崔耀元，孫朝陽

(華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院婦科腫瘤科，武漢 430030)

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)常見且死亡率最高的惡性腫瘤，診斷后5年生存率始終低于40%。卵巢癌的一線治療主要依賴減瘤手術和鉑類化療，但術后復發(fā)和化療耐藥是卵巢癌治療無法回避的困境。聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(poly ADP-ribose polymerase,PARP)抑制劑的出現(xiàn)使卵巢癌患者治療方案的選擇產(chǎn)生了革命性變化，特別是對于乳腺癌易感基因蛋白1和2(breast cancer susceptibility gene 1/2,BRCA1/2)突變的腫瘤，PARP抑制劑顯著延長了患者的無進展生存期(progression-free survival,PFS)[1]。

PARP家族，特別是PARP-1和PARP-2，是DNA單鏈斷裂(single-strand break,SSB)修復途徑的關鍵組成部分。PARP抑制劑引起單鏈斷裂并不斷積累轉(zhuǎn)化為雙鏈斷裂(double strand break,DSB)，這些DNA損傷在BRCA1/2突變導致的同源重組修復缺陷(homologous recombination repair defective,HRD)腫瘤中無法修復進而導致細胞死亡，即“合成致死性(synthetic lethality)”[2]。盡管PARP抑制劑已在部分卵巢癌患者治療中取得了成功，幾乎不可避免的耐藥性的出現(xiàn)，限制了該藥治療持續(xù)時間和患者獲益程度。

適應性反應是指腫瘤細胞和腫瘤生態(tài)系統(tǒng)在面對發(fā)育和更新過程中發(fā)生的應激，或由于環(huán)境干擾時，迅速實施內(nèi)源性應激緩解策略，直至其產(chǎn)生基因組或表觀基因組改變從而獲得抵抗性[3]。本文重點關注了PARP抑制劑治療卵巢癌引起的適應性反應，這種反應發(fā)生迅速，且具有高度的可逆性和針對性，為阻止或逆轉(zhuǎn)耐藥的出現(xiàn)提供了新的靶向干預的機會。

1 腫瘤細胞固有適應性反應

1.1 信號通路的擾動 信號通路影響腫瘤生長、增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移等廣泛的細胞活動，信號通路具有高度可塑性，細胞能通過重新激活或繞過靶分子快速適應應激得以存活[4]。蛋白質(zhì)是生物過程的基本功能單位，PARP抑制劑適應性反應主要發(fā)生在蛋白質(zhì)水平，包括與功能密切相關的翻譯后修飾(post-translationally modification,PTM)。反向蛋白組學(reverse-phase protein arrays,RPPA)是一種基于抗體抗原結(jié)合的高通量、半定量、收益高的功能蛋白組學研究方法[5]。

本課題組前期利用RPPA平臺，對多種PARP抑制劑(olaparib,niraparib,BMN673)處理多種腫瘤細胞(卵巢癌、內(nèi)膜癌、乳腺癌細胞)，在2D單層細胞培養(yǎng)、3D細胞培養(yǎng)、類器官(patient-derived organoid,PDO)培養(yǎng)條件下處理不同時間點(3d，7d)后進行了高通量的RPPA組學檢測的研究，首次全面探索了腫瘤在應對PARP抑制劑壓力下產(chǎn)生的適應性反應。本課題組及Labrie等研究發(fā)現(xiàn)PARP抑制劑顯著激活了PI3K/AKT/mTOR通路，包括pGSK3β、pmTOR、p70S6K及其下游靶點pS6_pS235_S236、pS6_pS240_S244[6-7]。通過阻斷激活通路來減少適應性反應造成的腫瘤細胞存活是研究PARP抑制劑適應性反應的目的之一， Konstantinopoulos等證明了PI3K抑制劑(alpelisib)和PARP抑制劑(olaparib)的協(xié)同作用支持了靶向適應性激活通路是有效的這一概念[8]。

此外，PARP抑制劑誘導叉形頭轉(zhuǎn)錄因子O亞型3a(forkhead box O 3a,FOXO3a)、p27和Bim意外減少，而pBRAF、pMEK、pMAPK、pPKC和pYB1適度增加，表明存在Ras/Raf/MAPK通路激活[6]?；诖税l(fā)現(xiàn)，本課題組在一組卵巢癌細胞系中評估了PARP抑制劑與MEK抑制劑聯(lián)合應用的抗腫瘤效果，聯(lián)合療法在多種卵巢癌細胞系和體內(nèi)模型中顯示出協(xié)同作用，特別是在KRAS突變腫瘤中[9]。在臨床前證據(jù)的支持下，本課題組啟動了一項名為SOLAR的臨床試驗(NCT03162627)，測試MEK抑制劑(selumetinib)和PARP抑制劑(olaparib)在子宮內(nèi)膜、卵巢和其他具有Ras通路改變的實體瘤以及難以治療PARP抑制劑耐藥卵巢癌中的聯(lián)合應用。

1.2 細胞凋亡 細胞凋亡是在生理和病理條件下發(fā)生的有序和協(xié)調(diào)的細胞死亡過程，是主動的程序性死亡，對機體自穩(wěn)調(diào)節(jié)有著重要意義 。B淋巴細胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,BCL-2)蛋白家族分為促凋亡蛋白(如Bax、Bak、Bad、Bcl-Xs、Bid、Bik和Bim)和抗凋亡蛋白(如Bcl-2、Bcl-XL、Bcl-W、Bfl-1和Mcl-1) ，深度參與線粒體促凋亡分子(如細胞色素C)釋放等凋亡途徑[10]。本課題組發(fā)現(xiàn)，PARP抑制劑誘導凋亡功能介質(zhì)的失衡，促凋亡蛋白Bax和Bid上調(diào)，Bim顯著降低，抑凋亡蛋白BCL-XL上調(diào)[6]。Lui等[11]證明PARP抑制劑(rucaparib)與Bcl2抑制劑(CPI-203和CPI-0610)在誘導腫瘤細胞凋亡方面有良好的協(xié)同作用。

1.3 代謝應激 腫瘤代謝重編程已成為對藥物誘導應激的適應性反應的關鍵組成部分，這可能揭示癌細胞的新的治療可能性[12]。PARP家族以煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)為供體，催化單ADP核糖單元(mono ADP-ribose,MAR)或多ADP核糖體單元(poly ADP-ribose,PAR)以靶向蛋白質(zhì)；該過程也分別稱為MAR酰化或PAR?；痆13]。Bajrami等[14]在三陰性乳腺癌中觀察到煙酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(nicotinamide phosphoribosyl transferase,NAMPT)抑制劑減弱了PARP抑制所誘導的腫瘤NAD+水平的增加，并且聯(lián)合療法進一步抑制了腫瘤的增殖，表明PARP抑制劑與NAD+消耗性藥物的聯(lián)合具有潛在的治療益處。

Tang等[15]發(fā)現(xiàn)，PARP抑制劑可增加腺苷5-單磷酸活化蛋白激酶(adenosine 5-monophoshate-activated protein kinase,AMPK)磷酸化激活，AMPK是由低ATP和高AMP水平(即高AMP/ATP比率)激活的細胞能量傳感器，可通過磷酸化下游底物3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶(3-hydroxy-3-methyl glutaryl coenzyme A reductase,HMGR)和乙酰輔酶A羧化酶(acetyl-coenzyme A carboxylase,ACC)使其失活從而抑制膽固醇和脂肪酸合成[16]。

1.4 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激 作為真核細胞的重要細胞器之一，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum,ER)主要發(fā)揮運輸和整合蛋白質(zhì)、協(xié)助蛋白質(zhì)折疊和運輸、脂質(zhì)生物合成和維持鈣穩(wěn)態(tài)等功能。一旦缺氧、代謝應激或錯誤折疊蛋白質(zhì)等破壞機體穩(wěn)態(tài)，真核細胞將通過一系列內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(ER stress)適應性途徑對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能障礙做出快速反應[17]。Bahar等[18]發(fā)現(xiàn)PARP抑制劑激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，增強葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78 (glucose regulated protein,GRP78)、鈣結(jié)合伴侶凝集素(calnexin)、C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP)蛋白表達。

2 腫瘤免疫微環(huán)境的適應性反應

腫瘤免疫微環(huán)境(tumor immune microenvironment,TIME)主要成分包括免疫細胞(如T細胞、樹突狀細胞)、腫瘤相關成纖維細胞、細胞外基質(zhì)和血管，調(diào)控腫瘤發(fā)展、浸潤及轉(zhuǎn)移[19]。腫瘤的發(fā)展伴隨著癌細胞和TIME之間多種復雜的相互作用，腫瘤細胞和間質(zhì)環(huán)境及其相互作用均受靶向治療影響，并對腫瘤進展有重要影響。

2.1 免疫細胞的適應性反應 多項研究表明，PARP家族在免疫細胞中發(fā)揮一定作用。PARP1/2調(diào)節(jié)幾種常見的炎癥因子和細胞因子，包括腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)和白細胞介素1-β(interleukin 1-β,IL1-β)[20]。Shen等發(fā)現(xiàn)PARP抑制劑誘導胞質(zhì)雙鏈DNA(double stranded DNA,dsDNA)積累，進一步激活環(huán)磷酸鳥苷-腺苷酸合成酶(cyclic guanosine monophosphate-adenosine monophosphate synthase,cGAS)/ 膜蛋白干擾素刺激因子(stimulator of interferon genes,STING)/ TANK結(jié)合激酶1(TANK-binding kinase 1,TBK1)/ 干擾素調(diào)節(jié)因子3 (interferon regulatory factor 3,IRF3)先天免疫途徑，誘導I型干擾素(interferon,IFN)及其相關免疫反應，無論實驗模型是否有BRCA1/2突變[21]。然而，Jiao等發(fā)現(xiàn)PARP抑制劑通過糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)失活來上調(diào)程序性死亡受體-配體1(PD ligand 1,PD-L1)的表達，使癌細胞對T細胞介導的靶細胞殺傷更有抵抗力進而造成免疫微環(huán)境的免疫抑制[22]?；赑ARP抑制劑上調(diào)PD-L1表達，Lampert等證明PARP抑制劑(olaparib)與PD-L1抑制劑(durvalumab)聯(lián)合療法在Ⅱ期臨床試驗中有一定的臨床療效[23]?？傊?，PARP抑制劑對免疫微環(huán)境的影響復雜而微妙，需在多種模型和臨床試驗中進一步探索。

2.2 腫瘤相關成纖維細胞的適應性反應 腫瘤相關成纖維細胞(cancer-associated fibroblasts,CAF)是基質(zhì)的主要組成部分，分泌生長因子、炎癥配體和細胞外基質(zhì)蛋白，促進腫瘤的增殖、抗治療和免疫排斥[24]。Martincuks等[25]在PARP抑制劑治療后的卵巢癌患者的腫瘤活檢中，發(fā)現(xiàn)CAF中轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription3,STAT3)激活增加。高水平的STAT3與晚期卵巢癌和不良預后相關，STAT3在卵巢癌患者CAF中的上調(diào)可能通過促進治療抗性和免疫抑制來促進疾病的進展。Kettner等[26]證明了PARP抑制劑(olaparib)和STAT3抑制劑(napabucasin/TTI-101)聯(lián)合顯著增加了帕博西尼(palbociclib)耐藥的乳腺癌細胞的死亡。此外，Linares等[27]發(fā)現(xiàn)PARP抑制劑通過抑制轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白1(transcription factor activator protein-1,AP-1)、c-FOS和c-JUN的PAR化，引起p62下調(diào)，導致CAF激活從而成為腫瘤進展的催化劑，這表明抑制CAF活性的藥物與PARP抑制劑的聯(lián)合療法可能帶來臨床受益。

2.3 血管生成的適應性反應 血管生成是新血管形成的過程，在正常的卵巢生理學以及卵巢癌的侵襲轉(zhuǎn)移中起著關鍵的作用，是一個由血管生成激活因子(如VEGF、FGF-2、PDGF、TGF-β)和抑制因子(如Angs、TSP-1)共同調(diào)節(jié)的復雜過程[28]。PARP-1的過表達通過直接或間接調(diào)節(jié)VEGF-A的表達和分泌，進而在上皮性卵巢癌、結(jié)腸癌、肝細胞癌中發(fā)揮了促血管生成作用[29]。Bizzaro等[30]在一組卵巢癌PDX模型中證明了在臨床相關劑量下使用PARP抑制劑(olaparib)和VEGFR抑制劑(cediranib)治療表現(xiàn)出良好的抗腫瘤活性，且不依賴于HR狀態(tài) 。

3 展望

卵巢癌靶向治療的耐藥性是一個重要挑戰(zhàn)，為了延長靶向藥的反應時間和改善患者預后，了解腫瘤和腫瘤免疫微環(huán)境在治療壓力下的變化是極其必要的。適應性反應發(fā)生發(fā)展的機制復雜，機體在內(nèi)外應激源誘導下，產(chǎn)生多種信號轉(zhuǎn)導通路變化、代謝應激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，以及通過腫瘤和腫瘤免疫微環(huán)境的復雜相互作用，最大限度發(fā)揮自身抵抗能力獲得耐藥性。卵巢癌患者在接受PARP抑制劑治療1～2周即可檢測到PARP抑制劑引起的適應性反應，且不同患者治療后樣本保持了部分相似的適應性反應[7]?；趯m應性反應的客觀分析，靶向適應性反應開發(fā)合理聯(lián)合用藥方案是對抗PARP抑制劑耐藥的一大利器，不僅可進一步抑制腫瘤發(fā)展，同時可能延緩耐藥性克隆的出現(xiàn)，為改善臨床患者預后提供機會。目前多種PARP抑制劑聯(lián)合其他小分子抑制劑的療法通常具有一定的協(xié)同效果，但常因為受到毒性限制而無法真正應用于臨床。我們應采取靈敏而精準的工具，如RPPA，判斷某治療階段治療壓力引起的特征性變化，通過聯(lián)合療法、序貫療法等符合腫瘤適應性反應的方式來實現(xiàn)個體化精準而安全治療的目的。

4 總結(jié)

綜上所述，卵巢癌診斷時間晚、復發(fā)率高，是病死率最高的婦科惡性腫瘤。PARP抑制劑使BRCA1/2突變卵巢癌患者的預后大為改善，但仍面對靶向藥物耐藥的通病。PARP抑制劑治療卵巢癌后會引起腫瘤和腫瘤免疫微環(huán)境的適應性反應，如何利用適應性反應針對性開展聯(lián)合療法，可能是延緩或逆轉(zhuǎn)PARP抑制劑耐藥的有效手段。