潘陽陽，王靖雷，王萌，王立斌，張倩，陳睿，張?zhí)鹛穑扪?，徐庚全，樊江峰，余四?/p>

牦牛早期胚胎核旁斑點形成及對后續(xù)發(fā)育的影響

1甘肅農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，蘭州 730070；2甘肅省牛羊胚胎工程技術研究中心，蘭州 730070

【目的】明確牦牛早期胚胎發(fā)育過程中核旁斑點形成的關鍵時期，確定其參與形成長鏈非編碼RNA（Long non-coding RNA，LncRNAs），探索核旁斑點形成對后續(xù)胚胎發(fā)育能力的影響及調控機制。【方法】體外受精生產(chǎn)牦牛胚胎，DAPI染色標記結合核旁斑點結構蛋白1（paraspeckle Protein 1，）mRNA實時熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，qRT-PCR）檢測確定牦牛早期胚胎發(fā)育核旁斑點形成關鍵時期，免疫熒光技術驗證胚胎PSPC1蛋白表達水平；qRT-PCR檢測核旁斑點形成相關LncRNAs核旁斑點組裝轉錄因子1（encoding nuclear paraspeckle assembly transcript 1，）、共激活因子相關的精氨酸甲基轉移酶1（coactivator associated arginine methyltransferase 1，）及54 kD核結合蛋白（non-POU domain containing octamer-binding protein，）mRNA在各時期胚胎中表達水平；RNA干擾技術抑制合子mRNA水平，比較后續(xù)各階段胚胎發(fā)育率，通過分析囊胚細胞總數(shù)、滋養(yǎng)層細胞數(shù)（trophoblast cells，TE）、內細胞團數(shù)（inner cell mass，ICM）評估囊胚質量；檢測對照組和mRNA干擾組囊胚中B-細胞淋巴瘤/白血病-2原癌基因（B-celllymphoma/leukemia-2，Bcl-2）和B細胞淋巴瘤/白血病基因伴隨蛋白x（B-cell lymphoma/leukemia associatedx protein，Bax）表達水平?！窘Y果】（1）在不同發(fā)育階段胚胎細胞的細胞核均可觀察到核旁斑點，但2-細胞和4-細胞時期胚胎細胞核中核旁斑點更為清晰，2-細胞至桑椹胚階段mRNA呈現(xiàn)高水平表達，其中4-細胞到桑椹胚階段mRNA水平最高，PSPC1蛋白熒光強度在此階段最強。（2）、及mRNA均在2-細胞到桑椹胚階段呈現(xiàn)高水平表達，其中和在4細胞時期水平最高，在2-細胞到桑椹胚3個階段表達水平差異不顯著（＞0.05）。（3）mRNA干擾組桑椹胚與囊胚發(fā)育率均顯著降低，且桑椹胚發(fā)育率降低幅度高于囊胚，mRNA干擾組囊胚細胞總數(shù)顯著低于對照組，其中以ICM細胞數(shù)降低為主，TE細胞數(shù)在兩組之間差異不顯著。（4）mRNA干擾處理組囊胚中促細胞凋亡因子mRNA和蛋白均顯著增加，抑凋亡相關因子mRNA和蛋白降低，且囊胚中內細胞團發(fā)生裂解?！窘Y論】牦牛早期胚胎發(fā)育核旁斑點形成的關鍵時期為2-細胞至桑椹胚階段，其中主要集中在4-細胞時期，且PSPC1、NEAT1、CRAM1、p54nrb在核旁斑點形成時期呈高水平表達。干擾牦牛合子mRNA導致后續(xù)胚胎發(fā)育能力降低，并通過誘導ICM凋亡降低囊胚質量，影響囊胚中細胞命運決定。

牦牛；核旁斑點；細胞命運；細胞凋亡；長鏈非編碼RNA（LncRNAs）

0 引言

【研究意義】核旁斑點為核小體的一種，是在哺乳動物細胞核內發(fā)現(xiàn)的一種新型亞細胞器結構[1]，其通過長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，LncRNAs）介導形成，參與細胞核重定位、染色質重組、組蛋白修飾等多種生理應答，也可滯留細胞核內RNA，調控特定基因表達，阻止某些RNA與靶標蛋白結合，限制相關生物學功能，如影響小鼠早期胚胎發(fā)育細胞分化、抵抗外源病原體感染、調節(jié)機體和細胞適應低氧環(huán)境應激等[2-4]。以不同哺乳動物早期發(fā)育胚胎為試驗材料，探索核旁斑點形成關鍵時期，明確其形成分子機制及對后續(xù)胚胎發(fā)育能力的調控，有助于從環(huán)境應激和細胞命運決定等理論層面改善胚胎發(fā)育質量，促進家畜體外胚胎生產(chǎn)、胚胎干細胞分離培養(yǎng)等技術的發(fā)展。【前人研究進展】核旁斑點最早于2002年發(fā)現(xiàn)于Hela細胞[5]，隨后在多種哺乳動物組織和細胞均發(fā)現(xiàn)存在核旁斑點，由于其最早發(fā)現(xiàn)在細胞核染色體空隙中，因此被命名為核旁斑點（paraspeckles），在這些細胞核特殊結構中發(fā)現(xiàn)了一種新的蛋白被稱為核旁斑點蛋白1（paraspeckle protein 1，PSPC1），目前許多學者通過PSPC1免疫標記分析核旁斑點數(shù)量及大小[6]。研究發(fā)現(xiàn)有大量LncRNAs位于該特殊細胞核結構，是其結合蛋白關鍵位置，且核旁斑點形成依賴于LncRNAs合成，其可作為開放的細胞核系統(tǒng)，進行分子自由交換[6]。LncRNAs為核旁斑點結構建立了基本支架，主要以核旁斑點組裝轉錄因子1（encoding nuclear paraspeckle assembly transcript 1，）為主，其持續(xù)轉錄是維持核旁斑點結構完整性的必要條件，也可通過核旁斑點調控其他基因轉錄。和其協(xié)同因子54 kD核結合蛋白（Non-POU domain containing octamer- binding protein，）有助于共激活因子相關精氨酸甲基轉移酶1（coactivator associated arginine methyltransferase 1，）和核旁斑點之間結合，導致蛋白修飾出現(xiàn)差異，相反CARM1又影響核旁斑點形成[7-8]。除此之外，通過干細胞研究發(fā)現(xiàn)可調控關鍵多能性細胞因子八聚體結合轉錄因子（octamer-binding transcription factor 4，OCT4）轉錄，其在哺乳動物早期胚胎發(fā)育過程參與細胞命運決定調控。低氧條件下，細胞可通過低氧誘導因子家族（hypoxia inducible factors，HIFs）介導而表達NEAT1，其再作為調節(jié)子誘導核旁斑點形成，提高細胞對低氧適應性，當氧氣濃度恢復正常時核旁斑點消失[9]。利用毒性干擾素處理動物細胞，蛋白酶體可導致NEAT1聚集點成熟核旁斑點釋放延遲，進而調控B-細胞淋巴瘤/白血病-2原癌基因（B-celllymphoma/ leukemia-2，Bcl-2）和B細胞淋巴瘤/白血病基因伴隨蛋白x（B-cell lymphoma/leukemia associatedx protein，Bax）表達促進細胞凋亡[10]?！颈狙芯壳腥朦c】牦牛因長期生活在青藏高原，獨特的生殖環(huán)境影響機體相關基因和蛋白表達，使其具備獨特生殖調控特性。已有研究顯示，牦牛胚胎或生殖細胞體外發(fā)育過程受低氧誘導因子（hypoxia-inducible factor, HIF-1α）[11]、熱休克蛋白（heat shock proteins, HSPs）[12]、冷誘導RNA結合蛋白（cold inducible RNA-binding protein, CIRP）等高寒低氧相關因子調控[13]。在表皮生長因子（epidermal growth factor, EGF）和胰島素生長因子（insulin-like growth factor, IGF）作用下，不僅可以通過減少細胞凋亡提高牦牛體外胚胎發(fā)育能力，而且可通過調控高寒環(huán)境相關因子影響囊胚質量，改變囊胚中不同命運細胞分布[14]?？梢姼吆脱醐h(huán)境哺乳動物胚胎體外發(fā)育過程細胞分化、囊胚質量和囊胚附植能力的體外調控機制均具有自身獨特性[13, 15-16]?！緮M解決的關鍵問題】本研究以附植前不同階段的牦牛胚胎為試驗材料，探索高寒哺乳動物早期胚胎發(fā)育核旁斑點的形成關鍵時期，分析其對胚胎發(fā)育能力的影響及其潛在調控機制，為進一步解析哺乳動物胚胎發(fā)育過程中核旁斑點形成機制和生理功能提供關鍵信息。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

M199卵母細胞成熟培養(yǎng)液，促卵泡生成素（follicle- stimulating hormone，F(xiàn)SH）、促黃體生成素（luteinizing hormone，LH）和雌二醇（Estradiol，E2）均購自美國Sigma公司，G1/G2液購自瑞典Vitrolife公司；CDX2（ab88129）、Bax（ab32503）、PSPC1（ab104238）和Bcl-2（ab117115）一抗購自Abcam公司；二抗均購自北京博奧森生物公司，微量細胞RNA提取、cDNA合成試劑盒購自美國Invitrogen公司、SYBR GreenⅡ試劑盒購自Takara生物公司，細胞蛋白提取試劑盒購自北京英文特生物技術公司，試驗中所用到的其他試劑均購買于南京碧云天生物公司。

1.2 牦牛卵母細胞體外成熟培養(yǎng)與胚胎生產(chǎn)

牦牛卵巢于2020年10—11月采集于甘肅省臨夏自治州牛羊屠宰場，采集卵巢置于30—35℃含有雙抗的生理鹽水中，4 h內帶回實驗室，用預熱生理鹽水沖洗3—5遍，從直徑大小約為5—8 mm卵泡中抽取牦牛卵母細胞，體視顯微鏡下篩選形態(tài)完整的卵丘卵母細胞復合體（cumulus-oocyte complexes，COCs），清洗3遍，參照前期建立的牦牛卵母細胞成熟培養(yǎng)方法與體系進行體外成熟培養(yǎng)[15]。24 h后取出成熟COCs生產(chǎn)體外受精胚胎。

取出2—4支牦牛凍精，37℃溫水快速水浴解凍，上浮法處理凍精并調整精子密度至約3×106個/mL，轉移到四孔板，每孔約400 μL，并用200 μL礦物油覆蓋。將成熟COCs用受精液清洗3—5次后，轉移到含有精子的四孔板，每孔約40枚COCs，培養(yǎng)箱中共孵育16 h。取出COCs至預熱DPBS液，吹打脫除卵丘細胞，將合子移入G1液，清洗3遍，每100 μL G1液微滴移入20枚合子，置于條件為38℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱，96 h后移入G2液繼續(xù)培養(yǎng)，分別在受精完成后12、36、48、96、168 h收集合子、2-細胞、4-細胞、桑椹胚和囊胚（圖1）用于后續(xù)試驗。

1.3 合子PSPC1 mRNA干擾

根據(jù)Genbank 公布的牛mRNA序列（NM_001075277.1），利用siDirect version 2.0軟件設計篩選出3條干擾mRNA序列siRNA（表1），由上海吉瑪制藥生物技術公司合成。合子培養(yǎng)12 h，先后選取240枚形態(tài)完整合子（3條siRNA組+對照組，每組20枚胚胎，3個重復），置于含有7.5 μg·mL-1細胞松弛素B和5 %血清的D-PBS微滴，50枚/微滴，礦物油覆蓋后繼續(xù)37 ℃平衡10 min，利用顯微操作儀將約0.1 μL含有siRNA（100 pg）核酸溶液注射到合子內。siRNA注射結束后將合子清洗3遍，按照每100 μL G1液20枚胚胎培養(yǎng)48 h，棄掉未卵裂胚胎，調整到20枚/100 μL后繼續(xù)培養(yǎng)，96 h后檢測桑椹胚mRNA表達水平確定最優(yōu)siRNA，再設最優(yōu)siRNA處理組和對照組，每組200枚胚胎，3個重復繼續(xù)培養(yǎng)，于96和168 h統(tǒng)計桑椹胚與囊胚發(fā)育率，囊胚繼續(xù)用于后續(xù)試驗。

A：合子；B：2-4細胞胚胎（黑色箭頭）；C：4細胞-桑椹胚階段細胞胚胎；黑色箭頭為4-細胞胚胎，藍色箭頭為桑葚胚；D：囊胚（黑色箭頭）

表1 干擾牦牛PSPC1 mRNA的siRNAs信息

1.4 核旁斑點的觀察與胚胎發(fā)育能力統(tǒng)計

對照組中收集不同發(fā)育時期胚胎各3枚，洗滌3遍后用熒光染色固定液25 ℃作用約1 h，清洗3遍，用含有0.25%TritonX-100熒光染色封閉液25 ℃作用1 h，清洗3遍，用含有2.5 ng·mL-1DAPI 的PBS避光25 ℃作用3 min，清洗3遍，將胚胎轉移到載玻片，GE DeltaVision Elite活細胞工作站檢測胚胎細胞核形態(tài)。在收集對照組胚胎時，根據(jù)圖1形態(tài)學觀察，以處理后4-細胞胚胎數(shù)為基數(shù)，統(tǒng)計最優(yōu)siRNA干擾mRNA組和對照組桑椹胚發(fā)育率，以桑椹胚為基數(shù)統(tǒng)計兩組囊胚率。

1.5 不同時期胚胎中PSPC1、NEAT1、CARM1和P54nrb檢測

1.5.1 不同時期胚胎中、、和基因檢測 收集對照組各發(fā)育時期胚胎，每個時期10枚胚胎，根據(jù)微量細胞與胚胎RNA提取試劑盒（Invitrogen）說明提取mRNA，按照cDNA合成試劑盒說明合成cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

參照Genbank公布的牛mRNA和、和序列設計引物，具體序列信息和qRT-PCR反應條件見表2。反應體系為cDNA 1.25 μL，上、下游引物各0.6 μL，使其終濃度為0.25 μmol·mL-1，SYBR GreenⅡ 熒光定量PCR Mix（2×）10 μL，用ddH2O調整最終體積為20 μL，放入Roche 480實時熒光定量RCR儀器。反應條件為：95 ℃預變性20 s，95 ℃變性10 s，退火 10 s（反應溫度見表2），72 ℃延伸10 s，共40個循環(huán)，-actin作為參照基因，采用相對定量法計算基因表達水平，合子作為對照組[17]。

表2 試驗所用引物信息表

1.5.2 不同時期胚胎中PSPC1蛋白檢測 根據(jù)表達水平檢測結果，采用熒光免疫檢測其高表達時期PSPC1蛋白表達與定位，每個時期取3枚胚胎，洗滌3遍后用熒光免疫染色固定液25 ℃固定約1 h，用含有0.25%TritonX-100的熒光染色封閉液25 ℃作用2 h，加入PSPC1一抗（1﹕400）4 ℃過夜孵育，清洗3遍，用AlexaFluor488標記的二抗25 ℃孵育2 h，清洗3遍，用2.5 ng·mL-1DAPI 避光25 ℃作用3 min，清洗3遍，GE DeltaVision Elite活細胞工作站檢測胚胎中PSPC1蛋白表達。

1.6 囊胚細胞數(shù)統(tǒng)計與細胞凋亡相關因子檢測

1.6.1 囊胚細胞數(shù)統(tǒng)計 最優(yōu)siRNA干擾mRNA處理組和對照組中各選囊胚5枚，參照1.5.2 PSPC1蛋白染色方法，用CDX2（1﹕100）作為一抗標記囊胚，AlexaFluor488標記二抗與CDX2抗體反應，用2.5 ng·mL-1DAPI標記囊胚中所有細胞的細胞核，將不同熒光標記的囊胚置于GE DeltaVision Elite活細胞工作站成像，參照筆者前期研究方法分別計算囊胚中的內細胞團（inner cell mass，ICM）細胞數(shù)、滋養(yǎng)層細胞（trophectoderm，TE）數(shù)和總細胞數(shù)[15]。

1.6.2 不同處理組囊胚細胞凋亡相關因子檢測 最優(yōu)siRNA干擾mRNA處理組和對照組選取囊胚，每個重復選5枚，參照1.5.1方法提取囊胚mRNA，反轉錄合成第一鏈cDNA，利用qRT-PCR技術檢測不同處理組囊胚中和mRNA表達水平，采用相對定量法進行比較兩組之間表達差異。

選取siRNA干擾mRNA處理組和對照組選取囊胚各20枚，參照細胞蛋白提取試劑盒（英文特，SD-001）說明提取總蛋白，將蛋白與5×上樣緩沖液SDS混合，水浴變性10 min，加入蛋白樣品，利用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（Sodium dodecyl sulfate polyacrylamidegel electrophoresis，SDS-PAGE）分離蛋白，電轉膜至0.45 μmol·L-1的聚偏二氟乙烯膜（Polyvinylidene fluoride，PVDF）上，封閉2 h后在對應的PVDF膜上加入Bax和Bcl抗體，4 ℃過夜孵育，清洗3遍，用辣根過氧化物酶（horse radish peroxidase，HRP）標記二抗37 ℃作用1 h，清洗3遍，采用電化學發(fā)光（electrochemiluminescence，ECL）試劑在蛋白成像儀（Tanon 2500）內曝光，拍攝清晰蛋白條帶，根據(jù)蛋白條帶光密度采用相對定量方法計算比較蛋白表達差異。

同時參照1.5.2 PSPC1蛋白染色方法，先后用Bax（1﹕500）和Bcl-2（1﹕800）抗體作為一抗孵育囊胚，在分別用AlexaFluor488和異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）標記二抗與Bax和Bcl-2抗體反應，用2.5 ng·mL-1DAPI標記囊胚中所有細胞的細胞核，將不同熒光標記囊胚置于GE DeltaVision Elite活細胞工作站成像，觀察凋亡相關因子表達水平與定位。

1.7 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS16.0數(shù)據(jù)分析軟件對試驗結果進行單因素方差分析，不同處理組桑椹胚發(fā)育率和囊胚率分別以合子數(shù)和桑椹胚數(shù)為基數(shù)進行計算，每個處理組至少重復3遍，或至少選擇3個樣品。＜0.05 表示差異顯著，所有數(shù)據(jù)結果以“Mean ± SE”表示。

2 結果

2.1 牦牛胚胎早期發(fā)育核旁斑點形成觀察

DAPI標記不同階段的胚胎細胞核，GE DeltaVision Elite活細胞工作站熒光成像如圖2所示：各階段胚胎細胞核均可見細胞核小體，但2-細胞和4-細胞時期胚胎細胞核中的核小體更為清晰（圖2-B、C）。

A：合子；B：2-細胞胚胎；C：4-細胞胚胎；D：桑椹胚；E：D圖中紅的區(qū)域；F：囊胚；紅色箭頭所指為核旁核斑

2.2 不同發(fā)育階段牦牛胚胎PSPC1表達的變化

相對定量分析法比較不同發(fā)育階段牦牛胚胎中mRNA表達水平如圖3-A所示：牦牛胚胎發(fā)育2-細胞至桑椹胚階段mRNA呈現(xiàn)高水平表達，顯著高于合子階段和囊胚階段，其中桑椹胚和4-細胞階段胚胎mRNA表達水平最高，其表達水平分別為合子時期的3.54 ± 0.62和3.52 ± 0.26倍，且兩者差異不顯著（＞0.05），其次為2-細胞階段胚胎，表達水平為合子時期2.48 ± 0.08倍，囊胚mRNA表達水平略高于合子的表達水平，但兩者差異不顯著（＞0.05）。

根據(jù)不同階段胚胎mRNA表達水平檢測結果，本研究采用免疫熒光技術檢測合子、2-細胞、4-細胞和桑椹胚各階段胚胎PSPC1蛋白表達水平，結果如圖4所示：各階段胚胎中均可檢測到PSPC1蛋白，但4-細胞和桑椹胚階段胚胎中熒光強度最強，合子中僅呈現(xiàn)少量微弱熒光；在各階段胚胎中分裂細胞的整個細胞核和細胞質均可表達PSPC1蛋白，但主要以細胞核中的強熒光為主。

A: PSPC1; B: NEAT1; C: CARM1; D: P54nrb;誤差線上不同的字母表示差異極顯著(P＜0.05); 相同的字母表示差異不顯著(P＞0.05)

2.3 核旁斑點形成關鍵時期NEAT1、CARM1和P54nrb的表達

參照2.1和2.2的結果，采用qRT-PCR技術檢測合子、2-細胞、4-細胞、桑椹胚和囊胚中與核旁斑點形成相關的LncRNAs、及mRNA表達水平，如圖3-B—D所示：、及mRNA均在2-細胞到桑椹胚階段呈現(xiàn)高水平表達，其中在4細胞時期表達水平最高，顯著高于2-細胞和桑椹胚時期（＜0.05），2-細胞和桑椹胚時期的表達水平差異不顯著（＞0.05），合子和囊胚中的表達水平最低，兩者差異不顯著（＞0.05）。在2-細胞到桑椹胚階段呈現(xiàn)高水平表達，顯著高于囊胚和合子階段（＜0.05），但其中2-細胞至桑椹胚3個階段表達差異并不顯著（＞0.05）。4-細胞時期表達最高，其次為2細胞時期和桑椹胚時期，兩者差異不顯著（＞0.05），囊胚時期表達水平顯著低于合子階段（＜0.05）。

2.4 不同siRNAs干擾牦牛胚胎PSPC1 mRNA效果評價

受精12 h后，分別用siRNA1、siRNA2、siRNA3干擾合子mRNA，qRT-PCR檢測桑椹胚中mRNA顯示，3條siRNAs序列均可降低mRNA水平，其中siRNA1處理組mRNA水平最低，約為對照組的0.23 ± 0.01倍（圖5），可作為干擾牦牛胚胎早期mRNA最佳siRNA。

2.5 核旁斑點形成對胚胎發(fā)育和囊胚質量的影響

根據(jù)2.4的研究結果，選取siRNA1處理組和對照組胚胎繼續(xù)培養(yǎng)，比較后期胚胎發(fā)育能力。結果如表3所示，siRNA1處理組桑椹胚與囊胚發(fā)育率均顯著降低，桑椹胚發(fā)育率由對照組的（75.22±3.32）%降低到siRNA1處理組的（58.26±1.86）%，兩者之間差異顯著（＜0.05），囊胚率由對照組（41.17±2.23）%降低到siRNA1處理組（32.83±1.54）%，差異顯著（＜0.05），同時發(fā)現(xiàn)桑椹胚發(fā)育率降低幅度高于囊胚率降低幅度。

圖4 牦牛不同階段胚胎中PSPC1蛋白表達的免疫熒光檢測

通過對囊胚內總細胞用DAPI標記、TE細胞用CDX2熒光標記，熒光顯微鏡下觀察siRNA1處理組和對照組囊胚如圖6所示，不同細胞計數(shù)比較見表4、圖7，結果顯示siRNA1處理組囊胚內細胞總數(shù)低于對照組（＜0.05），其中主要以ICM細胞數(shù)低于對照組（＜0.05），TE細胞數(shù)在兩組之間的差異不顯著（＞0.05）。

2.6 核旁斑點形成對囊胚細胞凋亡的調控

qRT-PCR檢測siRNA1處理組和對照組囊胚中、mRNA相對表達量，如圖8所示：mRNA表達水平在siRNA1處理組囊胚中顯著增加（＜0.05），為對照組2.86 ± 0.16倍（圖 8-A），而相對表達顯著降低（＜0.05），為對照組0.48 ± 0.106倍（圖 8-B）。Bax、Bcl-2蛋白相對表達水平，如圖9所示，siRNA1處理組囊胚中Bax 蛋白相對表達量增加，為對照組2.13 ± 0.24倍（圖 9-B），而Bcl-2蛋白相對表達量降低，為對照組0.54 ± 0.11倍（圖9-C）。

誤差線上不同的字母表示差異極顯著(p＜0.05); 相同的字母表示差異不顯著(p＞0.05)

不同處理組囊胚中Bax和Bcl-2蛋白免疫熒光檢測顯示如圖10，siRNA1處理組囊胚中促凋亡相關因子Bax的標記熒光強度顯著高于對照組，抗凋亡蛋白Bcl-2熒光強度低于對照組，TE細胞和ICM細胞均可表達Bax和Bcl-2蛋白熒光，且Bcl-2熒光強度在siRNA1處理組囊胚ICM細胞顯著降低，而Bax熒光在siRNA1處理組囊胚ICM顯著增強。DAPI標記細胞核顯示在siRNA1處理組囊胚內細胞部分細胞核發(fā)生裂解，形成細胞凋亡碎片。

圖6 不同處理組牦牛囊胚的染色標記

3 討論

3.1 早期胚胎發(fā)育核旁斑點形成與分子機制

目前細胞核熒光標記只能檢測到細胞核亞單位結構[4]，很多學者通過將其與核旁斑點主要組成蛋白熒光檢測PSPC1相結合來確認核旁斑點是否形成[1,4]。附植前小鼠胚胎發(fā)育過程中核旁斑點與CARM1協(xié)同，主要聚集在2—4細胞時期胚胎細胞核中，敲除核旁斑點關鍵組成LncRNAs，胚胎發(fā)育在桑椹胚時期停止[18-19]，表明哺乳動物胚胎發(fā)育早期核旁斑點對其后續(xù)發(fā)育能力具有重要的調控作用。HeLa細胞中及任何一個的缺失都會影響細胞核核旁斑點的形成[20]。本研究發(fā)現(xiàn)牦牛早期胚胎核旁斑點形成關鍵時間為2-細胞至囊胚時期，其中以4-細胞時期最為顯著，該階段CARM1和主要組成NEAT1及p54nrb mRNA的動態(tài)表達趨勢與PSPC1具有相似性（圖3），證實哺乳動物胚胎中核旁斑點形式時間存在物種差異性，但主要形成機制和組成不存在動物種屬和細胞種類的差異，有些特殊細胞核旁斑點的形成還需要其他特定蛋白，如B淋巴細胞中的BCL11A，可介導PSPC1和p54nrb之間的相互作用[21]。

表3 干擾合子PSPC1 mRNA后胚胎發(fā)育能力

數(shù)據(jù)表示為：mean ± S.E.M (n=3)，同一列中不同字母表示組間差異顯著（＜0.05），相同字母表示組間差異不顯著（＞0.05）。桑葚胚率：桑葚胚胎數(shù)量/4-細胞胚胎數(shù)量；囊胚率：囊胚數(shù)量/桑椹胚胚胎數(shù)量

Data was presented mean ± S.E.M (n=3), the letters (a, b) within a row for a particular parameter differs significantly(＜0.05). The morula rate: number of morula/number of 4-cell embryo; the blastocyst rate: number of blastocyst/number of morula

表4 不同處理組第7天囊胚特征

數(shù)據(jù)表示為：mean ± S.E.M，同一列中不同字母表示組間差異極顯著（＜0.05），相同字母表示組間差異不顯著（＞0.05）

Data was presented mean ± S.E.M (n=5), the letters (a, b) within a row for a particular parameter differs significantly (＜0.05)

*表示差異顯著(P＜0.05) Bars with * are significantly different (P＜0.05)

A: Bax; B: Bcl-2;誤差線上不同的字母表示差異顯著(p＜0.05) A: Bax; B: Bcl-2; Bars with different letters are significantly different (p＜0.05)

A:Bax與Bcl蛋白的檢測; B:Bax相對表達水平; C: Bcl-2蛋白相對表達水平;誤差線上不同的字母表示差異顯著(p＜0.05)

圖10 不同處理組牦牛囊胚中Bax和Bcl-2蛋白免疫熒光標記

3.2 核旁斑點形成影響胚胎細胞命運決定

動物早期胚胎發(fā)育2細胞至桑椹胚時期是胚胎細胞定向分化和細胞命運決定的關鍵時期，但具體作用時間點需依據(jù)不同動物早期胚胎發(fā)育細胞命運決定關鍵時期研究結果而確定。敲除核旁斑點關鍵形成調控因子，小鼠胚胎中的CDX2表達水平上升，導致細胞向胚外層分化，影響胚胎細胞命運[22]。除此之外，發(fā)現(xiàn)癌細胞中核旁斑點組成因子受細胞多能性因子OCT4調控[23]。本研究干擾合子mRNA囊胚內的ICM細胞數(shù)顯著減少（圖6、7），證實早期核旁斑點形成與后續(xù)胚胎的細胞命運存在關聯(lián)。不同處理組間TE細胞數(shù)差異不顯著（圖7），而CDX2作為TE細胞的關鍵標記因子[24]，表明牦牛早期胚胎發(fā)育核旁斑點對TE細胞命運調控較低，可見不同物種及不同靶細胞之間細胞分子調控機制存在差異。

3.3 核旁斑點通過多種信號通路調節(jié)胚胎細胞凋亡

相關研究證實核旁斑點可通過多種信號通路調節(jié)細胞凋亡，當細胞凋亡啟動時細胞核通過蛋白水解酶復合體抑制NEAT1位點成熟核旁斑點釋放，導致其在染色體上延伸，影響其組裝完成，占據(jù)了染色體上富含脯氨酸和谷氨酰胺的剪接因子（splicing factor proline and glutamine rich，SFPQ）和p54nrb的形成空間，進而細胞核內SFPQ和p54nrb水平顯著降低[25-26]。已有研究證明SFPQ可通過誘導細胞壞死信號通路關鍵蛋白促進細胞凋亡，如干擾素刺激基因（interferon- stimulated genes，ISGs）、BCL-2結合元件[10, 26-27]。本研究中干擾牦牛mRNA，囊胚細胞凋亡水平顯著增加（圖8、9），導致該處理組ICM細胞數(shù)降低，Bax和Bcl-2蛋白的熒光定位證實囊胚中ICM和TE細胞凋亡均受早期胚胎核旁斑點影響，推測核旁斑點影響囊胚附植能力。癌細胞和神經(jīng)元細胞中NEAT1通過p53或調控胞內miRNA表達影響細胞凋亡[28-29]，miRNA上升時通過dsRNA反應修飾介導細胞凋亡，miRNA下降時，細胞凋亡的發(fā)生主要受ISG轉錄影響[30]。牦牛生殖調控中p53和miRNA介導多種信號影響精子生成和胚胎發(fā)育[31-33]，但核旁斑點是否通過p53和miRNA調控其早期胚胎質量仍需相關研究證實。

3.4 牦牛胚胎核旁斑點形成與自身生理特性潛在聯(lián)系

牦牛生長環(huán)境和自身生理結構具有獨特性，其生長調控易受相關生理應激影響，如牦牛胚胎早期胚胎發(fā)育由于HIF-1α介導，使其具有較強的低氧適應性，且會影響后續(xù)細胞多能性因子如NANOG、OCT4和SOX2表達[34]。除胚胎外，相關研究顯示HIF-1α在低氧應激刺激牦牛肺動脈平滑肌細胞時可促進細胞增殖[35]，進一步證明HIF-1α對牦牛生理調控至關重要。核旁斑點作為新發(fā)現(xiàn)的調節(jié)機體和細胞適應低氧等環(huán)境應激的亞細胞核結構，主要通過HIF與NEAT1相互作用阻礙核內蛋白，也可通過p54nrb介導其他因子調控細胞低氧適應性，如細胞黏附分子F11R[36]。低氧條件下NEAT1參與核旁斑點形成調控[9]，當?shù)脱鯘舛然謴驼Ｋ綍r，核旁斑點消失[10]，低氧又作為胚胎早期胚胎發(fā)育關鍵影響因素，參與后續(xù)胚胎細胞的分化[37]。證實哺乳動物胚胎發(fā)育過程中核旁斑點與低氧應激存在互相調控關系。本研究以牦牛的早期發(fā)育胚胎為試驗材料，探索核旁斑點形成機制，有效的將低氧應激和核旁斑點形成結合在一起，有助于揭示哺乳動物早期胚胎發(fā)育核旁斑點與低氧調控的相互關系。

4 結論

牦牛早期胚胎發(fā)育核旁斑點形成的關鍵時期為2-細胞至桑椹胚階段，其中主要集中在4-細胞時期，且PSPC1與、和在牦牛早期胚胎發(fā)育核旁斑點形成時期呈現(xiàn)高水平表達。干擾合子mRNA表達可降低后續(xù)胚胎發(fā)育能力，以4-細胞至桑椹胚發(fā)育率降低為主，同時其可降低囊胚中ICM細胞數(shù)及細胞凋亡水平，影響囊胚質量（圖11）。研究結果為進一步探索核旁斑點參與哺乳動物早期胚胎發(fā)育的調控制提供了科學依據(jù)，有助于以核旁斑點為靶點，改善牦牛早期胚胎的發(fā)育能力和胚胎質量，促進牦牛體外胚胎生產(chǎn)技術的發(fā)展。

牦牛早期胚胎發(fā)育核旁斑點形成時期為2細胞至桑椹胚階段，且PSPC1與NEAT1、CRAM1和p54nrb呈高水平表達；干擾PSPC1mRNA，降低桑椹胚發(fā)育率，增加囊胚細胞凋亡，降低ICM細胞數(shù)

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Formation and Function of Paraspeckle During Pre-implantation Embryos Development in Yak

1College of Veterinary Medicine, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070;2Gansu Province Livestock Embryo Engineering Research Center, Lanzhou 730070

【Objective】The aim of present study was to identify of paraspeckle formation stages during the early embryonic development in yak (). Furthermore, the long non-coding RNAs (LncRNAs) involved in paraspeckle formation were determined, and the effects and regulatory mechanism of their formation on the subsequent developmental ability of yak embryos were studied. 【Method】The yak embryos were produced by(IVF), DAPI staining of embryonic nuclei combined with paraspeckle protein 1 () mRNA detection were done by quantitative real-time fluorescence PCR (qRT-PCR) at different stages in order to confirm paraspeckle formation. PSPC1 protein in embryos was verified by immunofluorescence technique. The levels of encoding nuclear paraspeckle assembly transcript 1 (NEAT1), coactivator associated arginine methyl transferase 1 (CARM1) and non-POU domain containing octamer-binding protein () mRNAs were also detected by qRT-PCR at different stages. The mRNA level of PSPC1 in zygote was inhibited by RNA interference technology, and the developmental rate of embryos in subsequent stages was compared. The blastocyst quality was evaluated by analyzing the number of total cells, trophoblast cells (TE) and inner cell mass (ICM). B-cell lymphoma/leukemia-2 (Bcl-2) and b-cell lymphoma/leukemia associated X protein (Bax) in blastocysts form in the control andmRNA interference groups was detected. 【Result】(1) Paraspeckle could be observed in the nuclei of embryos at all different stages; however, nuclei could be more clearly seen at 2-cell stage and 4-cell stage. ThemRNA was higher in yak embryos from 2-cell to morula stage, which was the highest in embryos at 4-cell embryos and morula. The fluorescence intensity ofprotein was the strongest in embryos from those stages. (2) The levels of,andmRNA were higher from 2-cell to morula stage than that from other stages.andwere found to be highest in embryos at 4-cell stage, while CARM1 was not significantly different from 2-cell to morula stage (＞0.05). (3) The developmental rates of morula and blastocyst inmRNA interference group were reduced, which was more significantly reduced in morula rate. The total number of blastocyst cells inmRNA interference group was significantly lower than that in the control group, which was mainly caused by ICM reduction. There was no significant difference in number of TE between the two groups. (4) The levels ofmRNA and protein were enhanced in blastocyst forminterference group, while the levels ofmRNA and protein were reduced in blastocyst, and the cell lysis was observed in ICM.【Conclusion】The paraspeckle was formed at 2-cell to morula stage transition in the yak embryo, which was more prominent in 4-cell stage. The expression of PSPC1, NEAT1, CRAM1 and p54nrb in the stages of paraspeckle formation were on high levels. Interference withmRNA in yak zygotes resulted in decreased developmental ability of subsequent embryo. The blastocyst quality was also reduced by inducing apoptosis of inner cell mass, which was also involved in the regulation of cell fate determination in early embryo development.

yak; paraspeckle; cell fate; apoptosis; LncRNAs

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.06.014

2021-11-23；

2022-04-28

國家自然科學基金（31972760、32160859）、甘肅省杰出青年基金（20JR10RA561）、甘肅省教育廳創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)能力提升項目（2019B-081）、甘肅農(nóng)業(yè)大學伏羲青年英才基金（Gaufx-02Y10）、甘肅農(nóng)業(yè)大學博士科研啟動基金（GSAU-RCZX201701）

潘陽陽，E-mail：panyangyang_2007@126.com。通信作者余四九，E-mail：sjyu@163.com

（責任編輯 林鑒非）