郭海霞,葉長青,金夢媛,羅洪斌

湖北民族大學(xué)醫(yī)學(xué)部(湖北 恩施 445000)

卵巢早衰(premature ovarian failure,POF)是指患者在40歲以前便出現(xiàn)了因卵巢內(nèi)卵泡耗竭等原因引起的卵巢功能衰竭疾病,該類女性的月經(jīng)初潮年齡或正?；蜓舆t,血清促卵泡激素(FSH)水平高、雌激素水平低,臨床癥狀主要有月經(jīng)量少、閉經(jīng)、不孕等,有的患者還會伴有潮熱、盜汗等圍絕經(jīng)期綜合征表現(xiàn)[1]。POF屬于女性內(nèi)分泌疾病,是引起不孕的主要原因之一,其發(fā)病的因素多,主要有免疫功能紊亂、遺傳、放射治療、化學(xué)治療等[2]。研究發(fā)現(xiàn)[3]POF發(fā)病率約為1%,且逐年增加,30歲以前發(fā)病率為0.1%,發(fā)病年齡呈年輕化趨勢。目前,西醫(yī)主要采用激素替代療法治療,可保護中樞神經(jīng),減少AD的發(fā)生風(fēng)險[4],但長時間使用激素容易增加患子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌等疾病的風(fēng)險;同時許多POF患者無法正常受孕,往往會借助輔助生殖技術(shù)助孕,但由于不易獲得質(zhì)量較高的卵子進行體外受精,因此很多患者最終很難成功妊娠。現(xiàn)代研究表明[5]中醫(yī)可改善月經(jīng)、排卵及圍絕經(jīng)期癥狀,如潮熱、盜汗、失眠、焦慮和骨質(zhì)疏松癥等,對多種婦科疾病如多囊卵巢綜合征等都有良好療效。中醫(yī)認為,POF虛是根本,根據(jù)“因虛致瘀”理論,血瘀是其關(guān)鍵病機,臨床中運用補腎活血法治療POF療效明顯,研究表明[6]補腎活血方可通過降低FSH和T淋巴細胞比例(CD4+CD25+/CD4+)水平,提高抑制素(Inh)和雌二醇(E2)水平,減少細胞凋亡,從而使POF大鼠的卵巢健康狀況有所改善,即可調(diào)節(jié)性激素水平、抑制細胞凋亡,從而對卵巢的儲備功能起到保護作用;劉慧萍等[7]發(fā)現(xiàn)補腎活血方可抑制Fas、FasL的mRNA表達和提高E2,降低黃體生成素(LH)、FSH水平,改善卵泡顆粒細胞的凋亡最終達到治療作用。

補腎活血法主要是通過調(diào)控下丘腦-垂體-卵巢軸的神經(jīng)內(nèi)分泌功能、改善卵巢血流動力學(xué)與卵巢微循環(huán)、抑制卵巢顆粒細胞凋亡等發(fā)揮對卵巢早衰的調(diào)節(jié)作用[8],其中抑制卵巢顆粒細胞凋亡是其主要的作用機制之一。本文將就補腎活血法通過調(diào)控卵巢顆粒細胞凋亡防治卵巢早衰的作用機制進行綜述,以期為臨床及實驗研究提供相關(guān)參考依據(jù)。

1 POF與顆粒細胞凋亡的關(guān)系

細胞凋亡是一種主動的、程序性的、基因控制的細胞自主有序的死亡,它在卵泡發(fā)育的各個階段都有參與,因此,在卵巢疾病的發(fā)生發(fā)展中起到關(guān)鍵作用。卵泡的組成部分主要有卵母細胞、顆粒細胞和膜細胞,卵巢和卵泡微環(huán)境的自身穩(wěn)態(tài)維持著卵母細胞的成熟,而卵母細胞發(fā)揮指導(dǎo)和促進顆粒細胞增殖和分化的功能,顆粒細胞提供卵母細胞生長發(fā)育所需的營養(yǎng)物質(zhì),二者在卵泡的發(fā)育、成熟和排卵的整個過程中都存在著緊密的聯(lián)系,其中,顆粒細胞的狀態(tài)影響著卵母細胞的質(zhì)量和胚胎發(fā)育潛能。一般情況下,卵泡閉鎖是卵巢生理功能的重要部分,可清除不正常的組織,一旦顆粒細胞的凋亡機制發(fā)生紊亂,大量卵泡閉鎖發(fā)生在卵母細胞還未成熟時,并且其閉鎖速度快于生理代謝的速度時,卵巢儲備將會過早的耗盡[9],所以在一定條件下,不可避免地加快卵泡閉鎖,從而引起POF發(fā)生。

過度或紊亂的顆粒細胞凋亡是卵母細胞發(fā)育能力受損的標志,影響了卵母細胞和顆粒細胞在卵泡發(fā)育中的緊密聯(lián)系,抑制了卵母細胞的生長,導(dǎo)致卵泡閉鎖加速,從而影響卵巢功能[10],因此,POF的發(fā)生與卵泡顆粒細胞凋亡及卵泡閉鎖密切相關(guān)。卵泡顆粒細胞凋亡導(dǎo)致卵泡閉鎖,進而導(dǎo)致女性生殖能力的衰退[11]。HUANG等[12]發(fā)現(xiàn)對發(fā)生卵泡顆粒細胞紊亂的POF小鼠進行干預(yù)后,可逆轉(zhuǎn)相關(guān)指標并糾正相關(guān)蛋白的表達,由此可見,在POF的發(fā)展過程中,卵泡顆粒細胞發(fā)揮了關(guān)鍵性作用。

2 補腎活血法與顆粒細胞凋亡的關(guān)系

細胞凋亡是機體重要的自我穩(wěn)態(tài)機制,是由促凋亡蛋白、抗凋亡蛋白和凋亡調(diào)控因子等在相應(yīng)的信號通路的作用下共同參與的過程[13],與顆粒細胞凋亡相關(guān)的蛋白有Bcl-2蛋白家族、Caspase-3、FOXO3、Myc和P53等[14]。研究顯示[15]補腎活血中藥具有抑制顆粒細胞凋亡的作用。補腎活血中藥能夠抑制雷公藤多苷所致氧化應(yīng)激對卵巢Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)、細胞色素C、caspase-3的激活,使顆粒細胞的凋亡減少,避免了卵泡的過度閉鎖,從而保護了卵巢的儲備功能;由當(dāng)歸、熟地黃等組成的補腎活血方能夠使POF小鼠卵巢中Bcl-2/Bax的比值增大,caspase-3 mRNA的表達量減少,從而使卵巢顆粒細胞的凋亡受到抑制,有效減少卵泡閉鎖,進而起到改善卵巢儲備功能的作用[16];益腎調(diào)經(jīng)方可能是通過增加抗凋亡因子Bcl-2的表達,使促凋亡因子caspase-3、Bax的表達下調(diào),從而使大鼠卵巢顆粒細胞的凋亡受到抑制,達到改善卵巢功能的作用[17]。

3 顆粒細胞凋亡相關(guān)蛋白

3.1Bcl-2蛋白家族Bcl-2家族蛋白是調(diào)控細胞凋亡的重要蛋白。Bcl-2蛋白可有效抑制細胞凋亡,利于卵泡的生長發(fā)育;Bax則相反,它可促進細胞的凋亡,從而加快卵泡閉鎖的速度,二者共同調(diào)控著卵巢卵泡生長發(fā)育的各個階段。研究顯示亡[18]Bax蛋白在卵子細胞死亡過程中起關(guān)鍵性作用,它可運用小分子干擾RNA(siRNA)干擾Bax的表達,從而達到抑制顆粒細胞凋亡的作用。bcl-2蛋白和bax蛋白形成同二聚體或異二聚體表達,調(diào)控顆粒細胞的凋。研究表明亡[19]大鼠卵巢顆粒細胞的凋亡可由顆粒細胞中自噬體的積累使得Bcl-2的表達減少而誘導(dǎo),并加速卵泡閉鎖從而發(fā)生POF。廖風(fēng)嬌[20]研究表明新加歸腎丸具有改善雷公藤多苷導(dǎo)致的大鼠卵巢損傷的作用,可通過調(diào)節(jié)Bax、Bcl-2 mRNA的蛋白表達量來達到促進顆粒細胞增殖的作用,進而使卵巢儲備功能得到改善。

3.2Caspase-3Caspase蛋白酶家族在細胞凋亡過程中具有重要作用,caspase-3又是其中最重要的細胞凋亡效應(yīng)分子,它可通過多種途徑誘導(dǎo)細胞凋亡的發(fā)生。研究表明[21]Caspase蛋白酶可通過激活Caspase-3等引起Caspases的級聯(lián)反應(yīng),最終導(dǎo)致細胞凋亡,所以,細胞凋亡的相關(guān)情況可通過Caspase-3的表達反應(yīng)出來,因此,caspase基因很可能是誘導(dǎo)顆粒細胞發(fā)生凋亡的主要機制之一。張麗娜等[21]研究發(fā)現(xiàn)補腎活血方能抑制Bax及Caspase-3蛋白的表達,治療雷公藤多苷誘發(fā)的卵巢顆粒細胞凋亡引起的卵巢早衰。

3.3FOXO3FOXO3是FOXO的轉(zhuǎn)錄因子,顆粒細胞的凋亡可通過上調(diào)FOXO3的表達誘發(fā),進而誘導(dǎo)卵泡發(fā)生閉鎖。FOXO3a轉(zhuǎn)錄因子為FOXO蛋白家族的成員之一,調(diào)控細胞的增殖、生長、分化、調(diào)亡及衰老等重要的生命過程。另外,FOXO3a轉(zhuǎn)錄因子作為磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信號通路下游的重要靶蛋白之一,具有調(diào)節(jié)細胞周期阻滯蛋白P27kip1和促凋亡蛋白Bim的功能,從而對細胞周期及細胞凋亡進行調(diào)控。研究顯示[22]二仙湯具有降低FOXO3a表達的作用,從而使P27kip1及Bim的表達下調(diào),進而抑制卵巢顆粒細胞的凋亡,具有保護因順鉑損傷的卵巢顆粒細胞的作用。

3.4Myc蛋白Myc是核蛋白類基因中的一種,是較早發(fā)現(xiàn)的癌基因,C-myc、N-myc和L-myc是目前發(fā)現(xiàn)的3種,Myc可影響細胞的周期、分化,調(diào)控細胞的增殖和凋亡。研究顯示,Myc蛋白可能通過促進顆粒細胞的凋亡,從而使卵泡膜細胞發(fā)生凋亡。隨著卵泡發(fā)育和功能的完善Myc基因的表達會發(fā)生相應(yīng)變化,在卵泡發(fā)育的原始階段呈強陽性,隨著卵泡的發(fā)育,強陽性會逐漸減弱,在卵泡閉鎖時,可能只在卵泡膜細胞中可檢測到Myc蛋白。王海丹等[23]研究表明補腎健脾方具有治療POF的作用,可能是通過提高E2水平,激活雌激素受體(ER),從而促進c-Myc的表達,調(diào)節(jié)端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(TERT)的表達來促進卵巢顆粒細胞的增殖。

3.5P53p53是一種重要的促凋亡基因,它可通過抑制細胞的轉(zhuǎn)化生長,調(diào)節(jié)細胞的分裂過程,p53的激活還可調(diào)節(jié)其它凋亡因子發(fā)揮作用。研究表明[24]p53可能通過抑制顆粒細胞中由TGF-β1誘導(dǎo)的有關(guān)miRNA的表達來調(diào)控卵巢顆粒細胞的生長、發(fā)展和凋亡。作為DNA損傷凋亡通路中的關(guān)鍵調(diào)控因子,P53的一個同系物TAp63可與磷酸化的c-Abl(一種原癌基因)發(fā)生相互作用,然后級聯(lián)激活促凋亡相關(guān)分子Bax和Bak,使顆粒細胞凋亡發(fā)生級聯(lián)反應(yīng)。常卓等[25]研究發(fā)現(xiàn),運用補腎活血方對不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(URSA)小鼠的蛻膜化過程進行調(diào)節(jié),可發(fā)現(xiàn)蛻膜化中后期的p53、p21表達顯著降低。

4 顆粒細胞凋亡相關(guān)信號通路

4.1PI3K/Akt/mTOR信號通路PI3K/Akt信號通路對卵巢顆粒細胞的凋亡起到調(diào)控作用,該通路主要參與細胞的增殖、分化、凋亡等過程。PI3K/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號通路廣泛存在于卵母細胞和顆粒細胞中,可維持原始卵泡激活與休眠、存活與凋亡之間的動態(tài)平衡。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)[10]調(diào)節(jié)顆粒細胞的增殖和分化有PI3K/Akt信號通路中的許多分子的參與。研究表明[26]補腎活血方可對PI3K/Akt/mTOR信號通路進行激活,進而使caspase3的表達下調(diào),卵泡凋亡減少,最終改善卵巢儲備功能。新加歸腎丸通過激活mTOR信號通路,從而提高細胞周期蛋白D2的表達,加速卵巢顆粒細胞周期的進程,從而實現(xiàn)顆粒細胞的增殖達到改善卵泡發(fā)育的作用[27]。對PI3K/AKT/mTOR通路進行激活后,還可使下游自噬效應(yīng)分子Beclin 1及微管相關(guān)蛋白2輕鏈3(LC3-II)的表達減少并降低p62的消耗,從而修復(fù)雷公藤甲素誘導(dǎo)的大鼠卵巢顆粒細胞的自噬損傷,進而改善卵巢儲備功能[28]。左歸丸通過激活PI3K/Akt/mTOR信號通路的蛋白表達,使Bcl-2得到上調(diào),Bax的表達下調(diào),抑制卵巢顆粒細胞的凋亡,使殘存卵泡得到發(fā)育,進而保護卵巢功能[29]。補腎活血方可調(diào)節(jié)卵巢組織中的顆粒細胞,上調(diào)小鼠PI3K、AKT及MTOR的蛋白表達量,使E2升高,FSH和LH降低,從而達到促排卵,減少卵泡閉鎖的作用,最終使卵巢環(huán)境和內(nèi)分泌功能得到改善[30]。

4.2NF-κB信號通路核轉(zhuǎn)錄因子-кB(NF-кB)可參與激活多種細胞進程中的基因轉(zhuǎn)錄、細胞凋亡和免疫應(yīng)答的信號傳導(dǎo)。NF-κB在次級卵泡到竇卵泡的過渡過程中被激活,可通過卵泡刺激素受體(FSH receptor,FSHR)及其相應(yīng)的靶分子起到抑制顆粒細胞凋亡的作用,從而促進細胞的增殖和分化,與此同時,被激活的Bcl-2在細胞質(zhì)內(nèi)與NF-κB形成Bcl-2-NF-κB復(fù)合物也具有抑制顆粒細胞凋亡的作用。POF的發(fā)生與NF-κB失活關(guān)系密切,如果NF-κB在卵巢卵母細胞和顆粒細胞發(fā)育過程中的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)減弱,卵泡發(fā)育將會出現(xiàn)異常,導(dǎo)致卵泡閉鎖,最終引發(fā)POF。研究發(fā)現(xiàn)[31]下調(diào)轉(zhuǎn)基因小鼠中的NF-κB,其竇卵泡數(shù)量減少了,E2和抗繆勒氏管激素(AMH)的水平也降低了,認為NF-κB可能是通過葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激來調(diào)節(jié)卵泡刺激素受體的表達,從而使顆粒細胞發(fā)生增殖,促使卵泡的發(fā)育成熟。袁苑[32]研究發(fā)現(xiàn)補腎促卵方可使骨形態(tài)發(fā)生蛋白7(BMP-7)的表達水平上調(diào),caspase-3的表達下調(diào),從而抑制雷公藤多苷誘導(dǎo)的離體小鼠卵巢顆粒細胞的凋亡,進而恢復(fù)其卵巢功能,其可能是通過細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子(Smad)和NF-κB兩條信號通路來介導(dǎo)對BMP-7、caspase-3的調(diào)控。

4.3TGF-β/Smads信號通路轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)/Smads通路對顆粒細胞的增殖、分化具有重要的調(diào)控作用,參與了卵泡的生長發(fā)育,卵巢顆粒細胞可分泌TGF-β1,并且顆粒細胞表面含有TGF-β受體,它對竇前卵泡生長、顆粒細胞增生與分化具有促進作用。研究顯示[33]補腎活血方對免疫性POF小鼠TGF-β1/Smads信號通路的傳導(dǎo)具有明顯的促進作用,從而利于顆粒細胞的增殖和分化,減少了顆粒細胞的凋亡,進而調(diào)控了卵泡的發(fā)育,改善了卵巢的功能。卵巢顆粒細胞可分泌一種肽類物質(zhì)激活素A(Act A),補腎活血方可促進Act A的分泌,使激活素ⅡA型受體、Smad2、Smad3的表達上調(diào),然后通過Act A/Smads信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,推動卵巢顆粒細胞的增殖和分化,從而提高芳香化酶的表達和活性,使卵巢顆粒細胞更好的發(fā)揮調(diào)節(jié)卵泡發(fā)育的功能,促使卵巢局部微環(huán)境得到很好的改善[34]。

4.4Nrf2/ARE信號通路Nrf2/ARE信號通路主要由核因子NF-E2相關(guān)因子(Nrf 2)、Bach1和抗氧化反應(yīng)元件(Are)等組成,為最重要的內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激通路[19],具有維持細胞穩(wěn)態(tài)、抑制細胞凋亡等方面的重要作用。研究表明[15]補腎促卵方通過調(diào)控卵巢Nrf2/ARE信號通路,抑制Kelch樣ECH相關(guān)蛋白1(Keap1)過表達,從而促進Nrf2核易位,使下游抗氧化酶活性得到激活,可對抗雷公藤多苷誘導(dǎo)的DOR小鼠的卵巢氧化應(yīng)激損傷,從而避免卵泡顆粒細胞過度凋亡,防止卵泡發(fā)生異常閉鎖。

近年來,POF的發(fā)病率不斷上升,中醫(yī)藥療法在POF防治方面的作用越來越被廣大患者所接受。POF在中醫(yī)典籍上沒有記載,但從其癥狀來看,常與“血枯”“經(jīng)水早斷”“不孕”等有關(guān)。古代醫(yī)家對該類疾病的病因病機雖然各有看法,但都認為腎虛是主要致病因素,《素問·上古天真論》云:“女子……,七七任脈虛,太沖脈衰少,天癸竭,地道不通,故形壞而無子也?！薄秼D人歸·經(jīng)脈之本》曰:“天癸者,言后天之陰氣,陰氣足而月事通?！薄秱髦忆洝り庩柶吩?“元陰者,即無形之水,以長以立,天癸是也,強弱系之,故亦曰元精。”《傅青主女科》云:“經(jīng)水出諸腎”,都認為腎藏精,主生殖,腎精的盛衰影響著天癸的至竭、沖任二脈的盛衰以及月事的行止,腎虛精虧可致天癸不能按時正常充盈而出現(xiàn)過早的耗竭,最終導(dǎo)致POF。女子以血為本,以氣為用,氣血調(diào)和,則臟腑功能正常,腎虛精虧則瘀血內(nèi)生,可致不孕,《陳素庵婦科補解》曰:“婦人諸疾,多由經(jīng)水不調(diào)。調(diào)經(jīng),然后可以孕子,然后可以卻疾?！薄秼D科玉尺》曰:“養(yǎng)血之法,莫先于調(diào)經(jīng)。蓋經(jīng)不調(diào)則血氣乖爭,不能成孕。”《女科要旨》亦云:“婦人無子,皆由經(jīng)水不調(diào)……種子之法,即在于調(diào)經(jīng)之中。”一旦氣血失調(diào),則極易導(dǎo)致瘀血阻滯胞中,不能益腎,另外瘀血不祛,新血不生,則經(jīng)血失源,從而引起臟腑功能失常,而女子經(jīng)、孕、胎、產(chǎn)、乳最易傷精耗血,故腎虛血瘀是導(dǎo)致POF的主要病機,臨床上治療POF多以補腎活血法為原則遣方用藥。

現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)[35]補腎活血中藥的化學(xué)成分豐富多樣,主要有黃酮、甾體、糖類等成分,主要發(fā)揮抑制血小板聚集及抗血栓、抗炎等作用。依據(jù)補腎活血法組成的中藥復(fù)方可通過多種信號通路和相關(guān)蛋白起到抑制卵巢顆粒細胞凋亡的作用,從而防治POF。但補腎活血復(fù)方藥味較多,藥物之間的相互作用是否會產(chǎn)生新的物質(zhì)因子作用于疾病,還有待進行深入挖掘研究;對補腎活血中藥的禁忌癥缺乏報道,后續(xù)可增加相關(guān)研究數(shù)據(jù)使其作用機制更加完善。