張玲玲,房 林,李 琳,吳坤林,曾晶玨,張佳瑞,康 明,曾宋君**

(1.中國科學(xué)院華南植物園園藝中心,廣東廣州 510650; 2.中國科學(xué)院大學(xué),北京 100049; 3.中國科學(xué)院華南植物園,廣東省應(yīng)用植物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東廣州 510650)

兜蘭屬(Paphiopedilum)植物具有獨(dú)特的觀賞價(jià)值,是十分珍稀的高檔花卉,備受世界園藝界的關(guān)注,曾多次在世界性園藝博覽會(huì)上獲得大獎(jiǎng),是極具開發(fā)潛力的新興蘭花種類,市場(chǎng)巨大。兜蘭不僅花色豐富、花期持久,而且它的獨(dú)特之處在于其奇特的囊狀或盔狀唇瓣[1]。但是,兜蘭屬植物是世界上較瀕危的植物類群之一,其所有的野生種類均被列入《瀕危野生動(dòng)植物種國際貿(mào)易公約附錄Ⅰ》(CITES)而被禁止貿(mào)易[2]。中國在2021年發(fā)布的《國家重點(diǎn)保護(hù)野生植物名錄》[3]中,兜蘭屬除硬葉兜蘭(Paphiopedilummicranthum)和帶葉兜蘭(P.hirsutissimum)外,其他種全部被列為國家一級(jí)重點(diǎn)保護(hù)植物,同時(shí)被禁止采挖。由于兜蘭原生種的花色有限、環(huán)境適應(yīng)能力較差等原因,選育出花色豐富、適應(yīng)能力強(qiáng)的兜蘭新品種并進(jìn)行推廣,有利于降低對(duì)野生種類的需求,進(jìn)而減少過度采挖,可以從源頭上消減致危因素,實(shí)現(xiàn)對(duì)兜蘭的有效保護(hù)和可持續(xù)利用。我國兜蘭屬種質(zhì)資源豐富,為兜蘭新品種的選育提供了豐富的種質(zhì)資源。我國臺(tái)灣的兜蘭育種和產(chǎn)業(yè)化發(fā)展較好,但大陸地區(qū)的兜蘭育種工作進(jìn)展還較緩慢,具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的新品種較少。本文對(duì)兜蘭的育種技術(shù)研究進(jìn)展進(jìn)行綜述,并對(duì)各項(xiàng)技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行分析,以期為兜蘭高效育種提供參考。

1 兜蘭育種目標(biāo)

兜蘭育種的目標(biāo)在不同的發(fā)展時(shí)期發(fā)生著變化。19世紀(jì)至20世紀(jì)初,花色艷麗、花瓣和萼片大而圓整的標(biāo)準(zhǔn)型雜交種深受消費(fèi)者喜愛,隨后具有斑點(diǎn)的褐紅色摩帝型兜蘭成為育種的熱點(diǎn),此外,多花長瓣型兜蘭也曾是兜蘭育種的熱點(diǎn)[4]。兜蘭屬植物的育種目標(biāo)可歸納為以下6個(gè)方面。(1)花色?；ㄊ嵌堤m的主要觀賞部位,創(chuàng)造觀賞價(jià)值高的新花色是兜蘭育種的主要目標(biāo)[4]。我國的年宵花選育一般以紅色或者黃色為目標(biāo)。(2)花型。按照美國蘭花協(xié)會(huì)的標(biāo)準(zhǔn),兜蘭花型育種以選育圓整、寬闊、平整、齊滿以及各部分均勻?qū)ΨQ的花型為主要目標(biāo)[5]。(3)質(zhì)地。按照美國蘭花協(xié)會(huì)和臺(tái)灣蘭花產(chǎn)銷發(fā)展協(xié)會(huì)的評(píng)審規(guī)則,兜蘭優(yōu)良品種須具有較厚且蠟質(zhì)的花[5]。(4)觀賞期。維持較長的觀賞期始終是兜蘭新品種選育的重要目標(biāo),蠟質(zhì)花一般具有較長的花期。另外,可應(yīng)節(jié)開放對(duì)品種的商業(yè)化也非常重要。(5)香氣。香氣也是兜蘭育種的重要目標(biāo)。兜蘭屬植物大都沒有香氣,原生種中只有漢氏兜蘭(P.hangianum)、麻栗坡兜蘭(P.malipoense)和白花兜蘭(P.emersonii)具有香氣,它們是兜蘭花香育種的主要親本來源。華南植物園利用麻栗坡兜蘭和白花兜蘭選育出了帶有香味的綠韻兜蘭(P.‘Lvyun’,粵審花20170009)。(6)抗病、易開花、易栽培。兜蘭新品種培育的最終目標(biāo)是在市場(chǎng)上推廣,而培育出抗病、易開花、易栽培的優(yōu)良品種是推廣的基礎(chǔ)。

2 兜蘭種質(zhì)資源

兜蘭屬的野生種質(zhì)資源是新品種選育的根基。全世界目前已知共有兜蘭屬植物109種[6],中國是兜蘭屬植物分布較豐富的國家之一,《中國植物志》記載兜蘭屬植物有18種[7],《Flora of China》[8]和劉仲鍵等[9]在《中國兜蘭屬植物》中記載中國有兜蘭屬植物27種,Zhou等[10]在2021年報(bào)道中國兜蘭屬植物29種。產(chǎn)于中國的波瓣兜蘭(P.insigne)、紫毛兜蘭(P.villosum)、白旗兜蘭(P.spicerianum)和包氏兜蘭(P.villosumvar.boxallii)是參與雜交育種最多的親本,可謂 “超級(jí)親本”,它們分別產(chǎn)生了19 746、19 378、18 957和18 295個(gè)雜交后代,以上4種兜蘭的總后代數(shù)為20 536(并集關(guān)系),約占兜蘭總雜交后代數(shù)的73%[11]。

除了野生兜蘭種外,人工培育的兜蘭新品種也是極好的雜交親本,兜蘭育種的重要種質(zhì)資源同樣包括各種雜交種以及通過誘變和基因工程等方法培育產(chǎn)生的新品種和育種材料[12]。例如,P.‘Nitens’是1877年由Veitch苗圃利用波瓣兜蘭為母本、紫毛兜蘭為父本雜交育成的雜交種,其在隨后兜蘭的雜交育種中起到了重要的作用[13],產(chǎn)生了13 507個(gè)雜交后代[11];P.‘Leeanum’是1884年Lawrence利用波瓣兜蘭為母本、白旗兜蘭為父本培育出的雜交品種,以其為親本育成了14 504個(gè)雜交后代[11]。將培育的品種作為親本,可以形成連續(xù)的品種路線,發(fā)展特有的雜交品系,從而有利于較有計(jì)劃地達(dá)成育種目標(biāo)[11]。

3 兜蘭育種技術(shù)

3.1 引種馴化

與人工創(chuàng)造新品種相比,引種馴化時(shí)間短、見效快并且節(jié)省人力物力。制定育種計(jì)劃時(shí),首先要考慮引種馴化的可能性[12]。曾宋君[14]在國內(nèi)外兜蘭引種栽培的基礎(chǔ)上,以植株的生長狀況、整株姿態(tài)、葉片觀賞性、開花性、花形、花色和花朵觀賞期為評(píng)價(jià)指標(biāo),利用灰色關(guān)聯(lián)分析,對(duì)原產(chǎn)于我國的27種兜蘭屬植物的觀賞價(jià)值進(jìn)行綜合評(píng)價(jià),分析它們?cè)谌A南地區(qū)的應(yīng)用前景,并指出飄帶兜蘭(P.parishii)、白旗兜蘭和紫紋兜蘭(P.purpuratum)是最值得在華南地區(qū)推廣的兜蘭種類;帶葉兜蘭、亨利兜蘭(P.henryanum)、漢氏兜蘭、紫毛兜蘭等是值得在華南地區(qū)推廣的兜蘭種類。

3.2 雜交育種

雜交育種是選育蘭花新品種的重要方法,創(chuàng)造了巨大的蘭花產(chǎn)業(yè)。1978年,兜蘭雜交種在英國皇家園藝協(xié)會(huì)(RHS)登錄的數(shù)量突破了10 000種,并于2005年達(dá)到了20 000種,現(xiàn)在RHS登錄的兜蘭雜交種已有28 921個(gè)。在RHS登錄的雜交種數(shù)量上僅次于卡特蘭屬(Cattleya)的43 542個(gè)以及蝴蝶蘭屬(Phalaenopsis)的39 411個(gè)。參與登錄的育種機(jī)構(gòu)(個(gè)人)有1 854個(gè),登錄數(shù)量最多的前10個(gè)育種機(jī)構(gòu)(個(gè)人)主要來自美國、英國、日本,我國臺(tái)灣也在列,他們的特點(diǎn)是發(fā)展形成了自己的雜交品系[11]。我國大陸的兜蘭雜交育種工作才剛剛起步,華南植物園于2000年起進(jìn)行兜蘭的系統(tǒng)育種,已獲得雜交組合200多個(gè),其中,105個(gè)兜蘭新品種在RHS上進(jìn)行了登錄,18個(gè)兜蘭新品種通過了廣東省新品種審定或評(píng)定(內(nèi)部資料);中國科學(xué)院昆明植物研究所也選育出了諸多優(yōu)良的兜蘭新品種。

曾宋君[14]對(duì)兜蘭的雜交方法、親本選擇和種苗繁殖方法進(jìn)行了綜述。黃小艷等[15]對(duì)中國一級(jí)重點(diǎn)保護(hù)野生蘭科植物的雜種登錄情況、親本選擇、授粉及播種時(shí)期選擇、屬間雜交進(jìn)展、雜交育種存在的問題進(jìn)行綜述,指出在RHS上登錄最多的是兜蘭屬植物。曾宋君[14]認(rèn)為,兜蘭最佳的授粉時(shí)間一般為花開后1周,大部分兜蘭種子在授粉后4個(gè)月能萌發(fā),5-6個(gè)月達(dá)到萌發(fā)高峰。楊佳慧等[16]也對(duì)兜蘭的雜交方法進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)長瓣兜蘭(P.dianthum)在開花后6-34 d花粉活力和柱頭可授性最強(qiáng)。初美靜等[17]對(duì)綠肉餅兜蘭(P.‘Pacific Cocoa Lovely’)的研究表明,花粉活力隨開花時(shí)間呈現(xiàn)出從弱到強(qiáng)再到弱的趨勢(shì),開花后15-20 d花粉活力最大;其柱頭的可授性也隨開花時(shí)間呈現(xiàn)出先弱后強(qiáng)再變?nèi)醯内厔?shì),開花后10-20 d柱頭可授性最高。當(dāng)親本花期不遇時(shí),可將花粉用消毒的塑料管密封置4 ℃冰箱保存,曾宋君[14]對(duì)彩云兜蘭(P.wardii)、杏黃兜蘭(P.armeniacum)、同色兜蘭(P.concolor)、麻栗坡兜蘭、帶葉兜蘭、長瓣兜蘭的花粉于4 ℃低溫干藏1年后的活力進(jìn)行了檢測(cè),發(fā)現(xiàn)45%的杏黃兜蘭花粉具有活力,其他種類50%的花粉具有活力。在親本的選擇方面,曾宋君[14]認(rèn)為,以不同的兜蘭種為親本在RHS上登錄的雜交種數(shù)量存在巨大差異,這與它們的發(fā)表時(shí)間、觀賞價(jià)值和雜交親和性有關(guān)。波瓣兜蘭、白旗兜蘭、紫毛兜蘭和包氏兜蘭是4個(gè)最重要的原生種親本,它們的雜交后代占現(xiàn)今兜蘭品種的73%[11]。兜蘭原生種作為親本的開發(fā)程度相差較大,主流的原生親本主要是兜蘭亞屬(Subgen.Paphiopedilum),而對(duì)小萼亞屬(Subgen.Parvisepalum)的開發(fā)較少[11],此外,特殊親本對(duì)雜交育種非常重要[4]。除種質(zhì)資源的收集外,雜交育種工作的另一個(gè)重點(diǎn)是天然特殊個(gè)體的收集與保存以及人工特殊個(gè)體的誘導(dǎo)(多倍體誘導(dǎo)),這些不尋常的育種材料將對(duì)育種產(chǎn)生不可估量的作用。回顧整個(gè)育種史,育種家頻繁地使用白化、大花、抗病、斑點(diǎn)密集的個(gè)體,培育出了許多優(yōu)秀品種,如波瓣兜蘭的白化變種(P.insignevar.sanderainum),其花色素雅、通透,呈淡綠色,是重要的育種親本;魔帝兜蘭(P.‘Maudiae’)的親本就是胼胝兜蘭(P.callosum)和勞氏兜蘭(P.lawrenceanum)的白化變種。種苗繁育是兜蘭育種的基礎(chǔ),兜蘭雜交種子無菌播種存在萌發(fā)率低、成苗困難的問題,此方面技術(shù)難題的攻克對(duì)兜蘭育種非常重要。曾宋君等[18,19]對(duì)兜蘭屬植物的無菌播種、共生萌發(fā)和組織培養(yǎng)等離體快繁技術(shù)的進(jìn)展進(jìn)行了綜述,為以上問題的研究提供了參照。

遺傳規(guī)律可以為雜交育種提供依據(jù),從而進(jìn)行有選擇的親本選配,以達(dá)到育種目的。目前對(duì)兜蘭觀賞性狀遺傳規(guī)律的研究較少,只有對(duì)初代親本花色遺傳的研究。麥奮[20]認(rèn)為不同顏色的兜蘭在花色遺傳中起著不同的作用。曾宋君等[4]對(duì)兜蘭花色的初代遺傳進(jìn)行了總結(jié)。兜蘭花的質(zhì)地有蠟質(zhì)、紙質(zhì)和半紙質(zhì)之分,蠟質(zhì)花質(zhì)地較厚,有光澤,是優(yōu)良的觀賞性狀。本團(tuán)隊(duì)在研究中發(fā)現(xiàn)兜蘭花的質(zhì)地和花期具有關(guān)聯(lián)性,特別是在鮮切花方面。園林植物遺傳學(xué)中雖然已存在諸多對(duì)花色、彩斑、花徑、重瓣、株型和抗性的研究,但對(duì)花質(zhì)地的遺傳及形成機(jī)制的研究較少[12]。

目前,雜交育種是兜蘭的主要育種方法,兜蘭育種家通過雜交育種培育了幾乎全部的市售兜蘭新品種,也選育出了許多深受市場(chǎng)喜愛的新品種。兜蘭雜交育種存在一些自身難以解決的問題[4]:兜蘭雜交后代育性差;兜蘭雜交常出現(xiàn)基因連鎖,不良性狀基因常與優(yōu)良性狀基因連鎖遺傳,難以獲得理想的雜交后代;兜蘭雜交種子的萌發(fā)率低,兜蘭的無性克隆難度大;兜蘭雜交親本組合存在任意性,缺乏遺傳規(guī)律的指導(dǎo)等。兜蘭育種有必要在雜交育種以外,拓展育種途徑。

3.3 多倍體育種

多倍體育種是選育細(xì)胞核中具有3組以上染色體的優(yōu)良新品種的方法。多倍體具有巨大性,比起正常個(gè)體一般莖粗,葉寬厚、色深,花大、色艷,果實(shí)大、種子大而少,此外還具有可孕性低、適應(yīng)性強(qiáng)和有機(jī)合成速率提高的特點(diǎn),并可以克服遠(yuǎn)緣雜交的不育性。在人工新品種選育方面,多倍體育種是克服遠(yuǎn)緣雜交當(dāng)代不孕和遠(yuǎn)緣雜種不結(jié)實(shí)的重要方法,一般將多倍體視為超級(jí)親本。多倍體花卉一般具有花大、重瓣性強(qiáng)、花色濃艷等特點(diǎn),深受人們歡迎。因此選育多倍體對(duì)育種具有重要的意義,育種家常常有目的地選育多倍體。蝴蝶蘭育種的超級(jí)親本Phal.Doris和Phal.Zada均是雜交產(chǎn)生的四倍體,在已登錄的蝴蝶蘭雜交種中,90.2%具有Phal.Doris血統(tǒng),43.5%具有Phal.Zada血統(tǒng)[21,22]。

誘導(dǎo)多倍體的方法主要有物理方法和化學(xué)方法。誘導(dǎo)多倍體的物理方法包括利用各種射線、高速離心力和溫度等進(jìn)行處理;化學(xué)方法是用秋水仙素、水合氯醛、笑氣、富民隆等進(jìn)行處理[12]。1937年秋水仙素的發(fā)現(xiàn)開創(chuàng)了多倍體育種的新時(shí)代。除秋水仙素外,除草劑也是一類有效的多倍體誘導(dǎo)化學(xué)試劑,如氨磺靈(Oryzalin)和氟樂靈(Trifluralin)對(duì)一些植物離體多倍體的誘導(dǎo)率比秋水仙素高,且對(duì)植株的傷害程度比秋水仙素輕微。除草劑誘導(dǎo)多倍體形成的機(jī)制和秋水仙素一樣,也是干擾紡錘體的形成,但在低濃度下具有比秋水仙素更高的微管蛋白解聚能力。氨磺靈具有與微管蛋白的高親和力及對(duì)細(xì)胞器Ca2+運(yùn)輸系統(tǒng)的干擾能力,這使得氨磺靈具有更強(qiáng)的微管解聚能力,其對(duì)四倍體的誘導(dǎo)頻率比秋水仙素高[23,24]。多倍體的鑒定采用形態(tài)觀察、氣孔觀察、流式細(xì)胞儀分析和染色體計(jì)數(shù)相結(jié)合的方法[25]。

兜蘭的多倍體育種研究較少。Huy等[25]用秋水仙素處理長1.5 cm、有2-3片葉子的紫毛兜蘭試管苗,在秋水仙素濃度為50 μmol/L、浸泡法處理6 d時(shí)的變異率最高(19.88%),存活率為65.19%。在Huy等[25]的研究中,秋水仙素的處理方法是先將秋水仙素用最小體積的酒精溶解(秋水仙素濃度為90%),再用無菌水定容到需要的濃度,過濾滅菌。秋水仙素的處理濃度設(shè)置為0、2、10、50 μmol/L,處理時(shí)間設(shè)置為0、3、6、9 d。將不同體積的秋水仙素溶液添加到經(jīng)過高壓滅菌的SH液體培養(yǎng)基中,混勻。將誘變材料(1.5 cm長的兜蘭試管苗)浸泡到以上含有秋水仙素的SH液體培養(yǎng)基中,并暗處理至相應(yīng)時(shí)間。處理完成后將幼苗用無菌水沖洗干凈,然后接種到添加0.5 mg/L NAA、0.5 mg/L BA、30 g/L蔗糖、9.0 g/L瓊脂和1.0 g/L AC的SH培養(yǎng)基上進(jìn)行壯苗培養(yǎng),最后在3個(gè)月后進(jìn)行死亡率統(tǒng)計(jì)和多倍體檢驗(yàn)。蘭花多倍體育種主要在石斛蘭屬(Dendrobium)、蝴蝶蘭屬(Phalaenopsis)、大花蕙蘭(Cymbidiumhybrid)等的育種工作上應(yīng)用較多,這可為兜蘭育種提供參考。蘭花多倍體育種使用的誘變劑主要是秋水仙素,除草劑類誘變劑應(yīng)用較少;誘導(dǎo)方法主要為浸泡法,其次是混培法;誘變材料主要是原球莖、類原球莖和叢生芽。秋水仙素濃度多設(shè)置為0.01%-0.20%;浸泡法處理時(shí)間多設(shè)置在12-72 h,混培法處理時(shí)間多設(shè)置在10-40 d;不同的蘭花種類、誘變材料、誘變劑濃度和誘變時(shí)間,多倍體的誘變率不同。

3.4 化學(xué)誘變育種

化學(xué)誘變育種是利用化學(xué)誘變劑誘發(fā)植物產(chǎn)生遺傳變異,以選育新品種的技術(shù)。化學(xué)誘變的機(jī)理是誘變劑的活性基團(tuán)與遺傳物質(zhì)發(fā)生一系列化學(xué)反應(yīng),從而引起遺傳物質(zhì)的改變?；瘜W(xué)誘變具有專一性的特點(diǎn),由于特定的化學(xué)藥劑僅對(duì)某個(gè)堿基或幾個(gè)堿基有作用,因此化學(xué)誘變可改變單一不良性狀,且保持其他優(yōu)良性狀不變?；瘜W(xué)誘變簡(jiǎn)單易行,價(jià)格低廉?；瘜W(xué)誘變具有遲發(fā)性,即誘變?cè)诋?dāng)代往往不表現(xiàn),在后代中才表現(xiàn)出新的性狀改變,因此,化學(xué)誘變育種一般至少需要兩代的培育和選擇,才能獲得性狀穩(wěn)定的新品種。與輻射誘變相比,化學(xué)誘變劑具有特異性,即變異的定位程度比輻射高,誘發(fā)的突變性狀有明顯的專一性,具有與輻射不同的誘變譜。化學(xué)誘變劑對(duì)生物分子的影響是個(gè)別的、局部的,不利作用小?；瘜W(xué)誘變?cè)趫@林植物遺傳育種中有廣泛的應(yīng)用,育種家們采用該方法已選育出了許多優(yōu)良的品種[12]。甲基磺酸乙酯(EMS)是最常用的強(qiáng)誘變劑。1943年,Oehlkcers用EMS誘發(fā)月見草(Denotherabiennis)、百合(Liliumbrownii)及風(fēng)鈴草(Companulamedium)產(chǎn)生染色體畸變[12]。EMS主要與鳥嘌呤作用,在嘌呤環(huán)的N-7上接上烷基,造成G-C向A-T的轉(zhuǎn)換或T-A向C-G的顛換。誘變劑對(duì)植物生長的抑制作用與劑量成正比,其M2(Mutation)的突變率與M1植株表現(xiàn)的抑制作用成正比,因此可通過誘變劑抑制生長試驗(yàn)確定其適宜劑量[12,26]。

目前,未見化學(xué)誘變?cè)诙堤m育種方面的應(yīng)用,其他蘭花種類的化學(xué)誘變育種可以為兜蘭化學(xué)誘變育種的開展提供非常有益的參考。據(jù)羅維宇等[27]報(bào)道,化學(xué)誘變育種至少已在蘭屬(Cymbidium)、石斛蘭屬、蝴蝶蘭屬等6個(gè)屬13個(gè)蘭花種中開展,至少已獲得葉色改變、矮化、抗病、抗寒等突變體206個(gè)。羅維宇等[27]發(fā)現(xiàn)根狀莖、原球莖和類原球莖等中間繁殖體是常用的誘變材料,浸泡法是最常用的處理方法,并發(fā)現(xiàn)對(duì)蘭花中間繁殖體進(jìn)行化學(xué)誘變時(shí)EMS的常用濃度為0.05%-1.00%,NaN3濃度為2.0-8.0 mmol/L。

3.5 輻射誘變育種

輻射誘變育種是利用電離輻射使植物的遺傳物質(zhì)發(fā)生突變,并從中選擇培育新品種的方法。輻射誘變育種可以提高突變頻率(比自然界的突變頻率提高100倍甚至1 000倍以上),擴(kuò)大突變譜,誘發(fā)產(chǎn)生自然界中尚未出現(xiàn)或者很少的新類型,為新品種選育提供非常豐富的原始材料。另外輻射后代分離少、穩(wěn)定快,可縮短育種年限。輻射誘變育種還能改變品種單一的不良性狀,而保持其他優(yōu)良性狀不變。此外輻射誘變育種還可增強(qiáng)抗逆性,改良品質(zhì)。同時(shí)輻射誘變育種能克服遠(yuǎn)緣雜交的不親和性。輻射誘變育種的缺點(diǎn)是突變方向不確定,目前很難人為控制;有益突變還比較低,有時(shí)發(fā)生逆突變,恢復(fù)原來的性狀等,所以將輻射誘變育種與其他育種方法結(jié)合,會(huì)獲得更好的效果[12,26]。

在輻射誘變育種技術(shù)中,輻射源、輻射材料、劑量和劑量率是影響輻射效果的重要因素。目前蘭花育種使用的輻射源有γ射線、X射線、快中子、熱中子和重離子等,使用最多的是γ射線和重離子,與γ射線輻射相比,碳重離子輻射的植株突變頻率更高,突變譜更寬[26]?？熘凶诱丈浣M織電離密度大,常常產(chǎn)生大的突變,在同樣的劑量條件下,快中子輻射產(chǎn)生的突變率較高[26],目前蘭花快中子輻射誘變育種還較少。蘭花輻射材料多為原球莖、根狀莖等中間繁殖體;輻射劑量多采用半致死劑量(LD50)。

兜蘭的輻射誘變育種相關(guān)研究較少。孫音等[28]研究了60Co-γ輻射對(duì)兜蘭組培苗的誘變效應(yīng),確定了種子的半致死劑量為6.29 Gy、不定芽的半致死劑量為5.00 Gy、小苗的半致死劑量為20.00 Gy。兜蘭種子在萌發(fā)階段和不定根分化階段需要適宜的低輻射劑量,不定芽增殖階段和小苗階段需要的劑量較高。隨著輻射劑量的增大,種子發(fā)芽率、不定芽增殖率、不定根分化率、小苗生長勢(shì)下降,變異增多。孫音等[28]的研究結(jié)果表明在合適的輻射劑量下,60Co-γ輻射誘導(dǎo)的兜蘭組培苗變異性狀明顯,效果穩(wěn)定。兜蘭輻射誘變育種的開展可以參考其他蘭花種類的相關(guān)方法。據(jù)羅維宇等[27]報(bào)道,迄今至少已在蘭屬、蝴蝶蘭屬、石斛蘭屬等13個(gè)屬44種蘭花中開展了物理誘變育種研究,獲得了突變體716個(gè),培育出了小蘭嶼蝴蝶蘭‘飛蘭’(Phalaenopsisequestris‘Feilan’)等蘭花新品種12個(gè),其中葉色的突變出現(xiàn)頻率最高,表明通過輻射誘變選育蘭花葉色變異新品種的成功率高。高祥云[29]用重離子輻射雜交蘭‘君豪蘭’,培育出了性狀穩(wěn)定的‘線藝君豪蘭’新品種。高祥云[29]也研究了重離子輻射對(duì)雜交蘭的誘變效應(yīng),發(fā)現(xiàn)重離子輻射完全抑制了雜交蘭‘小鳳蘭’根狀莖和雜交蘭‘君紅蘭’類原球莖的分化,這種抑制作用直到第6代都沒有恢復(fù),并且發(fā)現(xiàn)60 Gy重離子輻射的‘小鳳蘭’組培苗擴(kuò)增出兩條多態(tài)性條帶,多態(tài)率是2.0%。周亞倩等[30]使用不同劑量的60Co-γ射線處理樹蘭(Epidendrumsecundum)蒴果,確定了樹蘭種子萌發(fā)的最佳劑量為20 Gy。李威[31]對(duì)60Co-γ輻射小蘭嶼蝴蝶蘭(Ph.equestris)的種質(zhì)創(chuàng)新與機(jī)制進(jìn)行了探索,并申報(bào)了3個(gè)新品種。馬麗婭[32]對(duì)蝴蝶蘭60Co-γ射線輻射植株組織培養(yǎng)及性狀遺傳進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)低劑量輻射遺傳穩(wěn)定性較好,高劑量輻射遺傳穩(wěn)定性較差。孫曉莉[33]對(duì)蝴蝶蘭60Co-γ射線誘變育種進(jìn)行了初步研究,發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)中4個(gè)蝴蝶蘭品種的最佳輻射劑量分別是30、15、25和25 Gy。章寧等[34]使用15 Gy60Co-γ射線處理了蝴蝶蘭的原球莖或幼苗,獲得了一系列誘變的幼苗,經(jīng)組織培養(yǎng)和生根移植后,成活率高達(dá)90%。張相鋒[35]對(duì)蝴蝶蘭原球莖誘導(dǎo)及輻射對(duì)原球莖增殖和分化的影響進(jìn)行了研究,初步確定了60Co-γ 射線對(duì)蝴蝶蘭原球莖的半致死劑量是50-68 Gy。張銀潔等[36]使用快中子脈沖堆對(duì)蝴蝶蘭進(jìn)行了輻射處理,篩選出了蝴蝶蘭原球莖的半致死劑量是2.50×1011-3.50×1011cm-2。張銀潔等[37]也利用快中子脈沖堆對(duì)蝴蝶蘭不同品種原球莖和幼苗莖段進(jìn)行輻射處理,分析得到了‘火鳥’(Doritaenopsis‘Taisuco Firebird ’)原球莖的半致死劑量為3.28×1011cm-2,‘內(nèi)山姑娘’(D.‘Neyshan guniang’)原球莖的半致死劑量為 4.06×1011cm-2,‘火鳥’莖段的半致死劑量為2.24×1011cm-2,‘內(nèi)山姑娘’莖段的半致死劑量為2.30×1011cm-2。

3.6 分子育種

與雜交育種和誘變育種相比,分子育種具有定向性,可以有計(jì)劃地定向改造生物,創(chuàng)造新品種。由于兜蘭愈傷組織難以誘導(dǎo)且類原球莖再生體系不易建立,兜蘭遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立還在探索中。Luo等[38]以魔帝兜蘭(P.‘Maudiae’)無菌播種120 d形成的原球莖為受體材料,對(duì)受體材料的處理方式、農(nóng)桿菌侵染時(shí)間、共培養(yǎng)基中乙酰丁香酮的添加濃度以及共培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)行條件優(yōu)化試驗(yàn),初步建立了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的魔帝兜蘭原球莖遺傳轉(zhuǎn)化體系。羅白雪[39]采用子房注射法將農(nóng)桿菌直接注射到兜蘭的子房中,成功誘導(dǎo)出了轉(zhuǎn)基因植株,研究表明注射時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化效率影響顯著,一般選擇雙受精時(shí)期的子房,這是由于雙受精后的合子具有再生及轉(zhuǎn)化能力的感受態(tài)細(xì)胞,容易接受外源DNA,轉(zhuǎn)化成功率高。Li等[40]繪制了同色兜蘭×帶葉兜蘭的高密度遺傳連鎖圖譜,確定了4個(gè)葉片數(shù)量性狀的基因位點(diǎn)。其他蘭科植物的分子育種技術(shù)可以為兜蘭提供參考。蘭科植物遺傳轉(zhuǎn)化的受體材料通常選擇類原球莖、原球莖和愈傷組織[41,42],也可選擇根狀莖[43]、子房[38,44]等作為受體材料。遺傳轉(zhuǎn)化體系在蝴蝶蘭、文心蘭(Oncidium)[45]、石斛蘭[46]和國蘭(Cymbidium)[42,43,47]等蘭科植物中均有成功的報(bào)道。賈思思等[48]對(duì)近年來蘭花基因組測(cè)序、主要育種目標(biāo)性狀分子遺傳基礎(chǔ)、基因克隆以及轉(zhuǎn)基因、基因編輯、分子標(biāo)記輔助選擇育種技術(shù)等方面的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述。

4 展望

在育種目標(biāo)方面,目前兜蘭市售品種并不多,而且大都價(jià)格昂貴,觀賞價(jià)值高得多花種類單苗售價(jià)多在千元以上,消費(fèi)人群并不多。兜蘭育種應(yīng)當(dāng)以走向市場(chǎng)、走進(jìn)民眾生活為目標(biāo),豐富市場(chǎng)品種供應(yīng),形成合適的市場(chǎng)價(jià)格。種質(zhì)資源是兜蘭育種的物質(zhì)基礎(chǔ),兜蘭育種單位都很重視種質(zhì)資源的收集,加強(qiáng)保育技術(shù)、提高兜蘭種質(zhì)資源保育的可持續(xù)性至關(guān)重要。在育種技術(shù)方面,目前兜蘭主要采用雜交育種,多倍體育種、化學(xué)誘變育種、輻射誘變育種和分子育種的應(yīng)用還較少。以上技術(shù)在其他園林植物以及國蘭、蝴蝶蘭、石斛蘭、文心蘭、萬代蘭(Vanda)等蘭花的育種工作中已經(jīng)取得了顯著的成績,兜蘭育種家應(yīng)當(dāng)拓寬育種技術(shù)。在兜蘭雜交育種方面,我國大陸地區(qū)在親本的選擇上存在隨機(jī)性,沒有形成自己的育種路線和品系。另外對(duì)遺傳規(guī)律的研究較欠缺,在兜蘭的多倍體育種、化學(xué)誘變育種、物理誘變育種方面,當(dāng)前應(yīng)當(dāng)開展相關(guān)的試驗(yàn)和探索,建立高效的誘變技術(shù)體系、突變體篩選和鑒定技術(shù)體系,并加強(qiáng)相關(guān)誘變機(jī)理的研究。在分子育種方面,當(dāng)前主要是建立遺傳轉(zhuǎn)化體系。兜蘭各項(xiàng)育種技術(shù)的基礎(chǔ)都是組織培養(yǎng)技術(shù),而兜蘭的組織培養(yǎng)難度大,應(yīng)當(dāng)加強(qiáng)技術(shù)攻關(guān)。