陳穎棋 劉保君 宓軼群 徐世芬 李珊珊△

(1.上海中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院2021級博士研究生，上海 201203；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬市中醫(yī)醫(yī)院針灸科，上海 200071)

圍絕經(jīng)期是每位女性生殖衰老的必經(jīng)階段，自生育期的規(guī)律月經(jīng)逐漸過渡到永久性無月經(jīng)即絕經(jīng)狀態(tài)[1]。圍絕經(jīng)期的本質(zhì)是卵巢功能衰竭，卵巢內(nèi)儲備的始基卵泡減少到閾值以下，進(jìn)而生殖激素水平波動變化，并表現(xiàn)為月經(jīng)紊亂、生育能力下降、潮熱、情緒不穩(wěn)定、睡眠障礙等絕經(jīng)的一系列臨床癥狀，患各種慢性疾病的風(fēng)險逐漸升高[2]。圍絕經(jīng)期綜合征癥狀可遷延數(shù)年，給患者生活和工作造成極大的困擾，嚴(yán)重危害女性的身心健康，對圍絕經(jīng)期相關(guān)疾病的研究成為社會發(fā)展的迫切需要[3]。

合適的圍絕經(jīng)期動物模型是開展圍絕經(jīng)期綜合征及遠(yuǎn)期疾病相關(guān)研究的重要前提。根據(jù)不同的動物造模方法可大致分為自然老化的病因模型，摘除或部分摘除卵巢(去勢)和酒精損傷卵巢的病理模型，以及去勢后加以藥物或施以行為致動物出現(xiàn)某種特定的圍絕經(jīng)期綜合征癥狀的病癥結(jié)合模型[4]，其中，4-乙烯基環(huán)己烯二環(huán)氧化物(VCD)誘導(dǎo)的卵巢早衰(POF)動物模型與人類生殖內(nèi)分泌和組織學(xué)變化更為相似。此外，還有射線療法損傷卵巢模型、藥物誘導(dǎo)模型和免疫模型等應(yīng)用相對較少的圍絕經(jīng)期動物模型[5]，這些造模方法側(cè)重不同的病因?qū)W，僅適用于某些實(shí)驗(yàn)研究，具有一定的局限性。VCD給藥模擬卵巢衰竭模型副作用小、給藥方便、經(jīng)濟(jì)高效，保留卵巢組織的完整性，更符合人類從絕經(jīng)前期到圍絕經(jīng)期，再到絕經(jīng)后的過程，因此成為目前較為理想的圍絕經(jīng)期動物模型[5-8]，并得到了廣泛的應(yīng)用。本文針對VCD動物模型的構(gòu)建與應(yīng)用及對中藥治療VCD圍絕經(jīng)期動物模型相關(guān)疾病的進(jìn)展進(jìn)行詳細(xì)闡述，以期為圍絕經(jīng)期動物實(shí)驗(yàn)研究提供理論支持與參考依據(jù)。

1 VCD誘導(dǎo)卵巢衰竭模型的構(gòu)建

VCD是工業(yè)化合物4-乙烯-1-環(huán)己烯(VCH)的環(huán)氧代謝物，通常作為汽車輪胎、殺蟲劑、增塑劑和阻燃劑等化學(xué)合成物的副產(chǎn)物被釋放到環(huán)境中，可對人體造成健康危害[9-11]。VCD最早在1994年被列入第七次致癌物質(zhì)年度報告名單中，證實(shí)其對嚙齒類動物(大鼠和小鼠)有致癌性，可引起雌性小鼠的卵巢腫瘤[12]。VCD是VCH卵毒性的主要活性形式[11,13]，體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)表明VCD可能是通過增加凋亡蛋白B細(xì)胞淋巴瘤-2相關(guān)X蛋白(Bax)、B細(xì)胞淋巴瘤-2- 細(xì)胞死亡拮抗蛋白(Bad)的表達(dá)及Bax/B細(xì)胞淋巴瘤-長亞型蛋白(Bcl-xl)在線粒體膜上的比例，誘導(dǎo)細(xì)胞色素C(Cyt C)從線粒體向細(xì)胞質(zhì)擴(kuò)散，放大凋亡信號，激活并增加半胱氨酸蛋白酶3(Caspase-3)的表達(dá)和活性，引發(fā)Caspase級聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)而加速竇前小卵泡閉鎖(凋亡)[14-16]。

VCD誘導(dǎo)加速卵巢衰竭模型可以選擇成年、青春期或老年雌性小鼠或大鼠作為造模的動物，主要品系有C57BL/6、SD、B6C3F1和Fischer 344[8,17-19]。VCD誘導(dǎo)圍絕經(jīng)期動物模型的成功構(gòu)建與給藥途徑、劑量及持續(xù)時間密切相關(guān)，通常以玉米油或芝麻油作為VCD的溶劑，采用皮下或腹腔注射中高劑量濃度(80 mg/kg或160 mg/kg)的VCD進(jìn)行連續(xù)(15天)給藥，給藥結(jié)束后30天內(nèi)是研究卵泡變化及給予干預(yù)措施的窗口期，30～60天是研究圍絕經(jīng)期相關(guān)器官疾病的最佳時期[20-22]。

2 VCD誘導(dǎo)圍絕經(jīng)期相關(guān)疾病動物模型的應(yīng)用

2.1 心血管疾病 雌激素有助于調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，降低血液黏稠度，保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞，抑制炎癥因子的釋放，在預(yù)防心血管疾病中發(fā)揮重要作用[23]。圍絕經(jīng)期女性體內(nèi)雌激素水平降低，增加了患心血管疾病的風(fēng)險。

VCD誘導(dǎo)卵巢衰竭模型能模擬從圍絕經(jīng)期逐漸過渡到絕經(jīng)期體內(nèi)性激素的生理變化，同時把生殖衰老和年齡因素獨(dú)立開來，可以在任何起點(diǎn)對老鼠進(jìn)行VCD干預(yù)，是研究圍絕經(jīng)期心血管疾病易感性合適的臨床前嚙齒動物模型[24]。Fernandes R[25]發(fā)現(xiàn)給雌性小鼠注射VCD后，小鼠在第60天和第120天時表現(xiàn)出發(fā)情周期中斷和無發(fā)情周期，這種逐漸過渡到圍絕經(jīng)期狀態(tài)模擬了體內(nèi)激素環(huán)境的生理變化，避免了使用去勢模型出現(xiàn)的雌激素突然喪失對研究圍絕經(jīng)期過渡到絕經(jīng)期階段心臟功能變化的影響，包括心肌細(xì)胞分子和雌激素受體調(diào)節(jié)的變化。

2.2 絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松 雌激素參與人體的骨代謝，調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的活動，絕經(jīng)后雌激素缺乏會抑制骨的形成，造成骨丟失與骨強(qiáng)度降低[26]，進(jìn)而演變成骨質(zhì)疏松。與其他絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松模型相比，VCD誘導(dǎo)的卵巢衰竭模型更符合人類自然絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松情況。

Wright L E等[27]將小鼠去勢模型與VCD誘導(dǎo)模型對骨骼的影響進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，雖然兩種造模方法均可導(dǎo)致骨質(zhì)疏松，但VCD模型組較去勢模型組骨丟失緩慢，且血漿中的雄烯二酮水平明顯高于去勢模型小鼠，因此，他們認(rèn)為雄烯二酮是骨質(zhì)丟失較慢的主要原因。Lukefahr A L等[28]在保留完整下丘腦-垂體-卵巢軸的前提下，利用VCD誘導(dǎo)SD雌性大鼠，觀察圍絕經(jīng)期激素變化與骨密度之間的關(guān)系，結(jié)果顯示卵泡刺激素(FSH)、抑制素A的水平與骨密度損失關(guān)系密切，其中抑制素A最可能是介導(dǎo)骨丟失過程的關(guān)鍵激素。Kalam A等[29]通過VCD誘導(dǎo)瑞士品系白化雌性小鼠絕經(jīng)的模型證明，抗骨質(zhì)疏松藥物雷洛昔芬可以預(yù)防和減輕絕經(jīng)后乳腺癌治療藥物來曲唑引起的骨質(zhì)流失。

2.3 圍絕經(jīng)期動脈粥樣硬化 研究表明，雌激素-去乙?；?SIRT1)-內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)通路在卵巢衰竭引起的動脈老化與動脈粥樣硬化方面發(fā)揮關(guān)鍵作用[30-31]。圍絕經(jīng)期女性體內(nèi)雌激素水平降低，可導(dǎo)致血管舒縮功能失調(diào)和血脂調(diào)節(jié)作用下降，以及脂質(zhì)在大中血管內(nèi)膜沉積，加速動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展。VCD誘導(dǎo)的卵泡耗竭模型與卵巢切除模型(OVX)聯(lián)合用于低密度脂蛋白受體缺陷(LDLR-/-)小鼠的動脈粥樣硬化研究發(fā)現(xiàn)，在給予高膽固醇飲食120天后再給予外源性雌二醇(E2)處理，結(jié)果顯示VCD+E2組無名動脈和主動脈動脈的粥樣硬化病變區(qū)面積均小于OVX+E2組，說明在動脈粥樣硬化病變發(fā)展過程中，卵巢的內(nèi)分泌狀態(tài)會影響外源性E2的效應(yīng)[32]，而VCD模型給研究圍絕經(jīng)期卵巢功能狀態(tài)與動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展這兩者之間的關(guān)系提供了機(jī)會。

2.4 圍絕經(jīng)期阿爾茲海默病(AD) 內(nèi)源性雌激素受體α(ERα)和受體β(ERβ)分布在下丘腦、杏仁核及腦海馬、皮層和嗅葉中，均與認(rèn)知功能相關(guān)[33]。研究表明，E2水平缺乏會導(dǎo)致淀粉樣蛋白β(Aβ)和大腦皮質(zhì)中淀粉樣前體蛋白(APP)的升高，繼而失去神經(jīng)保護(hù)作用，圍絕經(jīng)期雌激素與雌激素受體反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)的廣泛波動變化是增加女性大腦對AD易感性的基礎(chǔ)。有學(xué)者認(rèn)為，低劑量VCD誘導(dǎo)的加速卵巢功能衰竭(AOF)模型不會對除了卵巢以外的器官及組織產(chǎn)生影響，也不會透過血腦屏障[34]。因此，利用該模型驗(yàn)證圍絕經(jīng)期對AD影響的關(guān)鍵分子機(jī)制、激素替代療法的臨床療效以及前期從OVX模型得出的結(jié)果具有重要意義[35]。Golub M S等[36]首次成功使用VCD在APPswe2576轉(zhuǎn)基因小鼠中誘導(dǎo)卵巢萎縮，并用野生型(WT)鼠作為對照縱向研究AD認(rèn)知功能，由于這些小鼠的存活率低(30%)，因此無法有效評估雌激素對水迷宮結(jié)果的影響，也未發(fā)現(xiàn)有卵巢萎縮或雌激素治療的影響。

2.5 其他圍絕經(jīng)期繼發(fā)疾病 國內(nèi)學(xué)者主要把VCD模型用于研究早發(fā)性卵巢功能不全，國外學(xué)者還將VCD模型運(yùn)用到腫瘤[37-38]、糖尿病腎病[39]、絕經(jīng)后癲癇[40]等研究中，都顯示VCD模型造模成功。

3 VCD誘導(dǎo)圍絕經(jīng)期動物模型在中醫(yī)藥治療的應(yīng)用

3.1 中藥治療VCD誘導(dǎo)的圍絕經(jīng)期動物模型相關(guān)疾病 Zhao F等[41]利用不同濃度更年春方(GNC)湯劑給VCD雌性SD大鼠灌胃30天后發(fā)現(xiàn)，高劑量GNC組顯著增加了VCD大鼠的卵巢指數(shù)，并維持原始卵泡和初級卵泡的數(shù)量，顯著增加卵巢蛋白激酶B(Akt)磷酸化和下游FOXO3a的表達(dá)，促凋亡蛋白表達(dá)顯著降低，說明GNC可以通過激活A(yù)kt信號通路和減少細(xì)胞凋亡來保護(hù)卵巢儲備而免受VCD誘導(dǎo)產(chǎn)生的卵毒性。Li M等[42]證明了護(hù)陽養(yǎng)坤方(HYYKF)聯(lián)合胚胎干細(xì)胞移植的方法可通過抑制轉(zhuǎn)化生子因子β1(TGF-β1)/TGF-β活化激酶1(TAK1)通路的表達(dá)促進(jìn)卵泡發(fā)育，進(jìn)而改善VCD誘導(dǎo)的POF小鼠的卵巢功能，療效優(yōu)于單獨(dú)使用HYYKF或胚胎干細(xì)胞移植。Nam E Y等[43]采用VCD體外誘導(dǎo)中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO-K1)和人類卵巢顆粒腫瘤細(xì)胞(COV434)制備細(xì)胞毒性模型，證實(shí)了吳茱萸提取物可通過激活A(yù)kt相關(guān)通路拮抗VCD的卵毒性，有助于預(yù)防POF或環(huán)境因素引起的原因不明的不孕癥。Kim D等[44]研究顯示，包含菟絲子、續(xù)斷和吳茱萸的湯藥(STH-KP17001)STH-KP17001可改善VCD誘導(dǎo)AOF模型引起的抑郁和焦慮行為，穩(wěn)定小鼠的皮質(zhì)醇水平，并恢復(fù)小鼠額葉皮層中腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達(dá)。Wang Y等[45]通過12周齡ICR雌性小鼠VCD模型證實(shí)，杏仁核基底外側(cè)復(fù)合體(BLA)中5-羥色胺受體1A(5-HT1Ar)等下調(diào)導(dǎo)致5-HT缺乏是焦慮行為形成的原因，而E2改善圍絕經(jīng)期和絕經(jīng)后焦慮可能是通過促進(jìn)5-HT實(shí)現(xiàn)的。VCD對卵巢高度的選擇性則有利于圍絕經(jīng)期焦慮、抑郁相關(guān)研究中中樞及外周機(jī)制相關(guān)指標(biāo)的觀察，進(jìn)而得出更可靠的結(jié)果。

雌激素作為女性體內(nèi)一種重要的激素，參與了全身的糖脂代謝，在預(yù)防心血管疾病、糖尿病及高血壓等方面發(fā)揮重要作用。Xing X等[46]利用高脂飲食喂養(yǎng)VCD給藥的Wistar大鼠誘導(dǎo)圍絕經(jīng)期高血脂癥，研究中藥復(fù)方丹知青娥方(DZQE)對圍絕經(jīng)期脂質(zhì)代謝的影響，經(jīng)過給大鼠不同濃度的DZQE灌胃給藥8周后發(fā)現(xiàn)，DZQE組血清E2、睪酮(T)濃度升高，F(xiàn)SH、黃體生成激素(LH)濃度降低；血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)濃度降低，表明DZQE可以改善圍絕經(jīng)期的卵巢功能和脂質(zhì)代謝。相比于高脂飲食大鼠，單純VCD注射大鼠體內(nèi)的游離脂肪酸和TC明顯增加[47]，證明卵巢功能減退加速了代謝綜合征的發(fā)生和發(fā)展，可見VCD模型是研究圍絕經(jīng)期繼發(fā)代謝綜合征的理想動物模型。

中藥本身不是激素，但是具有類激素的作用。中藥與激素替代療法聯(lián)合治療POF不僅可以提高臨床有效率，還可以降低激素治療引起的各種不良反應(yīng)的發(fā)生率，長期療效明顯，具有較高的臨床應(yīng)用價值[48]。

3.2 針灸治療VCD誘導(dǎo)的圍絕經(jīng)期動物模型相關(guān)疾病 針灸治療VCD誘導(dǎo)的POF研究報道較少，有效證據(jù)不足。有學(xué)者對電針治療POF進(jìn)行病例序列研究給出初步探索性結(jié)果，認(rèn)為電針療法在恢復(fù)POF患者的月經(jīng)周期、調(diào)整和改善患者激素水平方面具有較大的潛力[49]。王偉明等[50]采用VCD誘導(dǎo)POF大鼠模型，采用低頻電針刺激中髎穴和天樞穴，結(jié)果顯示可以抑制卵巢組織胰島素樣生長因子1型受體(IGF-1R)mRNA的表達(dá)，進(jìn)而改善卵巢功能。其他利用穴位埋線或手針的方法治療雷公藤多苷和環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的POF模型研究結(jié)果顯示，對改善POF鼠的激素水平和發(fā)情周期效果良好[51-52]。

4 結(jié)語

VCD是一種具有卵毒性的工業(yè)化合物，體外細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)或?qū)嶒?yàn)鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)均已證明VCD可以特異性殺死原始卵泡和初級卵泡，破壞卵巢儲備并導(dǎo)致POF。VCD存在顯著的劑量依賴性，大劑量連續(xù)給藥對卵巢的破壞程度嚴(yán)重，給關(guān)于圍絕經(jīng)期綜合征癥狀表現(xiàn)、激素水平變化與卵巢衰竭程度關(guān)系的研究提供良好條件。VCD模型雌激素水平有明顯的劑量和時間效應(yīng)，故此模型的另一個優(yōu)點(diǎn)是允許縱向研究激素水平與衰老之間的關(guān)系而不受動物年齡的影響。此外，VCD不會對除了卵巢以外的器官和組織產(chǎn)生明顯的毒性作用，同時該模型還保存完整的卵巢組織，高度模擬了人類圍絕經(jīng)期階段激素水平的變化情況及圍絕經(jīng)期綜合征癥狀如焦慮、抑郁、潮熱等，是探索圍絕經(jīng)期繼發(fā)的慢性疾病如冠心病、高血壓和糖尿病腎病等發(fā)病機(jī)制的優(yōu)勢模型。

VCD模型可變的窗口期和VCD效應(yīng)的劑量依賴性表明，這種造模方法相比其他獲得性POF鼠的模型更具優(yōu)勢?，F(xiàn)代技術(shù)可以跟蹤卵巢和激素水平的逐漸變化，并將卵巢的變化與其他組織器官聯(lián)系起來。故VCD誘導(dǎo)的模型不僅可以研究POF的疾病狀態(tài)，還可以研究圍絕經(jīng)期生理變化及相關(guān)并發(fā)癥。雖然造模周期相對較長，但眾多文獻(xiàn)實(shí)踐證明VCD誘導(dǎo)POF模型具有穩(wěn)定性好、成功率高、安全有效的優(yōu)點(diǎn)，可以作為探索一系列中醫(yī)藥治療臨床前生殖疾病的手段而被廣泛應(yīng)用。