楊 酸，郭小江，楊紅文，熊 力，李 晨，譚元成，王春源，張依裕，*

(1.貴州大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，高原山地動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng)550025； 2.貴州省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳，貴州 貴陽(yáng)550001)

柯樂豬屬云貴高原烏蒙烏金豬類群，是貴州省優(yōu)良的地方豬種質(zhì)資源，具有肉質(zhì)優(yōu)良、耐粗飼、適宜放養(yǎng)、生長(zhǎng)速度緩慢、繁殖性能差等特點(diǎn)，是烏蒙喀斯特山區(qū)真正的“烏金豬”，也是貴州省不可多得的寶貴豬種資源[1-2]。一直以來(lái)，當(dāng)?shù)匮芯克鶎?duì)柯樂豬進(jìn)行了種質(zhì)資源的保種、選育和利用等研究工作，但均未開展柯樂豬品系選育，研究缺乏系統(tǒng)性。目前對(duì)于該豬種的研究集中在肉質(zhì)性狀[3-4]、毛色[5]、飼養(yǎng)方式[6]和耐粗飼特性[7]等方面，在繁殖性狀方面的研究甚少。近年來(lái)，豬的繁殖性狀逐漸作為重點(diǎn)改良目標(biāo)性狀進(jìn)而快速提高豬的重要經(jīng)濟(jì)性狀，且母豬繁殖性狀的改良已是提高母豬年斷奶仔豬數(shù)的首要考慮因素，于母豬的繁殖性能而言，產(chǎn)仔數(shù)是評(píng)定其繁殖力的一個(gè)最重要的指標(biāo)。也有研究表明，增加窩產(chǎn)活仔數(shù)可顯著提高初生窩重和斷奶窩重[8]，初生窩重又是斷奶窩重的基礎(chǔ)，斷奶窩重是母豬繁殖性能各項(xiàng)指標(biāo)的總體現(xiàn)[9]。這些常見的繁殖性能指標(biāo)遺傳力偏低[10]，受不同因素的影響，人們偏向于采用全基因組關(guān)聯(lián)研究來(lái)探究豬繁殖性狀的遺傳結(jié)構(gòu)相關(guān)問(wèn)題[11]，其中，單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism， SNP)被用來(lái)評(píng)估動(dòng)物之間的親緣關(guān)系，即使用全基因組SNP面板作為標(biāo)記和統(tǒng)計(jì)方法，同時(shí)捕捉大量SNP的影響[12]。目前，大多數(shù)SNP發(fā)現(xiàn)的候選基因或QTL(數(shù)量性狀位點(diǎn))已被確定，這些數(shù)據(jù)將成為突破性育種技術(shù)的推動(dòng)力，并提高養(yǎng)豬業(yè)的生產(chǎn)效率。由此，對(duì)于產(chǎn)仔數(shù)少、繁殖力低的地方品種，從分子層面探究遺傳性狀的差異，并確定控制表型性狀的基因或與該基因緊密連鎖的遺傳標(biāo)記，對(duì)該品種直接進(jìn)行基因型選擇或標(biāo)記輔助選擇，能夠有效提高地方品種的選育效率。

催乳素(prolactin，PRL)是一種蛋白質(zhì)激素，具有多種生物學(xué)功能，包括適應(yīng)性應(yīng)激反應(yīng)、滲透調(diào)節(jié)、子宮功能、乳腺的增殖和分化、泌乳等方面[13]。PRL通過(guò)其多種形式的膜相關(guān)受體發(fā)揮作用，催乳素受體(prolactin receptor，PRLR)基因較長(zhǎng)，其總長(zhǎng)度大于100 kb，至少由10個(gè)外顯子和9個(gè)內(nèi)含子組成，且第一外顯子是可變的[14]。PRLR基因早已被證明與母豬繁殖性狀有顯著關(guān)聯(lián)[15]，在大白豬、長(zhǎng)白豬、杜洛克豬[16]、藏豬[17]、波蘭豬[18]、定遠(yuǎn)豬[19]和松遼黑豬[20]等多個(gè)中外豬種上針對(duì)其繁殖性狀已有不同程度的研究。PRLR是否能作為柯樂豬在繁殖性能方面的關(guān)鍵候選基因至今未能證明。因此，本文以柯樂豬為研究對(duì)象，利用Sanger直接測(cè)序法查找PRLR基因的SNP位點(diǎn)，并與柯樂豬的7個(gè)繁殖性狀做關(guān)聯(lián)性分析，進(jìn)一步尋找與柯樂豬繁殖性狀相關(guān)的遺傳標(biāo)記，為其繁殖性能改良和在養(yǎng)豬生產(chǎn)中的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)豬群來(lái)自貴州省赫章縣柯樂豬保種場(chǎng)，隨機(jī)選擇柯樂豬母豬204頭，采集約0.25 g耳組織，置于75%乙醇的離心管中，放入冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室，轉(zhuǎn)入-20 ℃冰箱保存待用。記錄該豬群母豬頭胎的總產(chǎn)仔數(shù)、產(chǎn)活仔數(shù)、初生窩重、初生個(gè)體重、斷奶窩仔數(shù)、斷奶窩重和斷奶個(gè)體重等數(shù)據(jù)。

1.2 基因組DNA提取

參照陳文娟[21]的苯酚-氯仿-異戊醇抽提法提取母豬耳組織DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳和核酸濃度檢測(cè)儀(NanoDrop2000)聯(lián)合檢測(cè)基因組DNA的濃度和純度，置于-20 ℃保存。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)NCBI中豬PRLR基因的DNA參考序列(登錄號(hào)：NC_010458.4)，結(jié)合在線軟件Primer Premier 3.0(http：//primer3.ut.ee/)設(shè)計(jì)豬PRLR引物序列(表1)，P1引物位置在第2外顯子內(nèi)，P2引物位置在第8外顯子內(nèi)，P3引物的位置在第3內(nèi)含子和第4外顯子之間，P4引物的位置在第6、第7外顯子，以及第6、第7部分內(nèi)含子之間。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 PRLR基因擴(kuò)增引物信息

1.4 PCR擴(kuò)增與SNP檢測(cè)

PCR反應(yīng)體系(20 μL)：1 μL DNA，10 μL 2×TaqPCR master mix，上、下游引物各1 μL (10 mmol·L-1)，7 μL ddH2O。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，最適溫度退火40 s，72 ℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min，最后4 ℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，將檢測(cè)合格的樣本送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序，測(cè)序結(jié)果采用DNAStar軟件中的MegAlign和Editseq程序進(jìn)行SNP位點(diǎn)篩選，同時(shí)進(jìn)行基因分型。

1.5 數(shù)據(jù)處理

通過(guò)RNAfold web server (http：//rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi)預(yù)測(cè)mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)，并對(duì)比參考序列和柯樂豬PRLR基因SNPs的mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)；利用Excel 2010軟件計(jì)算PRLR基因各個(gè)位點(diǎn)的基因型頻率、等位基因頻率、遺傳雜合度 (heterozygosity， He)、有效等位基因數(shù) (number of effective alleles， Ne)、多態(tài)信息含量 (polymorphism information content， PIC)和Hardy-Weinberg平衡；用SHEsis在線軟件 (http：//analysis.bio-x.cn/)對(duì)SNP位點(diǎn)連鎖不平衡(linkage disequilibrium， LD)和單倍型進(jìn)行計(jì)算分析；采用SPSS 22.0軟件的一般線性模型(general linearmodel， GLM)分析PRLR基因SNPs與繁殖性狀的關(guān)聯(lián)性，以及PRLR基因SNPs雙倍型與繁殖性狀的差異顯著性，分析時(shí)采用以下模型：性狀觀察值=群體均值+基因型效應(yīng)+隨機(jī)殘差效應(yīng)，再用Duncan’s法進(jìn)行多重比較，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果

瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果表明，4對(duì)引物的PCR擴(kuò)增條帶清晰，無(wú)冗余雜帶(圖1)，與預(yù)設(shè)片段大小相符，可用于進(jìn)一步分析。

M，DL 2000 DNA marker；1～3，P1擴(kuò)增產(chǎn)物；4～6，P2擴(kuò)增產(chǎn)物；7～9，P3擴(kuò)增產(chǎn)物；10～12，P4擴(kuò)增產(chǎn)物。

2.2 SNPs位點(diǎn)篩查

在柯樂豬PRLR基因第8外顯子檢測(cè)到1個(gè)SNP突變位點(diǎn)(g.20655220 C>T)(圖2)，在第4內(nèi)含子檢測(cè)到2個(gè)SNP突變位點(diǎn)(g.20648859 C>T和g.20648931 C>T)，3個(gè)SNP位點(diǎn)均存在3種基因型，即CC、CT、TT。其中g(shù).20655220 C>T突變導(dǎo)致絲氨酸變成脯氨酸，為錯(cuò)義突變。

2.3 柯樂豬PRLR基因SNP位點(diǎn)遺傳特性

柯樂豬PRLR基因的多態(tài)位點(diǎn)遺傳多態(tài)性分析結(jié)果(表2)表明，g.20655220 C>T、g.20648859 C>T和g.20648931 C>T優(yōu)勢(shì)基因型均為CC，其頻率分別是0.583、0.657和0.755，優(yōu)勢(shì)等位基因均為C，頻率分別是0.762、0.784和0.853；遺傳指數(shù)分析中，g.20655220 C>T和g.20648859 C>T屬于中度多態(tài)(0.25T屬于低度多態(tài)(PIC<0.25)；3個(gè)位點(diǎn)雜合度為0.2～0.4，有效等位基因數(shù)為1.3～1.6，說(shuō)明柯樂豬的遺傳多樣性較為豐富，且在遺傳過(guò)程中選擇的強(qiáng)度較大；經(jīng)χ2檢驗(yàn)，g.20655220 C>T位點(diǎn)的基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)，g.20648859 C>T、g.20648931 C>T 位點(diǎn)的基因型分布極顯著(P<0.01)偏離Hardy-Weinberg平衡。

表2 柯樂豬PRLR基因SNPs群體遺傳信息

2.4 SNPs連鎖不平衡、單倍型和雙倍型分析

利用在線軟件SHEsis對(duì)檢測(cè)到的3個(gè)SNPs位點(diǎn)進(jìn)行連鎖不平衡分析(表3)，根據(jù)D′值和相關(guān)系數(shù)(r)判斷位點(diǎn)之間是否存在連鎖，位點(diǎn)g.20655220 C>T與g.20648859 C>T之間的D′值為0.111，r為0.001；g.20655220 C>T與g.20648931 C>T之間的D′值為0.022，r為0，g.20648859 C>T與g.20648931 C>T之間D′值為1.000，r為0.627。由此可得，g.20648859 C>位點(diǎn)與g.20648931 C>T位點(diǎn)之間有較強(qiáng)的連鎖不平衡效應(yīng)(D′>0.85，r>0.33)。

表3 PRLR基因SNP位點(diǎn)的連鎖不平衡分析

對(duì)柯樂豬PRLR基因3個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行單倍型和雙倍型分析，結(jié)果(表4)顯示，3個(gè)SNP位點(diǎn)在204頭柯樂豬群體中共檢測(cè)到5種單倍型和9種雙倍型，其中，優(yōu)勢(shì)單倍型是H1(CCC)，頻率為0.610；劣勢(shì)單倍型是H5(TTT)，頻率為0.049；優(yōu)勢(shì)雙倍型是H1H1(CCCCCC)，頻率為0.382，劣勢(shì)雙倍型是H2H3(TTTTTT)，頻率為0.039。

表4 PRLR基因單倍型和雙倍型分析

2.5 柯樂豬PRLR基因mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)

RNAfold web server預(yù)測(cè)結(jié)果表明，g.20655220 C>T導(dǎo)致PRLR基因mRNA序列二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生一定改變，且mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)最小自由能有所提高，由-648.40 kcal·mol-1變?yōu)?647.90 kcal·mol-1，可能會(huì)使得mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性降低。其突變前跟突變后的mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)見圖3。

圖3 柯樂豬PRLR基因mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)

2.6 PRLR基因SNPs與柯樂豬繁殖性狀的關(guān)聯(lián)性分析

利用SPSS18.0軟件中的單因素方差分析來(lái)分析PRLR基因3個(gè)SNPs位點(diǎn)與柯樂豬繁殖性狀的關(guān)聯(lián)性，結(jié)果(表5)顯示，g.20655220 C>T位點(diǎn)CC基因型母豬的初生個(gè)體重、斷奶窩重和斷奶個(gè)體重均顯著(P<0.05)高于CT基因型，但與TT基因型差異不顯著(P>0.05)；g.20648859 C>T位點(diǎn)不同基因型在各繁殖性狀上均無(wú)顯著差異(P>0.05)；g.20648931 C>T位點(diǎn)CT基因型母豬的初生個(gè)體重、初生窩重和斷奶窩重均顯著(P<0.05)高于CC基因型和TT基因型，且該位點(diǎn)在初生個(gè)體重上，CC基因型顯著(P<0.05)高于TT基因型。

表5 柯樂豬PRLR基因SNP位點(diǎn)與繁殖性狀的關(guān)聯(lián)性

2.7 PRLR基因雙倍型與柯樂豬繁殖性狀的關(guān)聯(lián)性

將PRLR基因3個(gè)SNPs組成的雙倍型與可樂豬繁殖性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析，結(jié)果(表6)顯示，雙倍型H1H5(CTCTCT)個(gè)體的總產(chǎn)仔數(shù)顯著(P<0.05)多于H2H4(CTCTCC)雙倍型個(gè)體，且產(chǎn)活仔數(shù)均多于其余雙倍型；雙倍型H1H3(CCCTCT)個(gè)體的初生窩重和初生個(gè)體重均顯著(P<0.05)高于H1H4(CTCCCC)個(gè)體和H3H5(CTTTTT)個(gè)體，雙倍型H2H3(CCTTCT)的初生個(gè)體重、斷奶窩重和斷奶個(gè)體重均顯著(P<0.05)高于H3H5(CTTTTT)。

表6 柯樂豬PRLR基因3個(gè)SNP位點(diǎn)雙倍型與繁殖性狀的關(guān)聯(lián)性

3 討論

與大部分國(guó)內(nèi)外豬種相比，柯樂豬具有產(chǎn)仔數(shù)低、性成熟早、繁殖率低的生理特性，經(jīng)采集，本試驗(yàn)研究群體的平均總產(chǎn)仔數(shù)和產(chǎn)活仔數(shù)分別為8.63頭和7.92頭，而近些年雜交豬種的頻繁應(yīng)用，地方豬種的生存空間進(jìn)一步縮小，大概是由于地方豬種繁殖力較低下，且生長(zhǎng)緩慢、育種周期更長(zhǎng)[22]，因此，提高地方豬種繁殖力是當(dāng)前研究的一個(gè)重點(diǎn)及熱點(diǎn)。PRLR基因作為母豬繁殖性狀的重要候選基因之一，在大腦中的廣泛表達(dá)突出了催乳素在調(diào)節(jié)神經(jīng)元功能中的多效性作用，能夠促進(jìn)乳腺發(fā)育、維持泌乳功能，并對(duì)家畜性腺發(fā)育和母體行為產(chǎn)生影響[23]。本研究在柯樂豬PRLR基因第8外顯子檢測(cè)到1個(gè)SNP突變位點(diǎn)(g.20655220 C>T)，在第4內(nèi)含子檢測(cè)到2個(gè)SNP突變位點(diǎn)(g.20648859 C>T和g.20648931 C>T)，3個(gè)位點(diǎn)呈現(xiàn)不同的多態(tài)性：g.20655220 C>T和g.20648859 C>T屬于中度多態(tài)(0.25T屬于低度多態(tài)(PIC<0.25)。PIC值大于0.5的標(biāo)記被認(rèn)為是非常有信息性的，介于0.25和0.50之間的值有些信息性，低于0.25的值不是非常有信息性[24]。χ2檢驗(yàn)表明，g.20655220 C>T位點(diǎn)的基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)，說(shuō)明未受到突變、選擇或遺傳漂變等影響，或是已經(jīng)受到影響但由于長(zhǎng)期的人工選擇并進(jìn)行大規(guī)模擴(kuò)群后又重新處于新的平衡狀態(tài)。g.20648859 C>T、g.20648931 C>T位點(diǎn)的基因型分布極顯著偏離Hardy-Weinberg平衡，表明這2個(gè)位點(diǎn)可能受到純化選擇、遺傳漂變或近親繁殖等影響[25]。連鎖不平衡分析顯示，g.20648859 C>位點(diǎn)與g.20648931 C>T位點(diǎn)之間有較強(qiáng)的連鎖不平衡效應(yīng)，由此可知這2個(gè)SNP位點(diǎn)趨向于整體遺傳。此外，g.20655220 C>T位點(diǎn)導(dǎo)致PRLR基因mRNA序列二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生一定改變，且mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)最小自由能有所提高，使得mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性降低，由此可能對(duì)基因表達(dá)的效率有所影響。

PRLR基因定位于豬的16位染色體，與母豬的繁殖性狀密切相關(guān)，已有大量學(xué)者對(duì)PRLR基因多態(tài)性和母豬產(chǎn)仔性能展開研究。Sun等[26]研究表明，PRLR基因在5個(gè)山東地方豬種和3個(gè)國(guó)外豬種的受試群體中存在多態(tài)性位點(diǎn)，且產(chǎn)仔數(shù)性狀的效應(yīng)明顯，遺傳多態(tài)性豐富，并證實(shí)了該基因比RBP4基因的遺傳效應(yīng)更大；Birgitte等[27]早在2002年就已證實(shí)PRLR基因是大白×梅山F2雜交母豬初情年齡、產(chǎn)活仔數(shù)和產(chǎn)仔數(shù)的主效基因或標(biāo)記。本研究在柯樂豬PRLR基因上新發(fā)現(xiàn)的3個(gè)多態(tài)位點(diǎn)中，g.20655220 C>T位點(diǎn)對(duì)柯樂豬母豬初生個(gè)體重、斷奶窩重和斷奶個(gè)體重的影響達(dá)顯著性水平，該位點(diǎn)的CC基因型母豬的初生個(gè)體重、斷奶窩重和斷奶個(gè)體重均顯著高于CT基因型。與此類似，Vashi等[28]研究顯示，PRLRCC基因型與印度本土豬的斷奶窩重呈正相關(guān)；范一萍等[29]在大白豬群體上的驗(yàn)證顯示，其純合基因型BB基因型個(gè)體的斷奶窩重顯著高于雜合基因型AB基因型，且其內(nèi)含子上的g.20648931 C>T位點(diǎn)對(duì)其初生個(gè)體重、初生窩重和斷奶窩重的影響也達(dá)到顯著水平，其中，g.20648931 C>T位點(diǎn)CT基因型母豬的初生個(gè)體重、初生窩重和斷奶窩重均顯著高于CC基因型和TT基因型，且該位點(diǎn)在初生個(gè)體重上，CC基因型又顯著高于TT基因型。出現(xiàn)此類情況的原因可能與樣本量較少，且均為頭胎繁殖數(shù)據(jù)相關(guān)，尤其在地方豬種群體中，普遍呈現(xiàn)性成熟較早的情況，而有些后備母豬的身體可能還沒有完全發(fā)育成熟，從而造成頭胎繁殖數(shù)據(jù)的一定局限性。因此，后期有必要進(jìn)一步展開研究，對(duì)經(jīng)產(chǎn)母豬繁殖性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。

在產(chǎn)仔數(shù)方面，本研究中PRLR基因3個(gè)SNPs位點(diǎn)與柯樂豬產(chǎn)仔數(shù)和產(chǎn)活仔數(shù)的關(guān)聯(lián)性均未達(dá)到顯著水平，這與胡慧艷等[30]的研究結(jié)論相同，其表示PRLR基因?qū)Ξa(chǎn)仔數(shù)不存在顯著影響。將PRLR基因3個(gè)SNPs組成的雙倍型與可樂豬繁殖性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析發(fā)現(xiàn)，H1H5(CTCTCT)雙倍型個(gè)體在總產(chǎn)仔數(shù)上顯著高于H2H4(CTCTCC)雙倍型個(gè)體，且其產(chǎn)活仔數(shù)均高于其余雙倍型，由此初步認(rèn)為雙倍型H1H5(CTCTCT)為有利雙倍型，在產(chǎn)仔數(shù)的培育過(guò)程中可作為分子標(biāo)記輔助選擇的參考。另外，雙倍型H1H3(CCCTCT)個(gè)體的初生窩重和初生個(gè)體重均顯著高于H1H4(CTCCCC)個(gè)體和H3H5(CTTTTT)個(gè)體；在斷奶窩重和斷奶個(gè)體重方面，雙倍型H2H3(CCTTCT)為最優(yōu)組合，均高于其他雙倍型，且在初生個(gè)體重、斷奶窩重和斷奶個(gè)體重上均顯著高于H3H5(CTTTTT)。綜上所述，g.20655220 C>T位點(diǎn)的CC基因型是改善柯樂豬母豬繁殖性狀，特別是初生個(gè)體重、斷奶窩重和斷奶個(gè)體重的有利基因型。雙倍型H1H5(CTCTCT)是產(chǎn)仔數(shù)和產(chǎn)活仔數(shù)的有利雙倍型，H2H3(CCTTCT)在斷奶窩重和斷奶個(gè)體重上為較優(yōu)雙倍型。