張宇昊，馬衛(wèi)華，劉晉佳，馬秀梅，姜玉鎖，*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院，山西 太谷 030801； 2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，山西 太谷 030801)

意大利蜜蜂(Apismelliferaligustica)具有產(chǎn)量高、易管理、繁殖能力強等特點，已成為我國主要飼養(yǎng)的蜜蜂品種。它不僅能夠通過蜂產(chǎn)品創(chuàng)造價值，還能通過授粉提高作物產(chǎn)量并改善作物品質(zhì)為人類帶來更大的經(jīng)濟價值，因此，意大利蜜蜂對促進農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要的作用。近年來，隨著農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化、規(guī)模化的飛速發(fā)展，各式各樣的殺蟲劑被廣泛地使用導(dǎo)致授粉昆蟲生存條件惡劣，數(shù)量正在急劇下降。從2006年冬季開始，美國出現(xiàn)蜂群崩潰失調(diào)現(xiàn)象造成蜂農(nóng)飼養(yǎng)的蜜蜂大面積消失，野生蜜蜂豐度和多樣性下降[1]。有研究指出，引發(fā)該現(xiàn)象的主要原因之一是蜜蜂長期暴露在殘留的化學(xué)毒素環(huán)境中[2]。因此，如何保護蜜蜂從而維持長期穩(wěn)定的生態(tài)環(huán)境已成為全球亟待解決的生物安全問題。

新煙堿類殺蟲劑是當(dāng)前普遍采用的殺蟲劑類別，具備出色的內(nèi)吸活性、高效率、高持續(xù)性，是有效防治刺吸式口器害蟲(木虱、蚜蟲、粉虱、葉蟬、椿象)的首選藥劑。新煙堿類殺蟲劑的作用機制主要是通過選擇性結(jié)合昆蟲神經(jīng)系統(tǒng)的乙酰膽堿受體(AchR)結(jié)合位點，阻斷昆蟲中樞神經(jīng)系統(tǒng)的正常傳導(dǎo)，導(dǎo)致昆蟲過度興奮，最終麻痹而死，此外，新煙堿殺蟲劑被植物吸收后殘留于花蜜和花粉之中除了能有效殺滅靶標昆蟲外，還會對許多傳粉媒介產(chǎn)生負面影響[3-4]。蜜蜂日常的采集行為，會大量接觸到殘留農(nóng)藥的花粉花蜜。近年來，有研究發(fā)現(xiàn)，新煙堿殺蟲劑會造成蜜蜂腦部受損[5]并且影響蜜蜂采食效率[6-7]、記憶和飛行能力[8]，新煙堿殺蟲劑會降低蜜蜂的繁殖力和生長速度[9]。此外，亞致死劑量的新煙堿類殺蟲劑已被證明會損害蜜蜂的學(xué)習(xí)能力并導(dǎo)致其免疫系統(tǒng)受損[10]。

呋蟲胺作為用于防治害蟲的新一代新煙堿類殺蟲劑，具備速效、無抗藥性、滲透性強、殺蟲譜廣等特性。近年來，關(guān)于呋蟲胺脅迫對意大利蜜蜂影響的相關(guān)研究表明，呋蟲胺在實驗室條件下對成年工蜂的毒性等級為高毒[11]。新出房的工蜂經(jīng)LC10劑量的呋蟲胺處理后，腦部差異表達的miRNA主要與蜜蜂的發(fā)育、神經(jīng)傳導(dǎo)和免疫防御有關(guān)[12]。然而目前關(guān)于亞致死劑量呋蟲胺脅迫對意大利蜜蜂采集蜂免疫解毒相關(guān)基因表達及免疫解毒酶系活性的影響鮮有報道。

本試驗旨在探究亞致死劑量呋蟲胺脅迫下，意大利蜜蜂采集蜂免疫解毒相關(guān)基因表達情況及免疫解毒酶系活力。對Abaecin、Apidaecins、Defensin-1、Hymenoptaecin、AChE-2、PPO、GST和Cyp450基因的表達量情況，飼喂后蜜蜂體內(nèi)多酚氧化酶、乙酰膽堿酯酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶和過氧化氫酶活性變化。試驗結(jié)果可為進一步明確亞致死劑量呋蟲胺對蜜蜂健康的影響提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

原藥呋蟲胺購自美國MedChemExpress公司，丙酮(天津市致遠化學(xué)試劑有限公司)，TRIZOL(Thermo公司)，PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time) 試劑盒(TaKaRa公司)，SYBR Premix Ex TaqTMⅡ (Tli RNaseH Plus) 試劑盒(TaKaRa公司)，總蛋白定量測定試劑盒、乙酰膽堿酯酶(AchE)測定試劑盒、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)測定試劑盒、多酚氧化酶(PPO)測定試劑盒、過氧化氫酶(CAT)測定試劑盒和總超氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；人工氣候箱、EU-2600A紫外分光光度計(上海昂拉儀器有限公司)，熒光定量PCR儀(BIORAD公司)。

1.2 供試蜜蜂

試驗所用的意大利蜜蜂取自山西農(nóng)業(yè)大學(xué)實驗蜂場，上午9：00在3個健康群體的蜂箱入口處抓取攜帶花粉的采集蜂，將收集到的蜜蜂轉(zhuǎn)移至塑料飼喂盒(8 cm×8 cm×6.5 cm，長×寬×高)中，每盒30只，共21盒(對照組和6個處理組，每組3個重復(fù))，隨后將飼喂盒放入恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h(溫度28 ℃，相對濕度70%，黑暗)，用于呋蟲胺急性經(jīng)口毒性試驗；另抓取攜帶花粉的采集蜂，每盒30只，共9盒(對照組和2個處理組各3盒)用于亞致死劑量呋蟲胺處理。

1.3 呋蟲胺的處理

取10 mg呋蟲胺原藥溶于100 mL丙酮中制成100 mg·L-1的呋蟲胺儲液。將適量的儲液通過50%蔗糖溶液稀釋至不同濃度梯度。將收集的蜜蜂饑餓處理2 h后，向塑料飼喂盒中加入不同濃度梯度的蜜藥混合液(每只蜜蜂15 μL)，待消耗完畢后加入50%的蔗糖溶液，讓其自由取食，每8 h更換蔗糖溶液，并移除死蜂，連續(xù)記錄48 h，求出毒力曲線。

根據(jù)急性毒性試驗的結(jié)果，采用LC20和LC50的呋蟲胺處理蜜蜂，處理48 h后，直接放入液氮速凍，轉(zhuǎn)至-80 ℃冰箱中凍存。

1.4 RNA的提取及cDNA的合成

每組取3只意蜂于液氮中研磨，按照比例(1∶1 000)加一定量TRIZOL提取總RNA，使用NanoDrop 2000檢測RNA質(zhì)量及濃度，將所有樣品RNA濃度調(diào)至500 ng·mL-1，依照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行cDNA的合成。

1.5 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)

使用熒光定量試劑盒進行qRT-PCR分析，反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性20 s；95 ℃變性20 s，60 ℃退火及延伸20 s，45個循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參基因，結(jié)果根據(jù)2-ΔΔCT法計算并分析，引物序列見表1。

表1 本實驗所用引物對序列信息

1.6 免疫解毒酶系活力的測定

1.6.1 酶液的制備

分別取對照組和2個處理組各3只蜜蜂，用冰冷的生理鹽水進行沖洗，隨后放入液氮研磨，稱量0.2 g組織放入有1.8 mL的勻漿介質(zhì)的燒杯內(nèi)，在冰浴條件下用手持勻漿儀勻漿5 min。最后在高速冷凍離心機(4 ℃，12 000×g)中離心15 min，收集上清液作為酶提取液，放入-80 ℃保存。

1.6.2 蛋白含量測定

采用BCA法[13]對酶液進行總蛋白含量的測定。

1.6.3 酶活性測定

按照南京建成生物工程研究所的試劑盒說明測定各組意蜂體內(nèi)PPO、AChE、SOD、GST和CAT的活性。

1.7 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)均使用SPSS統(tǒng)計分析軟件(版本26.0)進行分析，方法用完全隨機區(qū)組設(shè)計的單因素方差分析法(one-way ANOVA)，多重比較用LSD法，進行顯著性檢驗(P<0.05為差異顯著)，結(jié)果用均值±標準誤(SEM)表示。使用GraphPadPrism 7軟件包進行圖形制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 毒力測定

試驗設(shè)置了3、1.5、0.75、0.375、0.187 5、0.093 75 mg·L-1共6個處理組，每組3個重復(fù)，每個重復(fù)30只蜜蜂。經(jīng)計算得出呋蟲胺脅迫意大利蜂采集蜂的LC20和LC50分別為0.458和0.988 mg·L-1，結(jié)果見圖1。

y為呋蟲胺濃度的常用對數(shù)值；x為死亡概率。

2.2 呋蟲胺對意大利蜜蜂采集蜂體內(nèi)免疫解毒相關(guān)基因表達的影響

采用qRT-PCR技術(shù)檢測了意蜂取食0.458mg·L-1和0.988 mg·L-1呋蟲胺蔗糖溶液48 h后，4種免疫相關(guān)抗菌肽基因Abaecin、Apidaecins、Defensin-1和Hymenoptaecin以及4種解毒基因AChE-2、PPO、GST、Cyp450的表達量變化。

LC20組中PPO、Apidaecins、Defensin-1和Hymenoptaecin基因表達量與對照組相比有顯著上調(diào)趨勢；LC50組中AChE-2、PPO、GST、Cyp450、Apidaecins和Defensin-1表達量有顯著上調(diào)趨勢，Abaecin和Hymenoptaecin基因表達量有顯著下調(diào)趨勢。LC50組中的Abaecin和Hymenoptaecin表達量均顯著低于LC20組，而AChE-2、PPO、GST、Cyp450和Apidaecins基因表達量顯著高于LC20組(圖2)。

CK，50%蔗糖水；LC20，0.458 mg·L-1呋蟲胺蔗糖溶液；LC50，0.988 mg·L-1呋蟲胺蔗糖溶液。下同。同一基因下，柱上無相同字母的表示處理間差異顯著(P<0.05)。

2.3 呋蟲胺對意大利蜜蜂采集蜂免疫解毒酶系活性的影響

LC20組與對照組相比(圖3)，AChE、CAT和SOD活性均有顯著下調(diào)趨勢；LC50組與對照組相比，AChE、PPO、CAT和SOD活性均有顯著下調(diào)趨勢。

柱上無相同字母的表示處理間差異顯著(P<0.05)。

3 討論

蜜蜂作為傳粉媒介在陸地生態(tài)系統(tǒng)和農(nóng)業(yè)領(lǐng)域中發(fā)揮重要的功能作用，隨著殺蟲劑的廣泛使用，傳粉媒介極有可能接觸到殘留的殺蟲劑導(dǎo)致健康受損[14]。亞致死劑量的殺蟲劑會影響昆蟲的生理、行為和種群密度[15-16]，會降低昆蟲的繁殖力和存活率[17-18]。有研究發(fā)現(xiàn)，亞致死劑量噻蟲嗪脅迫蜜蜂會導(dǎo)致免疫相關(guān)基因發(fā)生變化[19]，此外，亞致死劑量的吡蟲啉破壞了蜜蜂的求偶行為導(dǎo)致交配率下降80%[20]。我們首先在實驗條件下測定了呋蟲胺脅迫蜜蜂的急性經(jīng)口毒性大小，發(fā)現(xiàn)在48 h時LC20和LC50分別0.458和0.988 mg·L-1，并探究了兩個亞致死濃度(0.458和0.988 mg·L-1)呋蟲胺脅迫對意大利蜜蜂采集蜂免疫解毒相關(guān)基因表達變化及酶活性變化的影響。

蜜蜂的先天免疫反應(yīng)由復(fù)雜的個體機制和特殊行為組成。包括細胞免疫和體液免疫，可針對環(huán)境中殘留的殺蟲劑作出即時反應(yīng)，如基因的調(diào)控和體液因子的激活。Abaecin是一種抗菌肽，屬于富含脯氨酸的肽家族，有更廣譜的抗革蘭氏陰性菌作用[21]。Defensin-1是屬于富含半胱氨酸的陽離子抗菌肽家族，在抵御入侵病原體的防御中起關(guān)鍵作用[22]。Hymenoptaecin是一種由 93 個氨基酸組成的線性肽，屬于富含甘氨酸的肽家族，能夠抑制革蘭氏陰性菌生長[23]。Apidaecins是一種含有18個氨基酸殘基的小肽，富含脯氨酸，主要對革蘭氏陰性菌起作用[24]。本試驗結(jié)果顯示，LC50組Abaecin和Hymenoptaecin表達量均顯著下調(diào)說明呋蟲胺會負面影響意蜂的免疫功能，同時Apidaecins和Defensin-1表達量顯著上調(diào)，我們認為當(dāng)受到外來物質(zhì)的挑戰(zhàn)時，這兩個基因的表達是有助于蜜蜂應(yīng)對呋蟲胺的脅迫，說明呋蟲胺脅迫會刺激蜜蜂的免疫應(yīng)答，改變免疫基因的表達量，有助于揭示呋蟲胺對意大利蜜蜂免疫系統(tǒng)的影響。

AChE-2主要分布于蜜蜂的中樞神經(jīng)內(nèi)，參與體內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞[25-26]。PPO通過轉(zhuǎn)錄翻譯多酚氧化酶，在蜜蜂生長過程中發(fā)揮作用[27]。GST是多功能抗氧化酶超家族的成員，在解毒和防止由活性氧引起的氧化損傷方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。Cyp450是存在于昆蟲體內(nèi)的多功能解毒酶，參與對殺蟲劑的解毒代謝作用[28]。結(jié)果顯示，LC50組的AChE-2、PPO、GST和Cyp450的表達量均顯著上調(diào)，說明呋蟲胺對解毒基因有誘導(dǎo)效應(yīng)，這與先前的研究結(jié)果相似，吡蟲啉對Ace2具有誘導(dǎo)效應(yīng)[29]。噻蟲嗪將誘導(dǎo)意大利蜜蜂CYP6AS3和CYP6AS5基因的上調(diào)表達[30]。

AChE、PPO、GST、CAT和SOD均為蜜蜂體內(nèi)重要的解毒代謝酶系。AChE可催化神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿水解為膽堿和醋酸鹽，是新煙堿類殺蟲劑的主要作用靶標[31]。GST是一種昆蟲體內(nèi)的主要解毒酶，能夠代謝內(nèi)源性和外源性化合物[32]。SOD和CAT是清除昆蟲體內(nèi)多余的活性氧，可抵御這些活性氧化劑引起的氧化損傷，保護細胞免受氧化應(yīng)激和損傷方面發(fā)揮重要作用。PPO是一種免疫蛋白，主要介導(dǎo)昆蟲體液免疫系統(tǒng)[33]。本研究中試驗組體內(nèi)的GST與對照沒有顯著差異，表明意大利蜜蜂體內(nèi)的GST沒有受到呋蟲胺的脅迫而激活。而亞致死劑量呋蟲胺處理組中蜜蜂體內(nèi)的其他4種酶活性與對照組相比均顯著下調(diào)，進一步說明亞致死劑量呋蟲胺脅迫下抑制意大利蜜蜂解毒酶系活性，導(dǎo)致蜜蜂對呋蟲胺的代謝能力下降，最終可能會影響蜜蜂的行為能力。

4 結(jié)論

綜上，本研究通過毒力測定、免疫解毒相關(guān)基因表達和解毒酶系活性3個層面探索亞致死劑量呋蟲胺對意大利蜜蜂采集蜂的影響。結(jié)果表明，亞致死劑量呋蟲胺脅迫影響意大利蜜蜂采集蜂免疫解毒相關(guān)基因的表達及解毒酶系活性，擾亂意大利蜜蜂正常的免疫系統(tǒng)進而對其健康和生存造成影響。研究結(jié)果可為深入研究亞致死劑量呋蟲胺對意大利蜜蜂代謝和生理的影響進一步提供依據(jù)。