張 茜，王 暢，梁 琛，曲星源，劉 悅，閆寶君，王 雷

組織工程學(xué)和生物材料學(xué)被認為是發(fā)展再生移植修復(fù)骨缺損的重要方式。組織工程學(xué)意在將生物材料、細胞以及生物活性分子結(jié)合起來，恢復(fù)或改善受損或病變組織的生物功能[1]。在組織工程學(xué)中，為了提高細胞活力、附著、增殖和歸巢、成骨分化、血管化、宿主整合和承重[2]，人們研究了大量的支架材料，發(fā)現(xiàn)了硫酸軟骨素(chondroitin sulfate，CS)在骨再生修復(fù)中具有潛在的功效。CS是一類硫酸化的陰離子酸性黏多糖，具有多種生物學(xué)特性，本文擬就CS的生物學(xué)特性、在成骨修復(fù)中的作用及在骨組織工程中的應(yīng)用作一綜述。

1 硫酸軟骨素的生物學(xué)特性

CS由D-葡糖醛酸(glucuronic acid，Glc A)和N-乙酰-D-氨基半乳糖(N-acetyl-D-galactosamine hydrate，Gal NAc)通過β-1，3糖苷鍵重復(fù)連接而成，一般含有50～70個二糖單位[3]，廣泛分布于組織細胞外基質(zhì)和細胞表面，在生物體內(nèi)多以蛋白多糖的形式存在，是構(gòu)成動物軟骨、腱、氣管、喉骨、皮膚等結(jié)締組織的重要組成部分[4]。根據(jù)硫酸鹽基團在N-乙酸基-D-氨基半乳糖中位置不同， 可分為硫酸軟骨素O、A、C、D、E等，即CS-O、CS-A、CS-C、CS-D、CS-E等[5]。除了硫酸鹽基團位置的可變性外，不同的硫酸鹽基團也具有明顯不同的生物活性，例如巖藻糖基硫酸軟骨素的硫酸化巖藻糖殘基有抗炎、刺激造血等多種活性[6]。CS具有重要的生物學(xué)特性，研究表明，CS具有促進軟骨再生、抗炎[7]、抗氧化[8]等功效。CS發(fā)揮作用主要依靠兩種方式：一是自身帶電荷的離子基團與其他物質(zhì)發(fā)生作用；二是調(diào)節(jié)信號通路中的生物分子進而引發(fā)機體反應(yīng)。

1.1 電荷相互作用

由于CS是一類硫酸化的陰離子酸性黏多糖，帶負電荷的它具有吸引離子的潛力，其磺酸基和羧酸鹽基可與帶正電荷的基團，如鈣離子，通過離子鍵發(fā)生強烈反應(yīng)，形成共價鍵，從而能夠在礦化中心分離鈣離子，并控制骨組織鈣化時的晶體生長[9]。此外，研究表明，CS還可通過離子相互作用與蛋白質(zhì)共價結(jié)合，例如與細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的各種生長因子和成分結(jié)合，而其中一些蛋白質(zhì)可能具有致敏和(或)不耐受能力，能夠引發(fā)機體免疫反應(yīng)，并賦予CS抗氧化特性，減少骨破壞、軟骨細胞死亡和基質(zhì)成分的分解[10-12]。

1.2 調(diào)節(jié)信號分子

研究發(fā)現(xiàn)，CS可以作為可溶性配體的共同受體，參與Wnt信號通路(Wnts)，與成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factors，F(xiàn)GFs)、轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)、骨形成蛋白(bone morphogenetic proteins，BMPs)和其他細胞因子相互作用，調(diào)節(jié)細胞形態(tài)發(fā)生，參與成骨[5，13]。Korotkyi等[14]將CS應(yīng)用于骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)，發(fā)現(xiàn)CS抑制軟骨細胞和滑膜細胞中核因子-κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)亞基1的激活和核轉(zhuǎn)位。 NF-κB是一種關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子，調(diào)控許多參與組織炎癥和細胞募集的病理生理學(xué)的基因表達[15]。由此推斷，CS可調(diào)節(jié)炎癥通路，降低炎癥因子水平，減少軟骨細胞損傷，從而調(diào)節(jié)軟骨下骨的改建。

2 硫酸軟骨素的促進成骨修復(fù)作用

骨的生成是一系列復(fù)雜的生物化學(xué)發(fā)展過程，可分為骨細胞的增殖、細胞外基質(zhì)的聚集和骨組織的礦化三個時期[16]。在此過程中，ECM分子在組織生長和細胞分化過程中起著關(guān)鍵作用， 而CS是ECM分子的重要組成部分。研究發(fā)現(xiàn)，CS可以通過包括調(diào)節(jié)成骨分化、免疫調(diào)節(jié)、促進細胞增殖和生物礦化在內(nèi)的多種途徑促進骨的修復(fù)和新骨形成[17-18]。

2.1 調(diào)節(jié)成骨分化

在成骨分化過程中，細胞因子的表達起關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)，CS與BMP-2協(xié)同促進干細胞成骨分化，促進堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、骨鈣素(osteocalcin，OCN)和Ⅰ型膠原蛋白(collagen Ⅰ，COLⅠ)的表達[17]。ALP是成骨細胞基質(zhì)成熟的生物標志物，OCN是一類維生素K依賴的鈣結(jié)合蛋白，這兩者是參與成骨分化和ECM礦化過程的重要成分[19]。此外，CS還可以通過Smad1-Smad5-Smad8途徑發(fā)出信號，以增加與Runt相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子2(runt-related transcription factors 2，Runx2)的表達[20]。Runx2是成骨細胞分化過程中的重要轉(zhuǎn)錄因子，在間充質(zhì)和其他干細胞成骨分化開始時具有重要意義，它作用于下游信號，促進重要成骨細胞蛋白的表達[21]。此外，Elango等[22]基于成骨細胞對破骨發(fā)生的旁分泌研究發(fā)現(xiàn)，CS可下調(diào)破骨細胞分化因子(receptor activator of nuclear factor-κ B ligand， RANKL)的表達，減少破骨的發(fā)生，促進新骨生成。由上可知，CS通過促進成骨標志物和/或降低破骨因子的表達來調(diào)節(jié)成骨。

2.2 免疫調(diào)節(jié)

免疫調(diào)節(jié)在成骨過程中發(fā)揮重要作用，研究證實CS具有顯著的免疫調(diào)節(jié)功能，可以通過重塑局部免疫微環(huán)境、抑制纖維增生調(diào)節(jié)干細胞向成骨分化，上調(diào)成骨標志物表達，促進骨再生[17]。局部免疫微環(huán)境的改變離不開免疫細胞和調(diào)節(jié)因子的作用，而不同的淋巴細胞亞群及相關(guān)細胞因子在成骨過程中發(fā)揮了特定的作用。免疫細胞在骨損傷后立即進入骨破壞部位，并通過向損傷部位招募輔助細胞來促進愈合的初始階段。有證據(jù)表明，活化的T淋巴細胞可以通過可溶性因子(如RANKL)的產(chǎn)生促進成骨細胞的成熟，有利于骨的修復(fù)[23]。事實上，在骨損傷后，炎癥反應(yīng)隨即發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，炎癥細胞因子的積累可介導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷，促進破骨細胞增殖，增加骨吸收，從而導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥[24]。 由此可見，如果可以減輕炎癥的發(fā)生發(fā)展，就可以減少骨組織的破壞，進而促進骨再生。Li等[2]發(fā)現(xiàn)，CS能調(diào)節(jié)巨噬細胞從M1向M2的表型轉(zhuǎn)換，促進白細胞介素(interleukin，IL)-4、IL-10和TGF-β等修復(fù)細胞因子的表達，將局部免疫微環(huán)境狀態(tài)從致炎轉(zhuǎn)變?yōu)榭寡祝龠M干細胞募集、黏附和增殖，上調(diào)成骨標志物的表達，實現(xiàn)骨修復(fù)。此外，CS有效減少金屬蛋白酶-9 (metalloproteinase-9，MMP-9)、IL-1β、IL-6和腫瘤壞死因子α(tumour necrosis factor α，TNF-α)等致炎因子水平的增加，減少炎癥的積累，為骨穩(wěn)態(tài)的平衡提供了幫助[25]。顯然，這些炎癥分子的表達和(或)活性的降低可能解釋了CS發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)作用的機制。然而，免疫調(diào)節(jié)成骨是一個非常復(fù)雜的過程，需要局部免疫反應(yīng)激活細胞成骨標志物表達，在信號的刺激下新骨形成[26]，而CS在此過程中的具體作用仍需進一步研究。

2.3 調(diào)節(jié)生物礦化

在骨再生過程中，生物礦化是硬化組織的一個重要過程。最常見的生物礦化物是鈣和磷酸鹽，它們與有機聚合物結(jié)合形成磷灰石晶體，為骨骼提供結(jié)構(gòu)支持。CS作為非膠原蛋白聚糖之一，在調(diào)節(jié)軟骨和骨組織的生物礦化中起著至關(guān)重要的作用。Kim等[18]在研究中發(fā)現(xiàn)，利用CS作為成核位點，初始時可以有效吸收鈣離子，并吸引一些負離子，如磷酸鹽，進行鈣磷沉積，加速生物礦化過程?？梢姡珻S具有積聚離子的潛力，可誘導(dǎo)細胞的生物礦化促進成骨。

2.4 促進細胞增殖

骨修復(fù)離不開骨細胞增殖。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，CS通過激活TGF-β/Smads通路，誘導(dǎo)細胞內(nèi)鈣離子水平升高，影響細胞周期，對軟骨細胞產(chǎn)生增殖作用[27]；CS可影響生長因子和其他細胞因子的固定，并通過整合素或其他特定受體與骨細胞(如成骨細胞和破骨細胞)相互作用，直接或間接影響這些細胞的黏附、遷移、生長、增殖和分化[28]。

2.5 其他

除了上述作用，CS還具有選擇性蛋白結(jié)合抗性，可以降低血小板黏附，促進內(nèi)皮細胞和間充質(zhì)細胞的黏附[12]，進而促進細胞的分化，有利于骨的改建。

3 硫酸軟骨素在骨組織工程中的應(yīng)用

CS作為一種資源豐富性能優(yōu)異的生物分子， 因其顯著的骨修復(fù)作用而被廣泛用于骨組織工程醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，尤其是在顱面和口腔醫(yī)學(xué)。骨組織工程是利用支架材料誘導(dǎo)周圍組織成骨， 或?qū)⒅Ъ懿牧献鳛橹踩牍羌毎蚱渌幬锏妮d體或模板[29]。研究表明，CS被廣泛應(yīng)用于細胞支架、表面涂層、生物黏合劑及藥物遞送系統(tǒng)等，形式多種多樣。Singh等[9]制備了CS與殼聚糖、納米生物玻璃結(jié)合的復(fù)合支架，發(fā)現(xiàn)CS促進COLⅠ的表達和生物礦化，增強ALP活性，證實了該復(fù)合支架促組織再生的潛力。Andrews等[13]制備了CS糖胺聚糖支架水凝膠，并研究其對重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白傳遞的適用性，證實了它可調(diào)節(jié)骨TGF-β1和BMPs信號，并介導(dǎo)臨界大小的骨缺損的再生，增強成骨細胞礦化。Ye等[19]制備神經(jīng)生長因子——硫酸軟骨素/羥基磷灰石(neurogrowth factor-chondroitin sulfate/hydroxyapatite，NGF-CS/HA)復(fù)合鈦涂層，證明此涂層能夠顯著提高ALP活性，上調(diào)OCN和Runx2，對骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)向成骨細胞的分化有顯著的促進作用。Kong等[21]將CS和COLⅠ組裝到聚乳酸-羥基乙酸共聚物表面的仿生涂層，結(jié)果顯示其也能夠支持BMSCs的附著、增殖和成骨分化。除此而外，有學(xué)者將CS引入磷酸鈣水泥(calcium phosphate cement，CPC)中，發(fā)現(xiàn)CS-CPCs加速了纖維連接蛋白的優(yōu)先吸附，上調(diào)了BMSCs中骨橋蛋白(osteopontin，OPN)和ALP的表達，改善了BMSCs的黏附、增殖和成骨分化[28]。還有學(xué)者將硫酸軟骨素用于軟骨再生的ECM生物墨水，為BMSCs的軟骨分化提供了理想的化學(xué)和機械微環(huán)境[30]。越來越多的研究表明，CS可與高分子化合物和生物活性分子物質(zhì)用于仿生材料復(fù)合物制備，證實CS在成骨修復(fù)中的作用。

4 展 望

在組織工程醫(yī)學(xué)中，CS仿生材料引起顯著的關(guān)注，其與基因治療相結(jié)合成為研究熱點。然而，由于CS種類繁多，應(yīng)用形式多樣，材料各組分比例也會影響成效，CS促進成骨的具體機制仍需進一步研究。此外有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，天然CS具有復(fù)雜的結(jié)構(gòu)和不均勻的組成，導(dǎo)致其生理功能和應(yīng)用受到明顯的限制[31]。近年來，天然CS在分子水平上已經(jīng)為調(diào)控細胞行為提供了一種有效的策略，但如何合理設(shè)計和合成具有特殊成分和結(jié)構(gòu)的CS仿生材料協(xié)同調(diào)控細胞成骨和成軟骨分化仍然是一個巨大的挑戰(zhàn)。因此，在未來的研究中，希望不僅關(guān)注CS仿生應(yīng)用，還有CS在骨修復(fù)中的調(diào)控機制。同樣要指出的是，高性能CS的質(zhì)量是制劑安全和有效的先決條件[32]?？傊延醒芯孔C明了CS在骨再生修復(fù)方面的潛力和在組織工程學(xué)中廣闊應(yīng)用的前景，在未來的應(yīng)用中，CS應(yīng)該是一種值得青睞的選擇。