)源GA3的平衡，更多的GGPP 參與GA3合成，增加了GGPP 的消耗，進(jìn)而抑制了西柏三烯二醇關(guān)鍵合成基因CYC、CYP71D16的表達(dá)，西柏三烯二醇含量減少[30-31]。

本研究發(fā)現(xiàn)，編輯NtCPS2基因后KD 內(nèi)源GA3含量升高，葉片腺毛密度增加，西柏三烯二醇含量升高。此結(jié)果與外施GA3處理相同，與外施矮壯素處理相反。表明編輯煙草NtCPS2基因影響了煙草內(nèi)源GA3的生物合成進(jìn)而影響了煙草葉片腺毛的發(fā)育及其分泌物的合成，初步揭示了NtCPS2基因在煙草萜類代謝和腺毛發(fā)育中的作用。