李雪恒 李龍

特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是一種慢性進行性纖維性間質(zhì)性肺炎，其特征是進行性肺瘢痕形成和常見間質(zhì)性肺炎的組織學表現(xiàn)。確診IPF主要依靠臨床病史、體格檢查、實驗室檢查、肺功能、胸部高分辨率CT和組織病理學的結(jié)合，并且排除其它病因的間質(zhì)性肺病[1]。數(shù)據(jù)表明[2]，IPF診斷后的中位生存期約為2～3年，男性發(fā)病多于女性，常見于老年人，尤其是75歲以后的患病率和發(fā)病率更高。由于IPF是一種致命性疾病，目前可用的治療方法療效有限，因此早期的精確診斷非常重要。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)[3-4]，熱休克蛋白47(heat shock protein 47，HSP47)與IPF有千絲萬縷的聯(lián)系，抑制HSP47的表達可以影響生物體內(nèi)膠原蛋白的合成，進而抑制肺纖維化的進展。因此，本文就HSP47與IPF發(fā)病相關(guān)性的研究進展作一綜述。

一、HSP47及其生物學功能

熱休克蛋白(heat shock protein，HSP)是一類存在于所有生物界中的高度保守的蛋白質(zhì)，按照分子量大小和彼此聯(lián)系的密切程度，HSP又可分為：HSP110、HSP100、HSP90、HSP70、HSP60、HSP40 和小HSP等家族。HSP能與很多蛋白質(zhì)分子結(jié)合，在生物體內(nèi)發(fā)揮多種生理功能，包括新生多肽鏈的正確折疊、變性蛋白質(zhì)的重新折疊、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運和天然蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定化等[5]。

HSP47是一種定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum，ER)的小分子量HSP，是各種膠原蛋白正確折疊和分泌所必需的重要伴侶，該蛋白最早在雞胚成纖維細胞中被描述為一種能與I型膠原結(jié)合的HSP，后來通過對其核苷酸序列的測定，證實HSP47雖然缺乏絲氨酸蛋白酶抑制活性，但由SERPINH1基因編碼,屬于serpin家族[6]。在正常的生理情況下，生物體內(nèi)均存在一定程度的HSP47表達，它廣泛存在于體內(nèi)能夠表達膠原的細胞中，如纖維原細胞、平滑肌細胞等，參與前膠原的加工、折疊、聚合和分泌等過程，促進膠原的順利合成。

HSP47作用的特異性底物是膠原，膠原是哺乳動物中含量最豐富的蛋白質(zhì)，擁有特殊的三螺旋結(jié)構(gòu)，由Gly-XY重復序列組成，HSP47 C末端具有ER滯留信號序列RDEL，專門識別膠原蛋白的三螺旋區(qū)域。HSP47與ER中的原膠原瞬時結(jié)合，以pH依賴性方式在順式高爾基體或ER-高爾基體中間隔室中解離，然后通過其RDEL保留序列轉(zhuǎn)運回ER[6-7]。另有實驗發(fā)現(xiàn)[8]，HSP47還直接與富含亮氨酸的小蛋白家族核心蛋白聚糖、lumican和纖維調(diào)節(jié)蛋白相互作用，HSP47在核心蛋白聚糖存在下影響I型膠原原纖維的形成，特別是在原纖維生成的開始和結(jié)束時。

二、HSP47與IPF

1 HSP47與IPF發(fā)病關(guān)系

(1)HSP47在IPF膠原合成中的作用。IPF是一種膠原蛋白相關(guān)疾病，這種疾病的特征是膠原蛋白的異常積累和HSP47的表達增加。HSP47是一種膠原蛋白特異性分子伴侶，在ER中的膠原生物合成和原膠原的質(zhì)量控制中起關(guān)鍵作用[9]。有研究發(fā)現(xiàn)[10]，在不存在HSP47的情況下，在正常培養(yǎng)溫度下可以觀察到膠原生物合成的各種缺陷,例如在ER中的積累、過度修飾包括脯氨酰羥基化、賴氨酰羥基化和進一步的糖基化，以及I型膠原同源三聚體的異常分泌，最終導致分泌的未折疊或錯誤折疊的對蛋白酶消化敏感的膠原蛋白的比例增加。而在IPF患者體內(nèi)，HSP47高度表達，這導致膠原的正確合成和分泌增加，膠原異常積累，從而促進肺纖維化的發(fā)生[11]。

目前已有多項siRNA介導的HSP47敲低的實驗所證實[12-14]，抑制HSP47表達可以抑制膠原蛋白的積累，從而抑制IPF的進展。例如，HSP47的選擇性藥理學抑制劑COL003可競爭性抑制HSP47與小鼠胚胎成纖維細胞中的前膠原蛋白之間的相互作用，減少膠原蛋白的分泌，從而抑制纖維化[3,14]。Takuto Miyamura等人[4]為了評估HSP47抑制劑對體外膠原合成和肺纖維化過程的影響而進行了一項實驗，他們通過蛋白質(zhì)印跡評估了膠原蛋白的表達，并分別通過3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑測定和劃痕試驗確定人和小鼠肺中的細胞活力和遷移成纖維細胞，最后發(fā)現(xiàn)，HSP47抑制劑以劑量依賴性方式降低轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)處理的肺成纖維細胞中I型膠原蛋白的表達，同時還降低了肺成纖維細胞的活力和細胞遷移能力。

(2)HSP47 與IPF相關(guān)細胞及細胞因子。IPF主要表現(xiàn)為彌漫性肺泡炎癥、肺泡結(jié)構(gòu)紊亂和肺纖維化形成，其特征是上皮損傷和異常組織修復，其中活化的效應細胞主要是成纖維細胞和肌成纖維細胞。實驗發(fā)現(xiàn)[15]，HSP47影響成纖維細胞的膠原代謝，在HSP47高表達的成纖維細胞中，膠原蛋白的mRNA及蛋白質(zhì)表達會顯著增加，而在HSP47敲除的成纖維細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，膠原蛋白的分泌緩慢，最終被自噬降解，導致膠原合成減少。

HSP47的表達調(diào)控受各種細胞因子的影響，其中尤以轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)最為重要。TGF-β是成纖維細胞的關(guān)鍵激活劑，是纖維化反應的中心細胞效應器，也可能通過促進免疫和血管細胞中的纖維化表型發(fā)揮作用[16]。TGF-β有3個亞型，人體細胞中含量最高的是TGF-β1，它是參與肌成纖維細胞分化和促纖維化微環(huán)境創(chuàng)建的主要生長因子。已有研究證實[4，17-18]，體外TGF-β1可以誘導成纖維細胞、上皮細胞等多種細胞表達HSP47，也可以在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)HSP47的表達，是促進HSP47表達的主要細胞因子。有國外學者使用各種細胞因子處理成纖維細胞來誘導HSP47表達，最終發(fā)現(xiàn)[17]，在Th1細胞因子(IFN-γ和TNF-α)、Th2細胞因子(IL-4和IL-13)、促炎細胞因子(TGF-β1)、Th17細胞因子 (IL-17A)、Toll樣受體配體和IL-1β等各種細胞因子中，只有TGF-β1顯著增加HSP47水平，而且，TGF-β1可以以劑量依賴性方式同時增加HSP47mRNA和蛋白質(zhì)表達。

在真核生物中，熱休克反應受熱休克轉(zhuǎn)錄因子(heat shock transcription factor，HSF)家族的調(diào)控，其中，HSF1主要負責調(diào)節(jié)哺乳動物細胞中的經(jīng)典HSR[19]。有研究表明，HSP47的表達受HSF1的轉(zhuǎn)錄控制，在熱休克時，HSF1與位于HSP47轉(zhuǎn)錄起始位點-180 bp的熱休克元件結(jié)合，并激活HSP47 mRNA的轉(zhuǎn)錄，從而促進HSP47的表達。通過siRNA沉默HSF1可以阻止HSP47的誘導和隨后的膠原蛋白生成，而HSF1的過表達則恢復了HSP47的表達水平以及膠原蛋白生成[20]。此外，也有研究發(fā)現(xiàn)，肺上皮中的HSR以及HSF1的激活會改變肺纖維化相關(guān)基因的表達，它們對IPF的發(fā)生發(fā)展有著一定的影響[21]。

(3)HSP47 與IPF相關(guān)信號通路。近年來發(fā)現(xiàn)，某些信號通路可以促進IPF的進展，這些信號通路可能和HSP47的致纖維化作用有關(guān)。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)家族是參與IPF的重要信號通路之一，可分為4個亞族：ERK、p38、JNK和ERK5。越來越多的證據(jù)證實，抑制MAPK信號通路可以抑制IPF的進展[22-23]。ERK1/2和JNK可以調(diào)節(jié)熱休克轉(zhuǎn)錄因子，進而調(diào)節(jié)幾乎所有HSP的合成[24]。由于HSP47是HSP家族的成員，因此有學者推測ERK1/2和JNK將參與HSP47的誘導表達，他們通過實驗[25]首先證明TGF-β1處理HK-2細胞可激活ERK1/2和JNK通路，并且顯著增加了HSP47的表達水平，隨后使用ERK1/2和JNK MAPK抑制劑抑制ERK1/2和JNK信號，結(jié)果清楚地表明，體外誘導的HK-2細胞中HSP47表達水平也會隨之降低，進而減少膠原蛋白表達以減輕纖維化程度。

(4)HSP47 與IPF相關(guān)基質(zhì)金屬蛋白酶?；|(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是鋅依賴性內(nèi)切蛋白酶家族，可以降解細胞外基質(zhì)的所有成分和許多非基質(zhì)蛋白，因其在異常纖維化過程中的作用而被廣泛研究。MMPs的表達及調(diào)控機制比較復雜，因此，其在誘導肺纖維化損傷中的具體作用尚未被研究透徹，一些MMPs的作用是促纖維化，而其它的則具有抗纖維化功能[26-27]?，F(xiàn)有研究顯示，HSP與MMPs之間有著密切聯(lián)系，例如，HSP家族的一些成員是由MMP3誘導的，且MMP3和熱休克因子1(HSF1)具有共調(diào)節(jié)作用，細胞內(nèi)的MMP3和HSF1協(xié)同控制某些HSP基因的啟動子區(qū)[28]。目前研究表明，HSP與MMPs在某些疾病的發(fā)生中相互關(guān)聯(lián)[29-31]，例如，HSP可以通過與HSP27的界面位點AA29-40處的MMP-2和MMP-9直接相互作用促進膠質(zhì)母細胞瘤腫瘤細胞中的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和細胞外基質(zhì)重塑[29]。有學者在實驗模型動物的進行性纖維化過程中觀察到，HSP47的表達水平及MMP-2和MMP-9活性均增加，同時MMPs的組織抑制劑也增加，而且HSP47的表達水平更高，組織抑制劑的表達水平也更高[31]。

2 HSP47對于IPF的臨床意義及藥物治療

在一項臨床試驗中[32]，研究人員以加重期IPF患者、穩(wěn)定期IPF患者和健康者為研究對象，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗測定各組血清HSP47水平，結(jié)果表明血清HSP47水平加重期患者高于穩(wěn)定期患者，穩(wěn)定期患者高于健康者。故而可以得出，IPF患者血清中HSP47水平隨著病情的加重而升高，檢測血清HSP47水平有利于輔助評估IPF患者的病情嚴重程度。

盡管IPF發(fā)病率逐年增加，但目前尚無能夠治愈IPF的藥物。某些學者通過研究發(fā)現(xiàn)[33]，HSP47的功能障礙可以通過兩種伴隨方式減輕纖維化：抑制膠原蛋白分泌和誘導膠原蛋白產(chǎn)生細胞凋亡。因此，HSP47的下調(diào)或HSP47功能的化學抑制代表了一種治療各種纖維化的新治療策略。

吡非尼酮是一種新型抗纖維化、抗炎和抗氧化化合物，在多個關(guān)于吡非尼酮的臨床試驗中，與安慰劑相比，吡非尼酮可有效減慢IPF患者的疾病進展[34-35]。另有多項研究發(fā)現(xiàn)[36-37]，吡非尼酮抗纖維化作用不僅可能通過直接抑制I型膠原蛋白表達介導，還可能通過抑制肺泡上皮細胞中HSP47表達介導，導致膠原蛋白合成減少，從而抑制纖維化疾病的進展。

從某些中藥中提取到的一些物質(zhì)也能通過抑制HSP47而達到抗肺纖維化的作用。青蒿琥酯是青蒿素的水溶性半琥珀酸鹽衍生物，具有抗炎、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等多種藥理活性[38]。研究發(fā)現(xiàn)，青蒿琥酯能夠減少人胚肺成纖維細胞膠原的產(chǎn)生，另有研究人員通過復制大鼠肺纖維化模型，觀察到使用青蒿琥酯干預能夠顯著降低HSP47水平，這與膠原的變化趨勢相同[39]。大黃素，一種從大黃中提取的主要生物活性蒽醌衍生物，被認為具有多種藥理作用，包括抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗纖維化、抗腫瘤、抗病毒、抗菌等[40]。GuanRuijuan等人進行的大鼠實驗結(jié)果證實，大黃素可以通過抑制TGF-β1信號傳導來抑制HSP47表達以及細胞外基質(zhì)沉積，顯著緩解大鼠的肺水腫和肺纖維化程度，發(fā)揮其抗肺纖維化作用[41]。

某研究[12]測試了ND-L02-s0201在臨床前肺纖維化模型中的功效，ND-L02-s0201是一種脂質(zhì)納米顆粒，包裹了一種siRNA，可抑制HSP47的表達。在博來霉素誘導的大鼠肺纖維化模型中，他們證明了ND-L02-s0201治療后相對肺重量、膠原沉積和組織學以及纖維化評分的劑量依賴性和統(tǒng)計學顯著降低。同時在二氧化硅誘導的大鼠肺纖維化模型中也觀察到了ND-L02-s0201的抗纖維化作用，ND-L02-s0201的干預導致小鼠肺組織病理學改變的改善并阻止了纖維化的惡化。最后可以得出結(jié)論，ND-L02-s0201逆轉(zhuǎn)肺間質(zhì)纖維化，恢復肺的結(jié)構(gòu)完整性，并改善臨床前大鼠模型的肺功能。因此，體內(nèi)HSP47表達水平和IPF的發(fā)生有一定的相關(guān)性，抑制HSP47的表達可以抑制肺纖維化的進展，甚至可能逆轉(zhuǎn)肺纖維化。

總體而言，這些研究可以證明HSP47是IPF的潛在治療靶點，HSP47可能通過抑制膠原蛋白的過度表達來介導抗纖維化作用，這些均可以為設計更有效的治療肺纖維化的藥物提供一定基礎(chǔ)。

三、小 結(jié)

IPF是一種慢性進展性肺部疾病，通常無法逆轉(zhuǎn)，總體預后較差，而且目前可用的治療方法療效有限。越來越多的證據(jù)表明,HSP47可以作為未來潛在治療IPF的靶點，抑制HSP47的小化合物將是治療肺纖維化的有希望的候選者，有望為IPF提供新的治療方向和思路，因此，我們?nèi)孕韪由钊氲靥剿饕云錇榘悬c的肺纖維化發(fā)病機制及其表達調(diào)控，同時HSP47與IPF發(fā)病相關(guān)物質(zhì)之間具體相互作用機制也需要進一步的研究。本文總結(jié)了HSP47與IPF發(fā)病相關(guān)的研究成果，并闡述了HSP47的臨床意義，旨在指導臨床治療。