馬 莉, 屈 歡*,, 郭 震, 王軍節(jié), 張 琇

(1.北方民族大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，銀川 750021；2.北方民族大學(xué) 植物性農(nóng)產(chǎn)品貯藏與加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，銀川 750021；3.寧夏特殊生境微生物資源開發(fā)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，銀川 750021)

據(jù)世界糧農(nóng)組織統(tǒng)計(jì)，全球每年約有25%的作物受到病害的影響[1]，這是造成農(nóng)作物產(chǎn)量和品質(zhì)降低的主要原因之一[2-3]。在病害中，其中70%～80%的病害是由植物病原真菌所導(dǎo)致的[4]。在我國(guó)，一些植物病原真菌病害如蘋果腐爛病和番茄灰霉病等，一直以來(lái)是制約農(nóng)作物優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的重要因素之一，導(dǎo)致?lián)p失慘重[5]。一直以來(lái)，化學(xué)抗菌劑在拮抗植物病原真菌和促進(jìn)農(nóng)業(yè)的增產(chǎn)中起著不可或缺的作用。但是，長(zhǎng)期使用化學(xué)抗菌劑因引發(fā)食品安全、環(huán)境污染及誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗藥性等問(wèn)題而逐漸受到限制[6-8]。因此，人們將目光轉(zhuǎn)向新型、安全、環(huán)保的生物源農(nóng)藥。

微生物殺菌劑作為生物源農(nóng)藥的重要組成部分，因具有高效、低毒、選擇性強(qiáng)、殘留時(shí)間短等特點(diǎn)，在農(nóng)業(yè)病害防治中發(fā)揮重要作用[8]。木霉屬Trichodermaspp.是植物真菌病害防治中研究最廣泛的真菌之一[9-11]，目前該屬已知物種已達(dá)340種[12]。木霉具有廣譜的拮抗活性，對(duì)病原菌具有重要的生防作用，其生防機(jī)制主要有競(jìng)爭(zhēng)作用、重寄生作用、植物生長(zhǎng)促進(jìn)劑和誘導(dǎo)植物抗性等[13-14]，不同作用機(jī)制之間可能還有互相協(xié)同作用[15]。一些木霉菌在植物病害防控的過(guò)程中通過(guò)產(chǎn)生次生代謝物發(fā)揮作用，目前該屬報(bào)道的代謝物已超過(guò)200 種，不同種產(chǎn)生的代謝物數(shù)量和種類有所差異，其中研究最多的是具有揮發(fā)性的“椰子芳香”化合物6-戊基-2H-吡喃-2-酮 (6-PP)[16]。6-PP 是木霉產(chǎn)生的吡喃酮類代謝物，最初是在綠色木霉T.viride的發(fā)酵液中被檢測(cè)到，之后陸續(xù)在哈茨木霉T.harzianum和康寧木霉T.koningii中被檢測(cè)到[17]。6-PP 除其特殊的“椰子香味”外，還表現(xiàn)出較好的抑菌活性，如可以抑制絲核菌等病原菌的生長(zhǎng)[18]。

分離自中國(guó)西藏自治區(qū)米林縣腐枝的塞繆爾斯木霉T.samuelsii，作為木霉屬的一種，在中國(guó)于2019 年被首次報(bào)道[19]。本實(shí)驗(yàn)室前期從中國(guó)寧夏回族自治區(qū)六盤山附近的百里香植物中分離到1 株木霉真菌，經(jīng)分子生物學(xué)和性狀觀察發(fā)現(xiàn)其與已報(bào)道的塞繆爾斯木霉極為相似，所不同的是其在SNA 培養(yǎng)基上沒(méi)有椰子香味[19]。因此，本研究對(duì)該菌株進(jìn)行了系統(tǒng)的生物學(xué)性狀和抑菌活性研究，采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 (GC-MS) 探究了其抑菌活性成分，并采用高效液相色譜(HPLC)技術(shù)探索了其主要抑菌化合物的產(chǎn)生條件，以期為基于木霉菌的微生物抑菌劑的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

百里香內(nèi)生真菌2-63 菌株：來(lái)源于六盤山地區(qū)生長(zhǎng)的百里香植株莖部，現(xiàn)保存于中國(guó)微生物保藏中心 (保藏號(hào)：M2020642)。

供試病原菌菌株：馬鈴薯早疫病菌Alternaria solani、番茄灰霉病菌Botrytis cinerea、馬鈴薯干腐病菌Fusarium sulphureum、西瓜枯萎病菌Fusarium oxysporum、蘋果腐爛病菌Valsa mali、枸杞根腐病菌Fusarium solani、小麥赤霉病菌Fusarium graminearum和枸杞黑霉病菌Alternaia alternata。其中，枸杞根腐病菌、西瓜枯萎病菌和枸杞黑霉病菌為寧夏特殊生境微生物資源開發(fā)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離并鑒定，其余病菌均為西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院饋贈(zèng)。乙酸乙酯、甲醇、乙腈等試劑均為市售色譜純或分析純。

1.2 供試培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基 (PDA)：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉15 g，蒸餾水1000 mL。馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基 (PDB)：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1000 mL。玉米粉瓊脂培養(yǎng)基(CMD)：玉米粉30 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉15 g，蒸餾水1000 mL。人工合成低營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(SNA)：KH2PO41.0 g，KCl 0.5 g，KNO31.0 g，MgSO40.5 g，葡萄糖0.2 g，瓊脂粉15 g，蒸餾水1000 mL。大米培養(yǎng)基：大米60 g，蒸餾水90 mL，pH 值自然。大麥培養(yǎng)基：大麥80 g，蒸餾水120 mL，浸泡過(guò)夜。

1.3 百里香內(nèi)生真菌2-63 菌株的生物學(xué)鑒定

1.3.1 菌落特征及菌絲、孢子形態(tài)觀察 分別將2-63 菌株接種于PDA、CMD 和SNA 培養(yǎng)基上，于25 ℃恒溫黑暗培養(yǎng)，逐日觀察菌株在3 種培養(yǎng)基上菌落的大小、顏色、表面、邊緣及生長(zhǎng)速度等培養(yǎng)特征；以培養(yǎng)72 h 時(shí)的菌落平均直徑計(jì)算日生長(zhǎng)速率；分別挑取菌絲置于載玻片上，采用正置熒光顯微鏡觀察菌絲和孢子形態(tài)等性狀。

1.3.2 菌株鑒定 將2-63 菌株接種在PDA 培養(yǎng)基上，于28 ℃下培養(yǎng)5 d，在超凈工作臺(tái)中刮取收集菌絲，用UNIQ-10 真菌基因組DNA 提取試劑盒提取DNA，對(duì)其ITS、TEF1和RPB2區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增。ITS擴(kuò)增引物為ITS1 (5′-TCCGTAG GTGAACCTGCGG-3′) 和ITS4 (5′-TCCTCCG CTTATTGATATGC-3′)，TEF1擴(kuò)增引物為EF1-728F (5′-CATCGAAGTTCGAAGG-3′) 和Tef1LLErev(5′-AACTTGCAGGCAATGG-3′)，RPB2擴(kuò)增引物為：RPB2_210up (5′-TGGGWGA YCARAARAAGG-3′) 和RPB2_1450low (5′-CATRATGACSGAATCTT CCTGG-3′)，PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)合格后送至上海美吉生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果在NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)里上傳分別獲取登記號(hào)MN944534、OP414767 和OP414768。測(cè)序結(jié)果在GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST 比對(duì)，獲取參考序列及相關(guān)分類信息[20]，利用BioEdit、Mega-X 軟件和Neighbor-Joining (NJ) 法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行物種鑒定，各分支置信度進(jìn)行1000 次重復(fù)分析。

1.4 百里香內(nèi)生真菌2-63 菌株的抑菌活性測(cè)定

1.4.1 菌株對(duì)常見(jiàn)植物病原菌的拮抗作用 采用平板對(duì)峙法[21]測(cè)定。將植物病原菌菌餅 (4 mm)接種于PDA 平板中央，在距離植物病原菌兩側(cè)30 mm 處對(duì)稱接種2-63 菌株，每處理3 次重復(fù)，以只接種植物病原菌的處理為對(duì)照，于28 ℃恒溫培養(yǎng)，96 h 后測(cè)量菌落的生長(zhǎng)直徑，按公式 (1) 計(jì)算抑制率 (I)。

其中：Dc為對(duì)照菌落直徑，Dt為處理菌落直徑。

1.4.2 菌株發(fā)酵液和發(fā)酵液粗提物抑菌活性測(cè)定

采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定[22]。將 2-63 菌餅(4 mm)接種于250 mL 含有130 mL PDB 培養(yǎng)基的三角瓶中，每瓶接種6 塊，每個(gè)階段接種7 瓶，于28 ℃、170 r/min 搖床中恒溫培養(yǎng)，觀察 2-63菌株發(fā)酵液的特征。分別于96、108 和180 h時(shí)取出7 瓶發(fā)酵液，移取50 mL 過(guò)0.45 μm 的水系微孔濾膜，按體積比1:9 的比例與PDA 培養(yǎng)基混合，制備成發(fā)酵原液帶毒培養(yǎng)基。每個(gè)階段剩余的發(fā)酵液合并后，采用冷凍干燥機(jī)低溫冷凍濃縮至原體積的1/4，用等體積的乙酸乙酯萃取3 次。合并萃取液，無(wú)水硫酸鈉干燥后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得浸膏 (黏稠狀小顆粒)，用丙酮溶解并定容至5 mL，與420 mL PDA 培養(yǎng)基混勻，倒入直徑為9 cm 的培養(yǎng)皿，制備成發(fā)酵液粗提物帶毒培養(yǎng)基。在這兩種帶毒培養(yǎng)基上接種植物病原菌，對(duì)照組為只接種植物病原菌的平板，每個(gè)處理3 次重復(fù)，于28 ℃恒溫培養(yǎng)，4 d 后測(cè)量菌落的生長(zhǎng)直徑，按公式 (1) 計(jì)算抑制率。

1.4.3 菌株揮發(fā)性有機(jī)化合物 (VOCs) 的抑菌活性

參照Wonglom 等[23]的熏蒸法并作適當(dāng)修改。在9 cm 的滅菌培養(yǎng)皿蓋和底分別倒入PDA 培養(yǎng)基，將 2-63 菌餅(4 mm) 接種于培養(yǎng)皿蓋中央，植物病原菌接種于培養(yǎng)皿底中央，將培養(yǎng)皿蓋與底合上后用石蠟密封，以不接種2-63 的培養(yǎng)皿為對(duì)照，每處理3 次重復(fù)，于28 ℃恒溫培養(yǎng)，4 d后測(cè)定菌落的生長(zhǎng)直徑，按公式 (1) 計(jì)算抑制率。

1.5 百里香內(nèi)生真菌2-63 菌株抑菌活性成分分析

根據(jù)1.4 節(jié)的結(jié)果，2-63 菌株抑菌的活性成分主要為其產(chǎn)生的VOCs。結(jié)合在平板上的培養(yǎng)和液體發(fā)酵的情況，分析2-63 菌株在不同培養(yǎng)條件下VOCs 的成分組成。

1.5.1 菌株在平板培養(yǎng)條件下產(chǎn)生的VOCs分析 根據(jù)1.3.1 節(jié)的結(jié)果，2-63 菌株在SNA 培養(yǎng)基上不產(chǎn)生VOCs，而在PDA 和CMD 培養(yǎng)基上產(chǎn)生VOCs，因而利用GC-MS 分別分析 2-63 菌株在PDA 和CMD 培養(yǎng)基中的產(chǎn)香情況。

1) 樣品前處理：將2-63 菌餅(4 mm)分別接種于PDA 和CMD 培養(yǎng)基中央，于28 ℃恒溫培養(yǎng)，于培養(yǎng)的第1～18 天連續(xù)取樣，采用頂空固相微萃取技術(shù) (HS-SPME) 采集VOCs，采樣過(guò)程如圖1 所示。采用GC-MS 分析，運(yùn)用NIST17 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)出峰結(jié)果進(jìn)行檢索分析。

圖1 T.samuelsii 2-63 菌株 VOCs 的取樣過(guò)程Fig.1 Procedure of VOCs produced by T.samuelsii 2-63 strain

2) 色譜條件：HP-5MS 色譜柱 (30 m × 250 μm，0.25 μm)，進(jìn)樣口溫度250 ℃，AUX-2 溫度 (接口溫度) 270 ℃，載氣為高純氦氣，柱流速1 mL/min，恒定流速，不分流進(jìn)樣，壓力52.76 kPa，隔壁吹掃流量3 mL/min。

3) 質(zhì)譜條件：離子方式為電子轟擊電離(EI)，電離電壓70 eV，離子源溫度230 ℃，傳輸線溫度105 ℃，四級(jí)桿溫度150 ℃，m/z掃描范圍50～550 amu，掃描方式為全掃描，溶劑延遲1 min。

4) 程序升溫過(guò)程：初始50 ℃，保持0 min，以10 ℃/min 升溫至160 ℃，保持2 min，運(yùn)行13 min，再以10 ℃/min 升溫至200 ℃，共運(yùn)行17 min。

1.5.2 菌株在固體發(fā)酵培養(yǎng)條件下產(chǎn)6-PP 的分析

1.5.2.1 待測(cè)樣品的制備 將2-63 菌餅(4 mm)接種于PDA 平板上，于28 ℃恒溫培養(yǎng)，4 d 后取活化好的菌餅3 塊接種于裝有130 mL 的PDB 液體培養(yǎng)基的250 mL 錐形瓶中，于28 ℃、150 r/min恒溫?fù)u床中培養(yǎng)3 d，獲得種子發(fā)酵液；將分別裝有大麥培養(yǎng)基、大米培養(yǎng)基和麥麩培養(yǎng)基的500 mL 三角瓶分別于121 ℃進(jìn)行滅菌30 min，冷卻后分別接種200 μL 的種子發(fā)酵液，于28 ℃恒溫培養(yǎng)；根據(jù)前期試驗(yàn)結(jié)果，在發(fā)酵培養(yǎng)后8、16 和20 d，分別取發(fā)酵培養(yǎng)基3 瓶，用乙酸乙酯進(jìn)行固-液萃取3 次。合并萃取液，無(wú)水硫酸鈉干燥后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，得到液體粗提物。分別取3 種粗提物少許，用少量乙酸乙酯溶解，以6-PP 標(biāo)準(zhǔn)品為對(duì)照，進(jìn)行薄層色譜(TLC)檢測(cè)分析。粗提物用色譜甲醇稀釋50 倍，過(guò)0.22 μm 有機(jī)系微孔濾膜，待HPLC 分析。

1.5.2.2 HPLC 分析 色譜柱為ZORBAX SBC18柱 (250 mm × 4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為100%乙腈，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，柱溫35 ℃，流速1 mL/min，進(jìn)樣量10 μL。準(zhǔn)確稱取6-PP 標(biāo)準(zhǔn)品5 mg，用色譜純甲醇溶解并定容至10 mL，過(guò)0.22 μm 有機(jī)系微孔濾膜，即得0.5 mg/mL 的6-PP 標(biāo)準(zhǔn)品溶液，再用甲醇梯度稀釋成0.4、0.3、0.2、0.1 mg/mL 的系列6-PP 標(biāo)準(zhǔn)品工作溶液，按上述條件測(cè)定，以6-PP 的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以其對(duì)應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出待測(cè)樣品的含量。

1.5.3 菌株在淺層培養(yǎng)條件下產(chǎn)6-PP 的分析 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制同1.5.2 節(jié)。通過(guò)前期液體發(fā)酵抑菌試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2-63 菌株在PDB 液體培養(yǎng)基中不產(chǎn)生VOCs，推測(cè)可能是因?yàn)镻DB 液體搖瓶培養(yǎng)，菌餅懸浮于液體中氧氣供應(yīng)不足而影響了VOCs的產(chǎn)生，故采用淺層培養(yǎng)分析2-63 菌株產(chǎn)物及產(chǎn)生6-PP 的情況。在100 mL 的三角瓶中裝入15 mL的PDB 培養(yǎng)基，于121 ℃滅菌20 min，冷卻后接種 2-63 菌餅 (4 mm) 3 塊，菌絲面朝上，于28 ℃恒溫培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)后3、6、9、12、15 和18 d取發(fā)酵液。每個(gè)階段3 次重復(fù)。過(guò)0.22 μm 水系濾膜，待HPLC 分析，條件同1.5.2 節(jié)。

1.6 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用Microsoft Excel 2017 進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，采用SPSS 19.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，在P＜ 0.05 水平上采用Duncan’s 新復(fù)極差法進(jìn)行顯著性差異分析，利用GraphPad Prism 5.0、Origin 等軟件制作圖表。

2 結(jié)果分析

2.1 百里香內(nèi)生真菌2-63 菌株的生物學(xué)性狀

2.1.1 菌落特征及菌絲、孢子形態(tài)觀察 2-63 菌株在所有培養(yǎng)基上均能生長(zhǎng)。在PDA 培養(yǎng)基上(圖2-A) 菌落生長(zhǎng)較快，菌絲棉絮狀白色，呈輻射狀向外生長(zhǎng)；于25 ℃下培養(yǎng)48 h 后菌絲產(chǎn)生椰子芳香氣味；培養(yǎng)72 h 菌落半徑為64 mm；培養(yǎng)8 d 后產(chǎn)生綠色光滑的分生孢子；培養(yǎng)15 d 后邊緣菌絲出現(xiàn)白色小膿皰。

在CMD 培養(yǎng)基上 (圖2-B) 菌絲生長(zhǎng)較快，但培養(yǎng)初期菌絲白色絮狀稀薄；于25 ℃下培養(yǎng)72 h 菌落半徑71 mm；培養(yǎng)6 d 菌絲產(chǎn)生椰子芳香氣味；培養(yǎng)7 d 后邊緣菌絲出現(xiàn)白色粉狀斑點(diǎn)，有綠色、光滑的分生孢子產(chǎn)生；培養(yǎng)13 d 后，培養(yǎng)基邊緣菌絲出現(xiàn)白色膿皰。

在SNA 培養(yǎng)基上 (圖2 C-F)菌落生長(zhǎng)緩慢，菌絲白色極稀薄；于25 ℃下培養(yǎng)72 h 菌落半徑37 mm；菌絲不產(chǎn)生椰子氣味；培養(yǎng)7 d 后培養(yǎng)基表面出現(xiàn)綠色斑點(diǎn)，有綠色、光滑的分生孢子產(chǎn)生；分生孢子梗綠色，大小為20～38.3 μm，多分枝；分生孢子梗上多瓶梗，先端單生或簇生分生孢子；孢子呈綠色，光滑，橢圓形至球形，大小為3～5 μm。

圖2 2-63 菌株在不同培養(yǎng)基上培養(yǎng)的性狀及顯微結(jié)構(gòu)特征Fig.2 Culture and microstructure characteristics of 2-63 strain

2.1.2 菌種鑒定 采用真菌提取試劑盒提取2-63 菌株的DNA，測(cè)序后獲得序列在GenBank 上用BLAST 進(jìn)行同源性比對(duì)，挑選同源性≥98%的同屬近緣種，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。因通過(guò)BLAST 檢索獲取與2-63 相似度高的序列，能夠同時(shí)獲取ITS、TEF1和RPB2序列的菌株很少，因此將ITS序列構(gòu)建一個(gè)系統(tǒng)發(fā)育樹，將TEF1和RPB2序列聯(lián)合構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，再結(jié)合2-63 菌株的生物學(xué)性狀確定其歸屬。ITS序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)2-63 菌株與木霉屬親緣關(guān)系最近 (圖3)，TEF1和RPB2序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)2-63 菌株與T.samuelsii聚于同一個(gè)分支 (圖4)，所以將內(nèi)生菌株2-63 鑒定為塞繆爾斯木霉Trichoderma samuelsii，與莊文穎課題組[19]在相同培養(yǎng)條件下分離得到的菌株菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢特性等非常相似，與其不同的是，本研究中該菌株在人工合成低營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 (SNA) 上培養(yǎng)不產(chǎn)生椰子芳香氣味。

圖3 2-63 菌株基于ITS 基因序列的NJ 系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Neighbor-joining phylogenetic tree of 2-63 strain based on ITS gene sequences

圖4 2-63 菌株基于TEF1 和RPB2 基因序列的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Neighbor-joining phylogenetic tree of 2-63 strain based on TEF1 and RPB2 gene sequences

2.2 T.samuelsii 2-63 菌株的抑菌活性

2.2.1T.samuelsii2-63 菌株對(duì)常見(jiàn)植物病原菌的拮抗作用 采用平板對(duì)峙法[21]測(cè)定了T.samuelsii2-63 菌株對(duì)8 種植物病原菌的拮抗活性，結(jié)果如圖5-A 所示，該菌株對(duì)供試的8 種植物病原真菌均具有較強(qiáng)的拮抗活性，對(duì)菌絲生長(zhǎng)的抑制率均達(dá)到70.0%以上。與對(duì)照組相比，該菌株對(duì)小麥赤霉病菌和枸杞黑霉病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制率最高，分別為85.7%和87.1%，抑制作用在前2 d 較弱，第3 d 后增強(qiáng)。圖5-B 清楚的展示了處理組較對(duì)照組而言，植物病原菌的菌絲生長(zhǎng)受到了T.samuelsii2-63 菌株明顯的限制。

圖5 T.samuelsii 2-63 菌株對(duì)植物病原菌的抑制率Fig.5 Antifungal activity of T.samuelsii 2-63 strain against plant pathogens

2.2.2 PDB 液體發(fā)酵后T.samuelsii2-63 菌株的抑菌活性 圖6 為不同發(fā)酵時(shí)間的T.samuelsii2-63菌株發(fā)酵原液的抑菌活性結(jié)果。從中可以看出，不同時(shí)間的發(fā)酵液對(duì)供試的7 種植物病原菌均具有一定的抑菌活性，但整體上抑菌率都低于30.0%。

圖6 T.samuelsii 2-63 菌株不同培養(yǎng)時(shí)間發(fā)酵原液對(duì)植物病原菌的抑菌活性Fig.6 Antifungal activity of fermentation broth of T.samuelsii 2-63 strain against plant pathogens at different culture times

圖7 為T.samuelsii2-63 菌株發(fā)酵液粗提物的抑菌活性結(jié)果。從中可以看出，粗提物整體上抑菌活性都較低，只對(duì)番茄灰霉病菌有一定的抑菌效果，50.0%左右。

圖7 T. samuelsii 2-63 菌株不同培養(yǎng)時(shí)間發(fā)酵液粗提物對(duì)植物病原菌的抑菌活性Fig.7 Antifungal activity of crude extracts of fermentation broth of T.samuelsii 2-63 strain at different culture time against plant pathogens

2.2.3T.samuelsii2-63 菌株揮發(fā)性有機(jī)化合物VOCs 的抑菌活性 為確定T.samuelsii2-63 菌株釋放的VOCs 對(duì)供試植物病原真菌生長(zhǎng)的影響，采用熏蒸法[23]測(cè)定了VOCs 對(duì)病原真菌的抑制率，結(jié)果如圖8 所示，與對(duì)照組相比，VOCs 對(duì)供試植物病原菌均表現(xiàn)出不同程度的抑制作用，抑制率為31.0%～68.5%。其中，對(duì)枸杞黑霉病菌和番茄灰霉病菌表現(xiàn)出較好的抑制活性，抑制率分別為68.5%和63.3%，表明VOCs 可能是該菌株發(fā)揮抑菌作用的關(guān)鍵成分。

圖8 T. samuelsii 2-63 菌株產(chǎn)生的VOCs 對(duì)植物病原菌的抑制活性Fig.8 Antifungal activity of volatile compounds from T.samuelsii 2-63 strain against plant pathogens

2.3 T.samuelsii 2-63 菌株抑菌活性成分的分析

2.3.1T.samuelsii2-63 菌株在平板培養(yǎng)條件下產(chǎn)生VOCs 的分析T.samuelsii2-63 菌株在PDA和CMD 培養(yǎng)基上均能產(chǎn)生椰子芳香氣味，因此本研究中將T.samuelsii2-63 菌株分別接種在PDA和CMD 培養(yǎng)基上連續(xù)培養(yǎng)1～18 d，利用GC-MS分析VOCs 的變化過(guò)程，結(jié)果如圖9 所示，從圖9-A 和9-B 可以看出，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，T.samuelsii2-63 菌株產(chǎn)生的VOCs 中有一個(gè)化合物含量也隨之增加，經(jīng)過(guò)NIST17 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索為6-戊基-2H-吡喃-2 酮 (6-PP)，結(jié)合前面的抑菌活性，6-PP 是VOCs 中的關(guān)鍵抗真菌化合物；從圖9-E可以看出，在PDA 和CMD 培養(yǎng)基上培養(yǎng)9～18 d，6-PP 在PDA 培養(yǎng)基上產(chǎn)量達(dá)到基本穩(wěn)定的最高水平，在CMD 培養(yǎng)基上達(dá)到一個(gè)稍微有波動(dòng)的較高水平，色譜圖上最大峰面積分別為96.0%和90.0%。但在CMD 培養(yǎng)基上，6-PP 產(chǎn)量從第18 天開始急劇下降。

圖9 T.samuelsii 2-63 菌株在下同培養(yǎng)基上產(chǎn)生的VOCs 及其化合物6-PPFig.9 VOCs and the compound 6-PP produced by T.samuelsii 2-63 strain on different media

2.3.2T.samuelsii2-63 菌株在固體發(fā)酵培養(yǎng)條件下產(chǎn)生6-PP 的分析T.samuelsii2-63 菌株利用大麥、大米及麥麩培養(yǎng)基固體發(fā)酵后，TLC 分析其粗提物中6-PP 的含量，如圖10 所示，除麥麩發(fā)酵后不產(chǎn)生6-PP 外，大麥和大米發(fā)酵后均可產(chǎn)生6-PP，因此選擇大米和大麥培養(yǎng)基發(fā)酵后的粗提物進(jìn)行HPLC 分析。

圖10 T.samuelsii 2-63 菌株利用不同固體培養(yǎng)基發(fā)酵后產(chǎn)生6-PP 的情況Fig.10 The production of 6-PP by T.samuelsii 2-63 strain after fermentation using different solid media

6-PP 的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：Y= 6694.8X+84.179，R2= 0.9941。將T.samuelsii2-63 菌株在大米和大麥培養(yǎng)基上產(chǎn)生的6-PP 結(jié)合TLC 結(jié)果，將得到的峰面積帶入上述標(biāo)準(zhǔn)方程，求得VOCs中6-PP 的質(zhì)量濃度如圖11 所示，總體上隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，大米和大麥兩種培養(yǎng)基上產(chǎn)6-PP的質(zhì)量濃度都呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)，在培養(yǎng)第16 d 其質(zhì)量濃度均達(dá)到最高，其中大米培養(yǎng)基上6-PP 為38.6 mg/mL，大麥培養(yǎng)基上為4.0 mg/mL。綜合上述結(jié)果，大米培養(yǎng)基更有利于T.samuelsii2-63 菌株產(chǎn)椰子香味物質(zhì)6-PP，可作為固體大量發(fā)酵的培養(yǎng)基。

圖11 T.samuelsii 2-63 菌株在大米和大麥培養(yǎng)基上產(chǎn)6-PP 的濃度隨時(shí)間的變化Fig.11 The variation of 6-PP concentration produced by T.samuelsii 2-63 stain in rice and barley media with time

2.3.3T.samuelsii2-63 菌株在淺層培養(yǎng)條件下產(chǎn)6-PP 的分析T.samuelsii2-63 菌株在PDB 培養(yǎng)基上淺層培養(yǎng)1～18 d，產(chǎn)生6-PP 的濃度參照

1.5.2 節(jié)的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算，結(jié)果如表1 所示。從中可以看出，在培養(yǎng)的前15 d，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加產(chǎn)生6-PP 的濃度也呈現(xiàn)增加趨勢(shì)，并于第15 d達(dá)到最高值，為0.1 mg/mL，之后逐漸下降，到18 d時(shí)只有第15 d 時(shí)的20.0%。

3 討論與結(jié)論

從寧夏固原地區(qū)生長(zhǎng)的百里香植株莖組織中分離得到內(nèi)生真菌2-63 菌株，將其分別接種在PDA、CMD 和SNA 培養(yǎng)基上，發(fā)現(xiàn)其在PDA 和CMD 培養(yǎng)基上生長(zhǎng)較快，且產(chǎn)生椰子香氣味，在SNA 培養(yǎng)基上生長(zhǎng)較慢，不產(chǎn)生椰子香氣味，培養(yǎng)至第7 d 產(chǎn)生綠色、光滑的分生孢子，孢子呈橢圓形至球形，大小為3～5 μm，分生孢子生于瓶梗的頂端，單生或著簇生。根據(jù)形態(tài)學(xué)和ITS、TEF1及RPB2基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹分析，將2-63 菌株鑒定為塞繆爾斯木霉Trichoderma samuelsii。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹 (圖3 和圖4)，塞繆爾斯木霉與Trichoderma hispanicum和Trichoderma junci的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系密切。但在形態(tài)學(xué)上，與T.samuelsii相比，T.hispanicum的瓶梗較短，分生孢子較大，T.junci在CMD 培養(yǎng)基上，不產(chǎn)生椰子氣味[19]。木霉菌因其環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)，廣泛分布于土壤、枯枝等[24]。據(jù)報(bào)道，木霉菌雖分布廣泛，但呈現(xiàn)出地理或氣候分布偏愛(ài)，比如我國(guó)西南部是木霉菌多樣性最高的地區(qū)，但哈茨木霉是我國(guó)華東地區(qū)的優(yōu)勢(shì)種等[25-26]。而塞繆爾斯木霉在中國(guó)首次于西藏地區(qū)發(fā)現(xiàn)，之后就是本文中發(fā)現(xiàn)于寧夏六盤山地區(qū)百里香植株中，從總體地域分布來(lái)看，塞繆爾斯木霉主要分布于地理環(huán)境較為貧瘠的地域。內(nèi)生菌在與植物長(zhǎng)期共處中，可形成互利共生的關(guān)系[27]，同時(shí)結(jié)合塞繆爾斯木霉的分布環(huán)境，百里香作為西北地區(qū)特色多年生半灌木植物，推測(cè)塞繆爾斯木霉在百里香莖中存在，可能與其共同適應(yīng)西北特殊生境，協(xié)助百里香抗逆境、抗脅迫以及抗病害能力有關(guān)。

近些年來(lái)，部分木霉菌株已成功應(yīng)用于植物病原真菌的防治，例如哈茨木霉用于防治鐮刀菌屬、鏈格孢菌屬等多種植物病原真菌[28-29]。本研究中，通過(guò)平板對(duì)抗法測(cè)定了T.samuelsii2-63 菌株對(duì)供試植物病原菌的拮抗活性。結(jié)果 (圖5) 表明，T.samuelsii2-63 菌株可抑制菌絲生長(zhǎng)，其中對(duì)小麥赤霉病菌和枸杞黑霉病菌的抑菌效果最好，其抑制率分別為85.7%和87.1%，抑制作用在前2 d 較弱，在第3 d 后較強(qiáng)。生物學(xué)特性觀察表明，T.samuelsii2-63 菌株在培養(yǎng)的第2 d 可以檢測(cè)到椰子芳香氣味，推測(cè)椰子芳香氣味成分可能和抑菌有關(guān)，為了驗(yàn)證這一假設(shè)，采用揮發(fā)性抗真菌試驗(yàn)評(píng)價(jià)了VOCs 對(duì)供試植物病原真菌生長(zhǎng)的影響。由圖8 可以看出，T.samuelsii2-63 菌株產(chǎn)生的VOCs 具有較強(qiáng)的抗真菌活性，對(duì)番茄灰霉病菌和枸杞黑霉病菌均有較好的抑制作用，抑制率分別為63.3%和68.5%，表明VOCs 是T.samuelsii2-63 菌株的關(guān)鍵抗真菌化合物。

有研究表明，一些木霉物種會(huì)產(chǎn)生具有“椰子香味”的化合物6-PP，具有抑菌活性。該化合物首次在綠色木霉的培養(yǎng)液中被檢測(cè)到，后來(lái)在康寧木霉和哈茨木霉中陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)[17]。本研究中，根據(jù)圖9 中的GC-MS 分析，結(jié)合前面的抑菌試驗(yàn)結(jié)果，確認(rèn)6-PP 是T.samuelsii2-63 菌株產(chǎn)生的 VOCs 中的主要成分，也是T.samuelsii2-63菌株的關(guān)鍵抗真菌化合物，表明6-PP 不僅具有“椰子香味”，還能抑制番茄灰霉病菌等病原菌的生長(zhǎng)，與文獻(xiàn)報(bào)道的6-PP 對(duì)植物病原真菌的抑制活性一致[30]。