丁 雨，吳 艷，卞 濤

南京醫(yī)科大學(xué)附屬無錫人民醫(yī)院 呼吸與危重癥科，江蘇 無錫 214023

中性粒細胞是對抗入侵病原體的第一道防線，同時也是參與適應(yīng)性免疫應(yīng)答、急性損傷修復(fù)、腫瘤等發(fā)生發(fā)展的免疫細胞。中性粒細胞受刺激后，可通過吞噬、脫顆粒等方式發(fā)揮作用；近年來發(fā)現(xiàn)中性粒細胞是以還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酶依賴為主要方式釋放裝飾有抗菌顆粒蛋白的解凝染色質(zhì)而發(fā)揮作用的，并將其稱為中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)(neutrophil extracellular traps,NETs)，這一過程被稱為“NETosis”。最初發(fā)現(xiàn)NETs時，認為其主要發(fā)揮中性粒細胞的傳統(tǒng)功能，即殺滅病原體和對抗感染，但越來越多的研究表明大量中性粒細胞的NETs反應(yīng)與許多疾病的不良預(yù)后有關(guān)，特別是新型冠狀病毒肺炎/感染(corona virus disease 2019,COVID-19)、細菌性肺炎、慢性阻塞性肺疾病、支氣管哮喘和肺部轉(zhuǎn)移性腫瘤等肺部疾病。

1 中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)(NETs)概述

1.1 中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)(NETs)的形成

NETs首次于2004年被發(fā)現(xiàn)并描述，病原體侵入肺部時，活化的中性粒細胞發(fā)揮抗感染的作用，除吞噬、脫顆粒外，同時也釋放出NETs[1]。至今為止，除病原體外，佛波酯(phorbol-12-myristate-13-acetate，PMA)、脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte-macro-phage colony-stimulating factor，GM-CSF)、一氧化氮、自身免疫相關(guān)抗體以及血小板等均可刺激中性粒細胞發(fā)生NETosis。刺激因素不同，NETs成分有差異，但NETs始終包含一組固定的蛋白質(zhì)，如中性粒細胞彈性蛋白酶(neutrophil elastase，NE)、髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)、瓜氨酸組蛋白 3 (citrul-line histone 3，CITH3)、鈣保護素、α-防御素、抗菌肽和細胞骨架蛋白質(zhì)等[2]。

中性粒細胞受到刺激后，細胞膜上受體如G蛋白偶聯(lián)受體(G-protein coupled receptors,GPCRs)，趨化因子和細胞因子受體、Toll樣受體(Toll-like receptors,TLR)和Fc受體將信號傳入細胞內(nèi)，氧化產(chǎn)物的上游分子Raf-MEK-ERK通路啟動，隨后的下游信號NADPH氧化酶復(fù)合物激活。NETs的形成依賴于細胞骨架重排、糖酵解產(chǎn)生的ATP與線粒體功能障礙和NADPH氧化酶復(fù)合物激活狀態(tài)下產(chǎn)生的高濃度活性氧(reactive oxygen species，ROS)[3]。ROS產(chǎn)生后，NE從膜相關(guān)復(fù)合物解離到細胞質(zhì)中，并以依賴MPO的方式激活其蛋白水解活性,隨后，NE轉(zhuǎn)位進入細胞核，NE和MPO驅(qū)動染色質(zhì)解凝和組蛋白切割，這可以由依賴肽?；彼崦搧啺访?(peptidylarginine deiminase 4，PAD4)的組蛋白瓜氨酸化支持,此外，也有NE和PAD4各自獨立參與的途徑被描述[4]。抑制白細胞信號抑制受體-1可以在不影響氧化產(chǎn)物的情況下阻止NETs的產(chǎn)生,最終的細胞裂解和NETs釋放涉及GasderminD，它能夠在顆粒和質(zhì)膜上形成孔，染色質(zhì)和抗菌蛋白組成的混合物以囊泡的形式從中性粒細胞釋放到胞外，形成NETs，這種NETs的形成最終導(dǎo)致細胞死亡，通常被描述為溶解性NET釋放或NETosis,此過程一般需要3～8 h,是NETs形成的主要方式[5]。

1.2 中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)(NETs)的降解

NETs可以被脫氧核糖核酸酶(DNase)降解，生理量的DNase不足以在體外完全降解NETs，樹突狀細胞和巨噬細胞在NETs的降解中發(fā)揮著重要作用，巨噬細胞以依賴抗菌肽LL-37復(fù)合物的方式吞噬NETs，巨噬細胞對NETs的降解依賴于TREX1(也稱為DNaseⅢ)、DNase1和DNase1L3，其中，DNase1L3由樹突狀細胞產(chǎn)生,DNase1L3與DNaseI一起成為重要的細胞外NETs降解核酸酶，TREX1參與巨噬細胞吞噬NETs后的細胞內(nèi)降解[6]。關(guān)于NETs這些細胞外結(jié)構(gòu)的具體清除機制，目前所知甚少。因此，探索NETs清除和降解的機制可能有助于理解炎性反應(yīng)和自身免疫性疾病，并為未來的治療提供新思路。

2 中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)(NETs)與感染性肺部疾病

2.1 抑制NETs可有效控制病毒感染

在感染性肺部疾病中，NETs的產(chǎn)生增強和清除不足是導(dǎo)致組織損傷的關(guān)鍵驅(qū)動因素，當(dāng)前的COVID-19大流行背景突出了探索NETs的重要性。COVID-19危重患者血清誘導(dǎo)NETs釋放[7]，NETs與炎性反應(yīng)嚴重程度和免疫介導(dǎo)的微血栓相關(guān)，并且可預(yù)測不良預(yù)后[8]。

首先，在病毒入侵和輕微癥狀的初始階段，NETs的主要成分NE從細胞表面切割S蛋白進入細胞，增強病毒的感染性[9]。同時中性粒細胞產(chǎn)生過量的ROS，加重免疫反應(yīng)。ROS進一步促進NETs的產(chǎn)生，NETs捕獲病毒并阻止其傳播。在涉及凝血異常和呼吸道癥狀的第二階段，NETs的細胞外陽離子組蛋白，發(fā)揮細胞毒活性，促進IL-1β的生成，并通過激活TLR2、TLR4和TLR9介導(dǎo)促炎作用[10]。NETs能增強各種細胞因子的產(chǎn)生，包括IL-1β和TNF-α，以增強炎性反應(yīng)。此外，IL-1β和TNF-α作為主要激活因子，誘導(dǎo)IL-6水平升高[11]。NETs成分也可以通過炎性小體激活物和損傷相關(guān)分子模式(damage associated molecular patterns，DAMPs)介導(dǎo)補體激活促進炎性反應(yīng),導(dǎo)致細胞凋亡和纖維化,近期發(fā)現(xiàn)，SARS-CoV-2可通過血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(angiotensin converting enzyme 2,ACE2)和絲氨酸蛋白酶活性軸刺激中性粒細胞釋放NETs, NETs直接誘導(dǎo)肺上皮細胞死亡[12]。在全身血栓形成和炎性反應(yīng)的第三階段，隨著炎性反應(yīng)進一步增強，更多的中性粒細胞被招募，巨噬細胞清除NETs的能力受損，二者共同導(dǎo)致了高水平的NETs。NETs的抗菌肽LL-37和MPO引起免疫細胞趨化并使巨噬細胞極化成M1型巨噬細胞，巨噬細胞分泌促炎物質(zhì)加重炎性反應(yīng)和肺損傷[13]。此外，NETs通過TLR4/TLR9/NF-κB信號通路觸發(fā)巨噬細胞中NLRP3炎性小體激活和IL-1β釋放,隨后，大量的細胞因子又反過來促進了NETs的產(chǎn)生[14]。表明作用于巨噬細胞的NETs與促炎細胞因子的增加有關(guān)，而促炎細胞因子導(dǎo)致了NETs形成的失調(diào)，進一步形成細胞因子風(fēng)暴，維持異常的全身炎性反應(yīng)。

事實上，抑制中性粒細胞和NETs在各種流感病毒相關(guān)急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)中具有保護作用，其他大流行性病毒，包括H1N1流感、SARS冠狀病毒和中東呼吸綜合征冠狀病毒，都與感染部位的中性粒細胞浸潤和ARDS的發(fā)展有關(guān)。因此，抑制NETs是治療包括COVID-19在內(nèi)的病毒性感染的一個潛在治療靶點。

2.2 細菌降解NETs實現(xiàn)免疫逃逸

NETs在幾種與細菌相關(guān)的肺部疾病中發(fā)揮抗感染的作用，一些細菌已經(jīng)進化出了避免被NETs捕獲和殺死的策略。例如：銅綠假單胞菌是臨床上導(dǎo)致院內(nèi)感染的重要條件[15]，嚴重的銅綠假單胞菌感染在免疫功能低下的個體中普遍存在，包括中性粒細胞減少、嚴重?zé)齻⒛倚岳w維化和慢性阻塞性肺疾病患者，此外，銅綠假單胞菌導(dǎo)致的機械通氣相關(guān)肺炎在危重患者導(dǎo)致高發(fā)病率和病死率。銅綠假單胞菌分泌大量的胞外蛋白酶，使其能夠逃脫宿主的免疫攻擊，如彈性蛋白酶和堿性蛋白酶(AprA)。AprA是一種由Ⅰ型分泌系統(tǒng)分泌的金屬蛋白酶。首先，AprA降解NETs組分，幫助介導(dǎo)銅綠假單胞菌的免疫逃逸。其次，AprA誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體，抗體作為激動劑，又增強AprA的活性，進一步幫助逃脫，但銅綠假單胞菌逃脫NETs殺傷的更加確切的機制尚不明確[16]。因此，針對其他銅綠假單胞菌產(chǎn)生的酶抗體是否也有類似的效應(yīng)，還有待進一步研究。

3 中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)(NETs)與慢性氣道炎性疾病

3.1 慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)

COPD發(fā)病率、病死率和所致的經(jīng)濟負擔(dān)是全球共同關(guān)注的重大問題,中性粒細胞被認為是COPD患者氣道炎性反應(yīng)的關(guān)鍵介質(zhì)。尤其是Ig樣凝集素F (SiglecF)中性粒細胞在加重氣道炎性反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。空氣污染物通過細胞外三磷酸腺苷傳遞DAMP信號誘導(dǎo)中性粒細胞上SiglecF的表達，中性粒細胞釋放NETs和產(chǎn)生半胱氨酰白三烯來促進2型和3型免疫應(yīng)答，加重COPD氣道炎性反應(yīng)[17]。

目前，使用支氣管擴張劑和糖皮質(zhì)激素是治療COPD主要的治療方法。在慢性炎性反應(yīng)的整個過程中，COPD患者的嚴重程度與氣道內(nèi)NETs水平呈正相關(guān)，因此，新型NETs靶向療法可能是治療COPD的一種富有前景的方法，但直接靶向NETs是否能抑制COPD患者的病情發(fā)展，目前尚不清楚。

3.2 支氣管哮喘

支氣管哮喘是一種慢性氣道炎性反應(yīng)起關(guān)鍵作用的異質(zhì)性疾病,當(dāng)各種過敏原刺激機體時，循環(huán)中的中性粒細胞在IL-6、IL-8等細胞因子的誘導(dǎo)下聚集到氣道浸潤并激活[18]。LPS誘導(dǎo)形成的NETs可以直接或間接地損傷了肺上皮緊密連接蛋白occludin，加劇中性粒細胞為主導(dǎo)的過敏性氣道炎性反應(yīng)的嚴重程度，由此推斷NETs可能是通過破壞肺上皮的緊密連接參與嚴重哮喘發(fā)病機制[19]。NETs也刺激巨噬細胞分泌IL-1β，促進中性粒細胞在氣道的浸潤，浸潤的中性粒細胞產(chǎn)生NETs，可放大NETs和巨噬細胞造成的組織損傷，誘導(dǎo)和加重中性粒細胞型哮喘(neutrophil-dominated asthma，NA)，即NETs通過巨噬細胞促進NA發(fā)病[20]。此外，嗜酸細胞胞外陷阱(eosinophil extracellular traps，EETs)與嗜酸粒細胞型哮喘嚴重程度有關(guān)，EETs通過整合免疫和神經(jīng)信號以推動哮喘進展[21]。

在治療方面，研究發(fā)現(xiàn)哮喘以循環(huán)中CITH3增加為特征，這可能與細胞胞外陷阱(ETs)形成有關(guān)。抑制ETs可能是特定哮喘表型(如中性粒細胞哮喘)的治療選擇，這也為治療哮喘提供了新的思路。

4 中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)(NETs)與腫瘤相關(guān)性肺部疾病

在小鼠和人類中，中性粒細胞是主要的白細胞群體，中性粒細胞在腫瘤生長和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要作用。晚期肺癌和結(jié)腸癌患者體內(nèi)循環(huán)NETs水平升高，利用小鼠肺癌和結(jié)腸癌模型，發(fā)現(xiàn)阻斷NETosis顯著抑制肺和肝臟的自發(fā)轉(zhuǎn)移。此外，乳腺癌細胞分泌的組織蛋白酶C(tumor-secreted protease cathepsin C，CTSC)通過調(diào)節(jié)中性粒細胞的募集和NETs的形成促進了乳腺到肺的轉(zhuǎn)移。同時揭示了一個有趣的新途徑，CTSC激活中性粒細胞膜結(jié)合蛋白酶3(PR3)，從而促進IL-1β加工和NF-κB活化，最終上調(diào)IL-6和CCL3促進中性粒細胞募集。CTSC-PR3-IL-1β軸誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生和NETs的形成，這可促進腫瘤細胞在肺部的轉(zhuǎn)移，抑制CTSC可以抑制實驗性肺轉(zhuǎn)移[22]。但目前尚不清楚靶向CTSC-PR3-IL-1β-NET通路的療效是否僅限于防止肺轉(zhuǎn)移，還是也可以防止其他組織的轉(zhuǎn)移,該研究為今后的臨床相關(guān)研究指明了方向。

除了發(fā)現(xiàn)NETs在癌轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用外，肺癌細胞釋放損傷相關(guān)分子模式高遷移率族蛋白B1(HMGB1)，HMGB1也促進了NETs的形成[23]。肺癌中細胞外RNA和NETs存在交互作用，非小細胞肺癌細胞比正常肺泡細胞有更高水平的和NETs相關(guān)的lncRNA,經(jīng)NETs刺激后，lncRNA表達明顯增加,共12種NETs相關(guān)的lncRNA可以作為預(yù)測非小細胞肺癌患者生存的分子標(biāo)志物[24]。

綜上所述，表明NETs靶向治療可能限制轉(zhuǎn)移和原發(fā)性肺癌，這些已在小鼠模型中得到證實。但同時，人類中性粒細胞和小鼠中性粒細胞釋放NETs的能力明顯不同，在研究腫瘤NETosis(中性粒細胞的炎性細胞死亡方式)時應(yīng)考慮物種間差異，并且目前為止還沒有臨床試驗來評估靶向NETs對癌進展的影響。這些開創(chuàng)性的發(fā)現(xiàn)還需開展臨床試驗，以確定NETs靶向療法是否可以減少轉(zhuǎn)移。

5 問題與展望

自發(fā)現(xiàn)NETs，關(guān)于NETs的形成和作用機制在肺部疾病中的研究越來越多，新型冠狀病毒疫情的暴發(fā)更進一步推動了該方面的研究。NETs發(fā)揮著雙刃劍作用：NETs在疾病的早期階段發(fā)揮抗感染作用，然而，在疾病的晚期階段，NETs的抗菌成分不再能夠?qū)垢腥荆窃斐勺陨斫M織損傷，因此，維持NETs平衡成為治療肺部疾病的關(guān)鍵，促進研發(fā)更多潛在藥物，如選擇性NETs形成抑制劑或NETs相關(guān)蛋白抑制劑等，可以防止NETs對患者的有害影響，這可能將成為新興的治療手段。此外，目前的體外研究，多數(shù)是以非生理因素如PMA觸發(fā)的實驗結(jié)果，很可能不能代表體內(nèi)的情況，并且在同一疾病的不同階段，對NETs的研究很少，因此，進行更多的關(guān)于NETs對不同時期肺部疾病的研究也有助于加強對肺部疾病發(fā)病機制的理解，指導(dǎo)未來治療的發(fā)展。