魏雙艷, 蔡春爾, 何培民, 賈睿

銅藻多糖對H2O2誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞氧化應(yīng)激的保護作用

魏雙艷, 蔡春爾, 何培民, 賈睿*

(上海海洋大學(xué)海洋生態(tài)與環(huán)境學(xué)院，上海 201306)

銅藻；多糖；人角質(zhì)形成細(xì)胞；氧化應(yīng)激；體外抗氧化

機體內(nèi)活性氧成分與抗氧化系統(tǒng)之間平衡失調(diào)所引起的一系列適應(yīng)性的反應(yīng)稱為氧化應(yīng)激(oxidative stress, OS)[1]。通常，正常代謝產(chǎn)生的活性氧(reactive oxygen species, ROS)可以被細(xì)胞內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)清除[2–3]。然而，過度的環(huán)境壓力(如紫外線輻射和化學(xué)物質(zhì)等)會導(dǎo)致異常的活性氧產(chǎn)生，從而導(dǎo)致多種疾病(如癌癥、炎癥、糖尿病、阿爾茨海默病和衰老等)[4]。因此，具有較強的活性氧清除能力和低毒性或無毒性的抗氧化成分可能是開發(fā)針對氧化應(yīng)激相關(guān)疾病的理想治療劑。由于天然化合物具有生物活性高、無毒的優(yōu)點，從陸地和海洋生物中分離生物活性化合物引起了廣泛的關(guān)注[5–7]。海藻含有多種獨特新穎的活性成分如：多酚化合物、甾醇類化合物、不飽和脂肪酸和多糖等[6,8]，具有多種生物活性如：抗癌、降壓、消炎、抗氧化以及抗糖尿病等[5,9–11]，已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、化妝品以及藥妝品等領(lǐng)域。海藻多糖含量尤其豐富，通常由海藻酸鹽、卡拉膠和巖藻多糖組成[12]。海藻多糖由于其獨特的理化性質(zhì)，如高含量的巖藻糖、半乳糖、糖醛酸和硫酸鹽等，具有很強的生物活性[13–14]。已有報道，從海藻中分離的多糖具有較好的抗氧化活性[15–16]。

1 材料和方法

1.1 材料和儀器

銅藻()于2020年10月采自浙江省枸杞島；人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞(HaCaT)購自上海信裕生物科技有限公司。

Nicolet iS5傅里葉變換紅外光譜儀(美國ThermoScientific公司)、CO2培養(yǎng)箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司)、TS2RFL倒置顯微鏡(日本Nikon公司)、F97 熒光分光光度計(上海棱光技術(shù)有限公司)、UV-1800型紫外分光光度計(日本島津公司)、iMark酶標(biāo)儀(美國Bio-Rad公司)等。

1.2 SHP的制備

將新鮮的銅藻用自來水清洗3遍，將水脫干, 在60 ℃烘箱中烘干備用，然后用超微粉碎機粉碎, 過80目篩得到藻粉。稱取藻粉20 g，采用95%酒精浸泡72 h以脫脂脫色。濾渣烘干后按照1:20加蒸餾水，90 ℃煮4 h，用500目的紗布過濾得到濾液, 然后將濾渣重復(fù)煮1次，合并2次濾液，抽濾過濾掉濾渣，加熱濃縮至100 mL，加入4倍體積95%乙醇，于4 ℃冰箱靜置24 h，10 989×離心得沉淀。最后沉淀經(jīng)無水乙醇、丙酮和乙醚洗滌3次以脫水干燥，平均得到1.93 g的SHP粉末。

1.3 SHP的紅外光譜表征

稱取10 mg干燥的SHP樣品，利用Nicolet iS5傅里葉變換紅外光譜儀對SHP進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征，采用KBr壓片法進(jìn)行測定[28]。

1.4 SHP的體外抗氧化作用

將SHP配制成體積濃度為0.025、0.05、0.1、0.2、0.5、1 mg/mL，參照DPPH自由基和羥自由基測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)說明書檢測SHP溶液的DPPH自由基和羥自由基的清除能力；根據(jù)超氧陰離子自由基和總抗氧化能力試劑盒(南京建成生物工程研究所)說明書測定SHP溶液(0.5、1、1.5、2、2.5、3 mg/mL)對超氧陰離子自由基清除能力和總抗氧化能力。

1.5 SHP對HaCaT細(xì)胞的保護作用

HaCaT細(xì)胞的培養(yǎng) 將HaCaT細(xì)胞分別培養(yǎng)于含10%胎牛血清及含1%抗生素的高糖DMEM培養(yǎng)基中，置于5% CO2、37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，根據(jù)細(xì)胞生長的狀況，每2～3 d將舊的細(xì)胞培養(yǎng)基全部更換成新鮮的細(xì)胞培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到80%～90%融合度時用0.25%的胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代,然后取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實驗。

H2O2損傷模型的確定 選擇對數(shù)生長期的HaCaT細(xì)胞制成1×105cells/mL的細(xì)胞懸液, 以每孔100L接種于96孔板中，每組設(shè)6個復(fù)孔，置于5% CO2、37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，24 h后待細(xì)胞狀態(tài)穩(wěn)定后，分別加入終濃度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mmol/L的H2O2繼續(xù)孵育24 h。用CCK-8試劑盒(上海碧云天技術(shù)有限公司)檢測細(xì)胞存活率，選擇細(xì)胞存活率接近50%的H2O2濃度作為最佳作用濃度。細(xì)胞存活率(%)=(A藥物-A空白)/(A對照- A空白)×100%, 式中，A藥物為實驗組吸光度值，A空白為空白組吸光度值；A對照為對照組吸光度值。

SHP對HaCaT細(xì)胞的毒性 將HaCaT細(xì)胞制成1×105cells/mL的細(xì)胞懸液, 接種于96孔板中, 每孔100L，每組設(shè)置6個復(fù)孔，在細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育24 h后, 用含有不同濃度的SHP培養(yǎng)基(0、25、50、75、100、150、200、500g/mL)處理細(xì)胞，繼續(xù)孵育24 h后，用CCK-8法測定SHP對細(xì)胞的安全劑量。

SHP對H2O2誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞活力的保護作用 取處于對數(shù)生長期的HaCaT細(xì)胞，用胰酶消化并制備單細(xì)胞懸液，以細(xì)胞密度為1×105cells/mL接種于96孔板，每孔100L，放置于5% CO2、37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后，向多糖保護組加入等體積的SHP (25、50和100g/mL), 孵育1 h后，多糖保護組和H2O2損傷組分別使用含H2O2(終濃度為0.5 mmol/L)的培養(yǎng)基處理HaCaT細(xì)胞，而空白對照組加入等體積的培養(yǎng)基。每組設(shè)6個復(fù)孔，孵育24 h后，用CCK-8法測定細(xì)胞活力?？瞻讓φ战M：不加H2O2，不加SHP; H2O2損傷組：加H2O2損傷，不加SHP; 多糖保護組: 加SHP預(yù)保護1 h后加H2O2。

SHP對H2O2誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞ROS的清除作用 將HaCaT細(xì)胞以1×105cells/mL的密度接種于6孔板，每孔加入2 mL，并設(shè)立空白對照組、H2O2損傷組和多糖保護組。處理結(jié)束后，各孔加入終濃度為10g/mL的DCFH-DA，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育30 min，每隔5 min搖晃1次，以便于探針與細(xì)胞充分接觸，且全程避光操作。孵育結(jié)束后，用預(yù)熱的培養(yǎng)基清洗2次，然后收集細(xì)胞于熒光顯微鏡下拍照并用熒光分光光度計測定細(xì)胞內(nèi)的熒光強度。將空白對照組的熒光強度設(shè)置為100%，其他組與空白對照組熒光強度相比，以計算其他組細(xì)胞內(nèi)的熒光強度。

SHP對細(xì)胞內(nèi)的丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性的影響 將細(xì)胞接種到6孔板，每孔加入2 mL，設(shè)立空白對照組、H2O2損傷組和多糖保護組。處理結(jié)束后移除原培養(yǎng)基，并用PBS輕輕漂洗2遍，然后用細(xì)胞刮板輕輕刮取，離心并倒去上清液，加200L雙蒸水，利用反復(fù)凍融法破碎細(xì)胞，離心后取上清液，參照SOD和MDA的試劑盒(南京建成生物工程研究所)說明書進(jìn)行測定。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，采用單因素方差分析(ANOVA)進(jìn)行顯著性分析。<0.05表示有顯著差異；<0.01表示有極顯著差異。

2 結(jié)果和分析

2.1 SHP的紅外光譜表征

通過紅外光譜儀對SHP進(jìn)行簡單表征(圖1), 在3 432 cm–1處的吸光度是O-H特征伸縮振動峰, 在2 938 cm–1處的吸光度是C-H特征伸縮振動峰; 在1 625 cm–1處的特征峰為H-O-H，這表明樣品中存在水分。此外，在1 200 cm–1處的吸收峰表示S=O的伸縮振動，即硫酸鹽的強烈伸縮振動，而在842 cm–1處的吸收峰為C-O-S的不對稱伸縮振動，即硫酸鹽的彎曲振動。

2.2 SHP的體外抗氧化活性

2.3 SHP對HaCaT細(xì)胞的保護作用

H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷模型建立 用終濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6和0.7 mmol/L的H2O2處理HaCaT細(xì)胞相同時間后，采用CCK-8法檢測HaCaT細(xì)胞的活力變化。由圖3可見，HaCaT細(xì)胞活力與H2O2濃度呈負(fù)相關(guān)，即隨H2O2濃度增加，細(xì)胞活力迅速下降，當(dāng)H2O2為0.5 mmol/L時，HaCaT細(xì)胞的活力為62.56%，與空白對照達(dá)極顯著差異(<0.01)。因此選用0.5 mmol/L H2O2作為HaCaT細(xì)胞的損傷濃度。

圖1 SHP的紅外光譜

圖2 SHP的自由基清除能力

圖3 H2O2對HaCaT細(xì)胞活力的影響

SHP對HaCaT細(xì)胞的毒性 采用CCK-8法分析SHP對HaCaT細(xì)胞的毒性(圖4)，當(dāng)SHP為25～100g/mL時，HaCaT細(xì)胞活性與空白對照沒有顯著差異(>0.05)。但當(dāng)SHP濃度大于100g/mL時, 細(xì)胞活力明顯下降，可能是高濃度SHP對HaCaT細(xì)胞產(chǎn)生了細(xì)胞毒性。因此在后續(xù)實驗中選用25、50、100g/mL 3個劑量來探究SHP對H2O2誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞氧化應(yīng)激的保護作用。

圖4 SHP對HaCaT細(xì)胞活力的影響

SHP對H2O2誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞活力的保護作用 與空白對照相比，0.5 mmol/L H2O2處理的HaCaT細(xì)胞活力極顯著下降(<0.01)，為(56.85± 2.63)%；而25、50、100g/mL SHP處理的HaCaT細(xì)胞活力呈劑量依賴性增加，分別為(62.75± 1.96)%、(70.62±3.30)%、(80.57±2.91)% (圖5)。這表明SHP預(yù)處理后對H2O2誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞活力具有一定的保護作用，SHP可以有效的減弱H2O2誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷。

圖5 SHP對H2O2誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞氧化損傷的影響。柱上不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

SHP對H2O2誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞內(nèi)ROS的清除作用 由圖6可見，與空白對照相比，H2O2誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞熒光強度明顯增強，說明HaCaT細(xì)胞內(nèi)ROS含量極顯著增強(<0.01)。但0和25g/mL SHP對H2O2誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞內(nèi)ROS水平?jīng)]有顯著差異。然而當(dāng)SHP濃度達(dá)50和100g/mL時，HaCaT細(xì)胞內(nèi)ROS水平呈極顯著降低(<0.01)。同時在熒光顯微鏡下觀察的熒光圖像也得到了相似的結(jié)果，說明一定濃度范圍的SHP可以有效清除細(xì)胞內(nèi)ROS。

SHP對MDA含量和SOD活性的影響 與空白對照相比，H2O2誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞SOD活力顯著降低(<0.01)，MDA含量顯著升高(<0.01), 但25、50、100g/mL SHP處理的HaCaT細(xì)胞SOD活力呈劑量依賴性增加，MDA含量呈劑量依賴性顯著降低(<0.05)(表1)。這說明SHP可以顯著降低H2O2誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞內(nèi)MDA含量，從而使細(xì)胞避免受到氧化應(yīng)激損傷。

3 結(jié)論和討論

與陸生植物棲息環(huán)境相比，海藻具有獨特新穎的分子結(jié)構(gòu)以及生理生化性質(zhì)，其中多糖類物質(zhì)依然是近年來眾多學(xué)者的研究熱點，廣泛應(yīng)用于各個領(lǐng)域[29–31]。本研究采用水提法提取銅藻多糖不僅成本低廉而且易于操作，容易實現(xiàn)多糖的規(guī)?；a(chǎn)。紅外光譜結(jié)果顯示出SHP的結(jié)構(gòu)特征，2 938 cm–1處的吸收帶是C-H的伸縮振動特征峰，說明多糖的存在[32]，1 260和814 cm–1處的峰是S=O和C-O-S的不對稱伸縮振動，表明SHP中含有硫酸鹽基團[33], 因此可以推測SHP是硫酸多糖[34]。本研究通過測定SHP對DPPH自由基、超氧陰離子自由基、羥自由基以及總抗氧化能力來探究SHP的抗氧化活性，結(jié)果表明SHP在體外具有一定的抗氧化能力，并且其抗氧化能力呈現(xiàn)出一定的濃度依賴性。

圖6 SHP對H2O2誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞內(nèi)ROS生成的影響。A: 熒光分光光度計結(jié)果; B: 熒光圖像。柱上不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

表1 SHP對HaCaT細(xì)胞內(nèi)SOD活力和MDA含量的影響

數(shù)據(jù)后不同字母表示差異顯著(<0.05)。

Data followed by different letters indicate significant difference at 0.05 level.

近年來，利用H2O2建立細(xì)胞氧化損傷模型被廣泛應(yīng)用于評價天然化合物對氧化應(yīng)激的保護作用[1,19,21,28]，特別是利用多糖作為天然的抗氧化劑已經(jīng)引起了眾多學(xué)者的廣泛關(guān)注。Wang等[1]從羊棲菜()中分離的多糖可以顯著降低H2O2誘導(dǎo)的Vero細(xì)胞內(nèi)ROS水平、細(xì)胞凋亡等，其對細(xì)胞氧化損傷具有明顯的保護作用。郭子葉等[35]研究表明滸苔多糖可以降低H2O2對HSF細(xì)胞的氧化損傷，提高細(xì)胞的自由基清除能力，并且減少細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化作用。由于H2O2可能會誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，因此細(xì)胞存活率也是衡量H2O2誘導(dǎo)氧化應(yīng)激的理想指標(biāo)，因此本研究通過不同濃度的誘導(dǎo)優(yōu)化最終選用0.5 mmol/L H2O2作為誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞的最優(yōu)氧化應(yīng)激模型，并利用該模型對SHP進(jìn)行了體外抗氧化研究。本實驗結(jié)果表明，SHP可以呈劑量依賴性地提高H2O2誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞的存活率。除此之外，細(xì)胞內(nèi)積累過量的ROS將會導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化、蛋白質(zhì)氧化以及DNA損傷等，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[36]。本研究結(jié)果還表明，H2O2誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞內(nèi)的ROS水平明顯高于對照, 而當(dāng)添加SHP時, H2O2誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞內(nèi)ROS水平呈劑量依賴性減弱，細(xì)胞存活率增加也支持這一觀點。

在正常情況下，細(xì)胞具有內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng),其通過產(chǎn)生超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)等抗氧化酶來保護細(xì)胞避免遭受ROS的損傷[37]。SOD是抗氧化酶防御系統(tǒng)中第一道也是最重要的一道防線，其可以清除細(xì)胞內(nèi)ROS，特別是超氧陰離子自由基，防止脂質(zhì)過氧化，從而提升生物體的抗氧化能力[38]。本實驗結(jié)果表明，H2O2誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞的抗氧化酶SOD活力與空白對照組相比顯著下降，表明HaCaT細(xì)胞在H2O2誘導(dǎo)下產(chǎn)生大量的自由基，從而抗氧化酶SOD活性得到抑制、氧化應(yīng)激程度加深[39]。然而，在經(jīng)過SHP預(yù)處理后其細(xì)胞的SOD活力呈劑量依賴性增加，表明減弱了細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷程度。脂質(zhì)過氧化在生物系統(tǒng)中被認(rèn)為是一種毒理學(xué)現(xiàn)象，其會導(dǎo)致各種病理狀況，而H2O2會增強細(xì)胞系統(tǒng)中的脂質(zhì)過氧化[40–41]。MDA是公認(rèn)的脂質(zhì)過氧化作用的最終分解產(chǎn)物, 其含量的多少反映了細(xì)胞損傷的程度，從而可以間接地反映細(xì)胞氧化應(yīng)激的受損程度[42]。本研究結(jié)果表明，SHP呈劑量依賴性降低了H2O2誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞中MDA含量。因此SHP可以阻止過氧自由基的積累，保護HaCaT細(xì)胞免受H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷。在本研究中，SHP能夠顯著提高H2O2誘導(dǎo)氧化損傷的HaCaT細(xì)胞SOD活力，可以有效清除細(xì)胞內(nèi)ROS，阻止脂質(zhì)過氧化，并且顯著降低細(xì)胞內(nèi)MDA的含量，從而對H2O2誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞氧化應(yīng)激起到保護作用。以上試驗結(jié)果證實了SHP具有保護細(xì)胞免受H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激的抗氧化潛力。

本研究采用自由基清除和細(xì)胞實驗證實SHP具有較好的體外抗氧化作用，表明SHP具有作為天然抗氧化劑的潛力，可以用來增強對氧化應(yīng)激的保護作用，以評估SHP作為化妝品和功能性食品成分的應(yīng)用。從銅藻中提取的多糖作為褐藻多糖的一種，具有良好的對氧化應(yīng)激損傷的保護作用，那么褐藻多糖可能也具有較好的體外抗氧化活性，并且由于綠色天然無毒的優(yōu)點，因此褐藻多糖作為原料開發(fā)新型的功能性化妝品具有廣闊的前景，同時將其應(yīng)用到氧化應(yīng)激等相關(guān)疾病的防治也具有一定的可能性。褐藻多糖的抗氧化活性可能與硫酸根含量、分子量、結(jié)構(gòu)組成和溶解度有關(guān)，這還需進(jìn)一步的探究。

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Protective Effect of Polysaccharide fromon H2O2- induced Oxidative Stress in HaCaT Cells

WEI Shuangyan, CAI Chuner, HE Peimin, JIA Rui*

(College of Marine Ecology and Environment, Shanghai Ocean University,Shanghai 201306, China)

; Polysaccharide; HaCaT cell; Oxidative stress;antioxidant

10.11926/jtsb.4567

2021-11-12

2022-02-05

國家重點研發(fā)計劃(2019YFC0312604)；上海市農(nóng)委科技興農(nóng)項目[滬農(nóng)科推字(2017)1-13]；國家“八六三”高技術(shù)研究發(fā)展計劃(2014AA093506)；上海市大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計劃項目(S201910264057)資助

This work was supported by the National Key Research and Development Project (Grant No. 2019YFC0312604), the Project for Agriculture Science and Technology Innovation in Shanghai [Grant No. (2017)1-13], the National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (Grant No. 2014AA093506), and the Project for Student Innovation Training in Shanghai (Grant No. S201910264057).

魏雙艷(1997年生)，女，碩士研究生，研究方向為海藻多糖的生物活性研究。E-mail: wsy97221@163.com

通訊作者 Corresponding author.E-mail: rjia@shou.edu.cn