王 琴，張曉艷，劉雪婷，李炳蔚，李宏偉，楊義力，韓建群*

1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 微循環(huán)研究所，北京 100005；2.國際遺傳工程和生物技術(shù)中心中國區(qū)域研究中心(泰州)，江蘇 泰州 225300

高血壓是心血管疾病進展的主要危險因素[1]。近年來的研究認為，高血壓可導(dǎo)致腸道屏障功能受損[2]，使小腸硬度增加，炎性反應(yīng)升高。慢性炎性反應(yīng)可導(dǎo)致腸道微循環(huán)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能異常，包括內(nèi)皮細胞功能障礙，糖萼降解，血液流變學(xué)和血管反應(yīng)性改變，以及微血管結(jié)構(gòu)的變化，如血管生成和血管重構(gòu)。這些變化都可能影響微循環(huán)血流灌注，最終導(dǎo)致器官功能性毛細血管密度下降，并影響氧氣的輸送。微血管內(nèi)皮細胞(microvascular endothelial cell, MVEC)在調(diào)節(jié)和維持微血管張力中發(fā)揮著重要作用，高血壓時MVEC功能異?？赡苁俏⒀h(huán)功能障礙的重要原因。激光多普勒血流儀(laser Doppler flowmetery, LDF)可以無創(chuàng)地評估組織微循環(huán)血流灌注[3]。LDF血流信號的頻譜分析能夠揭示血流在頻率0.009 5～1.6 Hz間發(fā)生的振蕩，進而反映調(diào)控微血流的不同生理機制。小波變換是一種可對LDF血流灌注信號進行時頻分析的方法[4]。

杜仲(EucommiaulmoidesOliv.，EU)為中國特有的多年生落葉喬木，屬于杜仲科杜仲屬，廣泛分布于中國的山西、甘肅、浙江、河南，湖北，四川，貴州和云南等地。在東亞地區(qū)，尤其是中國，韓國和日本，傳統(tǒng)中藥杜仲(CortexEucommiae)常指杜仲的干燥樹皮，被用于治療腰椎間盤突出、膝痛、骨質(zhì)疏松、高血壓等在內(nèi)的多種疾病[5-6]。此外，杜仲黃酮類通過Nrf2信號通路降低氧化型谷胱甘肽(GSSG)濃度和GSSG/GSH的比值，降低了小腸氧化應(yīng)激水平，進而改善了仔豬的腸道功能[7]。松脂醇二葡萄糖苷(pinoresinol diglucoside，PDG)是從杜仲樹皮中分離出來的主要木脂素之一，具有抗炎、降壓、預(yù)防骨質(zhì)疏松等多種藥理作用[8]。然而，到目前為止，尚未有研究從微循環(huán)角度報道闡述杜仲的降壓作用。

本文旨在探討全杜仲膠囊(Quanduzhong Jiaonang, QDZJN)和PDG對自發(fā)性高血壓大鼠(spontane-ously hypertensive rats, SHRs)腸壁微循環(huán)激光多普勒血流信號的影響，同時利用小波變換分析與此相關(guān)的生理調(diào)控機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及試劑

1.1.1 實驗動物：SPF級雄性的6只正常血壓Wistar-Kyoto(WKY)大鼠和30只自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rats, SHRs),7～8周齡，體質(zhì)量175～195 g，由北京維通利華實驗動物有限公司提供[動物檢疫許可證號：SCXK(京)2016-0006]。所有大鼠均飼養(yǎng)于溫度:21～25 ℃，濕度:45%～65%，12 h明暗交替的環(huán)境中。期間，均自由飲水和進食。

1.1.2 試劑:全杜仲膠囊(QDZJN)(國藥準(zhǔn)字Z20055116，產(chǎn)品批號200101)，每粒含0.48 g棕褐色粉末狀內(nèi)容物(相當(dāng)于原藥材2.5 g)，由江西普正藥業(yè)集團股份有限公司生產(chǎn)。本品采用加熱回流法結(jié)合煎煮法提取杜仲中包括松脂醇二葡萄糖苷和綠原酸在內(nèi)的活性成分，其中，每粒含松脂醇二葡萄糖苷(PDG)(C32H42O16)≥1.25 mg。松脂醇二葡萄糖苷(PDG純度>98%)購自成都瑞芬思生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 大鼠的分組及處理：將30只SHRs隨機分為SHR，SHR+QDZJN，SHR+PDG (L)，SHR+PDG (M)和SHR+PDG (H)組，每組6只。對照組(control/WKY)為6只WKY大鼠。其中，對照組和SHR組大鼠行純凈水灌胃。SHR+QDZJN，SHR+PDG (L)，SHR+PDG (M)和SHR+PDG (H)組則進行相應(yīng)藥物灌胃。使用純凈水溶解QDZJN粉末，按照1.15 g/kg體質(zhì)量，灌胃容量15 mL/kg體質(zhì)量進行灌胃。PDG (L)，PDG(M)和PDG(H)的給藥劑量分別為8.75 mg/kg，17.5 mg/kg和35 mg/kg。每日灌胃一次，連續(xù)灌胃2個月。

1.2.2 大鼠尾動脈血壓測量：使用智能無創(chuàng)鼠尾血壓計(Softron BP-2010A，日本)對大鼠尾動脈收縮壓(systolic blood pressure, SBP)和舒張壓(diastolic blood pressure, DBP)進行測量并記錄。

1.2.3 大鼠腸壁激光多普勒血流信號檢測和血流成像分析：灌胃2天后檢測。將麻醉后的大鼠取仰臥位固定于加熱墊上，刮除腹部毛發(fā)，先后用碘酒和含75%酒精的棉球消毒腹部皮膚后，沿腹部中線剪開一個長度約3～4 cm切口，找到回盲部，輕拉一段小腸腸袢。使用高功率針式激光多普勒血流檢測儀(laser Doppler flowmetry, LDF； Moor VMS，Moor Instruments公司)，配套VP4探頭，對腸壁血流灌注(blood perfusion)、血流速度(blood speed)及紅細胞濃度紅細胞濃度(RBC concentration)進行定量監(jiān)測。使用激光多普勒血流成像系統(tǒng)(Doppler perfusion imaging,LDPI;moor LDI-HIR，Moor Instruments公司)進行腸壁的血流成像分析，使用mLDI Version 5.3軟件對血流灌注水平進行分析。

1.2.4 小波變換(wavelet transform)：對灌胃2個月后的大鼠進行檢測。由于大鼠腸壁的激光多普勒信號是非線性的，且信號振蕩的頻率范圍廣。因此，對于低頻率區(qū)需要高的頻率分辨率，高頻區(qū)需要良好的時間分辨率。在Morlet母小波的基礎(chǔ)上進行連續(xù)小波變換，實現(xiàn)時域和頻域的最優(yōu)化。因此，小波變換可將激光多普勒血流信號轉(zhuǎn)換為代表不同生理調(diào)控機制的5個特征性頻段，其中，0.009 5～0.02、0.02～0.06、0.06～0.15 Hz、0.15～0.4 Hz和0.4～1.6 Hz分別代表了內(nèi)皮源性、神經(jīng)源性、肌源性、呼吸源性和心源性對微血流灌注的貢獻。采用儀器自帶的Moor VMS PC 3.1軟件將經(jīng)過小波變換后的LDF血流信號生成二維頻譜圖和三維時-頻圖。由于內(nèi)皮細胞在調(diào)控微血管張力方面的重要作用，本研究比較了各組大鼠腸壁一氧化氮(nitric oxide, NO)依賴性和非依賴性的內(nèi)皮源頻段特征。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 全杜仲膠囊和PDG對SHRs血壓的影響

各組大鼠尾動脈SBP和DBP在治療前差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。QDZJN或PDG治療1個月后， SHR組的SBP和DBP均顯著高于WKY組(P<0.001)，QDZJN和高劑量(H)PDG治療1個月均可顯著降低SHRs的SBP和DBP(圖1)。

*P<0.001 compared with WKY group； #P<0.05, ##P<0.01, ###P<0.001 compared with SHR group; 1 mmHg=0.133 kPa

2.2 全杜仲膠囊和PDG對SHRs腸壁微血流灌注的影響

與WKY大鼠相比，SHRs的腸壁血流灌注水平顯著降低(P<0.001)，QDZJN和各劑量PDG治療2個月后，SHRs大鼠腸壁血流灌注顯著升高。此外，LDPI可以檢測微循環(huán)中營養(yǎng)血管(毛細血管)和非營養(yǎng)血管(微動脈、微靜脈和動-靜脈吻合支)的血流灌注情況。與對照組相比，SHRs腸壁血流灌注顯著降低(P<0.01)，全杜仲膠囊和中、高劑量PDG治療2個月后，SHRs腸壁血流灌注顯著增加(圖2)。

A.microcirculatory blood perfusion of intestinal walls detected by LDF;C.LDPI, B,D.their quantification analysis; *P<0.01, **P<0.001 compared with WKY group； #P<0.01, ##P<0.001 compared with SHR group

2.3 全杜仲膠囊和PDG對SHRs腸壁微循環(huán)血流速度和紅細胞濃度的影響

與對照組相比，SHRs腸壁微血流速度顯著加快(P<0.001)，QDZJN和中、低劑量PDG治療2個月后，SHRs腸壁微血流速度顯著降低(均P<0.001)，恢復(fù)至與對照組相當(dāng)?shù)乃?。而高劑量PDG則進一步加快了SHRs腸壁微血流速度(P<0.001)(圖3A，B)。與WKY大鼠相比，SHRs腸壁微血管紅細胞濃度顯著升高(P<0.001)(圖3C,D)， QDZJN和各劑量PDG治療2個月后，SHRs腸壁微血管紅細胞濃度則顯著降低(均P<0.001)，并且，QDZJN和中、高劑量PDG治療2個月后紅細胞濃度恢復(fù)至正常水平。

A,B.microcirculatory blood speed; C,D.blood cell concentration of intestinal walls detected by LDF their quantification analysis(B, D)； *P<0.001 compared with WKY group； #P<0.001 compared with SHR group

2.4 全杜仲膠囊和PDG對SHRs腸壁微循環(huán)血流灌注內(nèi)皮源頻段幅值的影響

圖4A和4B分別為各組大鼠腸壁LDF血流灌注信號經(jīng)過小波變換后的二維頻譜圖和三維時-頻圖。SHRs腸壁LDF信號頻譜圖特征峰分布規(guī)律與WKY組明顯不同。對內(nèi)皮細胞源頻段進行統(tǒng)計學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，與WKY大鼠相比，SHRs腸壁的NO依賴性和非依賴性內(nèi)皮細胞源頻段幅值均顯著降低。QDZJN和各劑量PDG治療2個月后，SHRs腸壁的NO依賴性內(nèi)皮細胞源頻段幅值均顯著升高(圖4C)。同樣地，QDZJN和各劑量PDG治療2個月后，SHRs腸壁的NO非依賴性內(nèi)皮細胞源頻段幅值均顯著回升(圖4D)。同時，三維時-頻圖顯示，SHRs腸壁內(nèi)皮細胞源頻段(箭頭示)幅值低于對照組，QDZJN和各劑量PDG治療2個月可顯著改善SHRs腸壁內(nèi)皮細胞源頻段幅值(圖4B)。

A.mean amplitude-frequency spectrum; B.3-D time-frequency spectrum; comparisons of NO-dependent (C) and NO-independent (D) endothelial components among 6 groups； *P<0.01 compared with control group; #P<0.05, ##P<0.01, ###P<0.001, ####P<0.0001 compared with SHR group

3 討論

杜仲抗高血壓的相關(guān)藥理學(xué)機制包括抑制cAMP活性和Ca2+內(nèi)流，調(diào)節(jié)NO和腎素-血管緊張素系統(tǒng)，舒張血管和增加冠狀動脈血流[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，全杜仲膠囊和35 mg/kg PDG治療一個月可顯著降低SHRs的血壓，此結(jié)果與其他研究結(jié)果一致[10]。然而， 治療兩個月后， 二者的降壓效果不顯著。其原因可能與給藥方式、全杜仲膠囊和PDG的使用劑量有關(guān)[11-12]。

高血壓可使腸道屏障功能受損，繼而導(dǎo)致慢性低水平炎性進展。慢性炎可導(dǎo)致腸道微循環(huán)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能障礙。本研究結(jié)果表明，與血壓正常的WKY大鼠相比，SHRs腸壁微血流灌注水平顯著降低。QDZJN和各劑量PDG治療2個月后，SHRs腸壁血流灌注水平顯著升高。此外，SHRs腸壁微血流速度明顯高于WKY大鼠，QDZJN和中、低劑量PDG治療2個月后，微血流速度顯著降低。局部組織血流量的調(diào)控是通過調(diào)節(jié)毛細血管管徑(微血管容積)或阻力血管舒縮(血流速度)來實現(xiàn)[13]。高血壓時，外周器官血流灌注降低，而真毛細血管血流代償性增加，以改善外周器官的供血和供氧，因此，血流速度加快。同時，微血管收縮，微血管容積降低。微血管血流速度的加快和血管容積的降低共同導(dǎo)致SHRs腸壁血流灌注水平降低。高血壓時，紅細胞聚集和血漿黏度的改變是外周血管阻力增加的主要血液流變學(xué)因素。同樣地，本研究發(fā)現(xiàn)，SHRs腸壁微血管紅細胞濃度顯著升高。QDZJN和各劑量PDG可顯著降低腸壁的微血管紅細胞濃度。內(nèi)皮功能障礙是原發(fā)性高血壓的主要特征之一[14]。本研究發(fā)現(xiàn)， SHRs腸壁內(nèi)皮源性頻段幅值顯著低于WKY大鼠，QDZJN和PDG治療可顯著改善該頻段幅值。

綜上所述，SHRs腸壁存在微血流灌注異常和微血管內(nèi)皮功能障礙，QDZJN和PDG治療可顯著改善SHRs腸壁的微血流灌注和微血管內(nèi)皮功能。