肖長(zhǎng)斌，張法榮

（1.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250000； 2.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250000）

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy， DN）是糖尿病患者最常見(jiàn)和最嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥之一，是目前世界范圍內(nèi)引起終末期腎臟病的主要原因，已成為全球范圍內(nèi)最為關(guān)注的公共健康衛(wèi)生問(wèn)題［1］。探尋DN有效的新診治方法具有重大的研究意義和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。中醫(yī)藥在防治DN方面具有獨(dú)到的優(yōu)勢(shì)，其副作用小，可通過(guò)多層次、多靶點(diǎn)、多途徑和多環(huán)節(jié)的作用可以達(dá)到未病先防、既病防變的目的［2］。近年來(lái)，基于外泌體研究DN潛在的病理介質(zhì)、標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)已成為防治DN的熱點(diǎn)領(lǐng)域［3］。外泌體的出現(xiàn)為中醫(yī)藥防治DN提供了新興的切入點(diǎn)，也將會(huì)成為DN中醫(yī)藥研究的重要方向［4］。

外泌體是大小范圍在30～100 nm一種納米級(jí)細(xì)胞外囊泡，它在多泡體與質(zhì)膜融合后通過(guò)胞吐作用從細(xì)胞分泌到細(xì)胞外空間［5］。近年來(lái)，科學(xué)家逐漸認(rèn)識(shí)到了外泌體在細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞間通訊中發(fā)揮的重要作用。在血液、精液、腦脊液、滑液、母乳、唾液、膽汁、腹水、羊水、胸膜液和尿液等多種生物體液中都可以找到外泌體的存在。腎臟不同部分分泌的外泌體，其包含內(nèi)容物也不相同，在腎臟的生理、病理過(guò)程中都扮演了重要角色。

1 DN中西醫(yī)診斷標(biāo)志物中外泌體的研究

DN起病癥狀隱匿，持續(xù)高血糖水平下腎臟損害病變是不可逆的，與其他原因造成的腎損害相比較，進(jìn)展快，極易發(fā)展為終末期腎?。?］。西醫(yī)對(duì)DN一般采取控制血糖、血壓、飲食及其他危險(xiǎn)因素的綜合管理治療措施。目前以微量白蛋白尿作為DN的生物標(biāo)志物，但其在DN早期缺乏敏感性和特異性［7］?！饵S帝內(nèi)經(jīng)》言：“圣人不治已病，治未病，不治已亂，治未亂?！币虼嗽缙陬A(yù)防及診斷DN非常重要，發(fā)現(xiàn)和篩選精準(zhǔn)特異性高、無(wú)創(chuàng)、價(jià)廉便捷的可以早期診斷DN的標(biāo)志物也更為關(guān)鍵。

不論是在生理或病理?xiàng)l件下，幾乎所有類型的腎臟細(xì)胞都能釋放對(duì)應(yīng)的外泌體［8］。外泌體中包含重要的蛋白質(zhì)和遺傳物質(zhì)，能夠體現(xiàn)其來(lái)源細(xì)胞及系統(tǒng)的病理、生理狀態(tài)，與腎臟疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，借助外泌體通過(guò)無(wú)創(chuàng)方法可以提高快速準(zhǔn)確診斷腎臟疾病的能力，因此近年來(lái)外泌體已經(jīng)受到腎臟領(lǐng)域?qū)＜覍W(xué)者的重視。ROSSI等［9］對(duì)DN患者尿液外泌體中水通道蛋白5（AQP5）和水通道蛋白2（AQP2）的排泄情況進(jìn)行分析，顯示AQP5和AQP2與DN的組織學(xué)分級(jí)呈正相關(guān)，提示外泌體可作為一種新手段進(jìn)行無(wú)創(chuàng)診查腎臟損害程度。miRNA是外泌體研究中的重要內(nèi)容物，外泌體釋放miRNA對(duì)受體細(xì)胞發(fā)揮功能活性作用，其可以通過(guò)影響轉(zhuǎn)錄后基因的表達(dá)調(diào)控靶細(xì)胞，外泌體的表面結(jié)構(gòu)能夠保護(hù)核酸和其他生物大分子在體內(nèi)不被降解，因此尿液外泌體中的miRNA作為DN早期診斷標(biāo)志物具有足夠穩(wěn)定性［10］。利用miRNA的差異性表達(dá)可進(jìn)行DN預(yù)測(cè)診斷的研究［11］。BARUTTA等［12］通過(guò)對(duì)伴和不伴早期DN的1型糖尿病患者及早期DN動(dòng)物模型尿液外泌體中miRNA的表達(dá)進(jìn)行評(píng)估，發(fā)現(xiàn)在DN早期尿液外泌體miRNA表達(dá)異常，其中miR－145顯著富集，研究團(tuán)隊(duì)認(rèn)為miR－145可作為DN候選生物標(biāo)志物。有研究在對(duì)2型DN病人的尿液外泌體進(jìn)行PCR陣列分析顯示，miR－15b、miR－34a與miR－636表達(dá)高度上調(diào)，這3種miRNA與血清肌酐和尿蛋白肌酐比之間存在正相關(guān)聯(lián)系，可作為2型DN診斷和病理研究的重要線索［13］。外泌體源miRNAs可以通過(guò)介導(dǎo)細(xì)胞－細(xì)胞間的信息交流參與DN的病理改變。TSAI等［14］發(fā)現(xiàn)高糖狀態(tài)引起miR－15b－5p表達(dá)上調(diào)，其與DN中的靶標(biāo)B細(xì)胞淋巴瘤2（Bcl－2）結(jié)合后誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞（MMCs）凋亡；此外，TSAI還發(fā)現(xiàn)尿外泌體miR－15b－5p水平升高與腎功能下降相關(guān)；因此miR－15b－5p具有預(yù)測(cè)DN腎損傷的潛力。由此可見(jiàn)外泌體可能是導(dǎo)致早期DN程進(jìn)展的重要因素。雖然目前腎穿刺活檢術(shù)是明確DN腎損傷情況的金標(biāo)準(zhǔn)，但有創(chuàng)性及術(shù)后可能帶來(lái)并發(fā)癥等問(wèn)題使其在臨床廣泛應(yīng)用受到制約。尿液中的外泌體方便易取，因而外泌體可以作為無(wú)創(chuàng)生物標(biāo)志物的優(yōu)先候選物。

2 DN的中醫(yī)證候中外泌體的研究

20世紀(jì)80年代沈自尹教授提出了微觀辨證的概念，即是臨床過(guò)程中在中醫(yī)宏觀辨證思想指導(dǎo)下，發(fā)揮現(xiàn)代科學(xué)在機(jī)體微觀認(rèn)識(shí)層面的優(yōu)勢(shì)，對(duì)證的物質(zhì)基礎(chǔ)進(jìn)行更完整、更準(zhǔn)確、更本質(zhì)地闡明［15］。通過(guò)患者的尿液、血液、影像及腎穿刺活檢等檢查病理結(jié)果可以反映腎臟的病變情況，從而實(shí)現(xiàn)宏觀與微觀辨證相互補(bǔ)充。外泌體是由臟腑在正常生理或異常病理狀態(tài)下產(chǎn)生，分布在人體多種體液中，因此可歸屬于中醫(yī)學(xué)中的精血、津液一類。消渴病失治誤治，日久易耗傷陰氣，陰損及陽(yáng)，最終腎臟虛損，DN狀態(tài)下外泌體被激活，借經(jīng)絡(luò)循行或氣血運(yùn)行，導(dǎo)致腎臟纖維化等相關(guān)病理改變，這符合外泌體調(diào)控病理改變的生物學(xué)特性。呂春燕［16］在“清濁相干”這一病機(jī)理論指導(dǎo)下經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在腎間質(zhì)纖維化患者中尿外泌體源miR－29c、miR－21和E－cadherin、Vimentin的表達(dá)情況均出現(xiàn)了一定程度的變化，與精微糟粕物質(zhì)升降失常導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化的“清濁紊亂”病機(jī)理論相一致。腎間質(zhì)纖維化患者上述尿外泌體中miR－29c呈恒定下降表達(dá)；且其表達(dá)變化與纖維化程度一致；并與腎功能損傷指標(biāo)等相關(guān)，有潛力作為腎臟纖維化程度的穩(wěn)定監(jiān)測(cè)指標(biāo)。把尿液外泌體中的蛋白、基因、抗原、抗體等信息作為診斷腎臟疾病的一種生物標(biāo)志物，是中醫(yī)腎臟病微觀辨證的一大飛躍。外泌體等非侵入性的腎臟標(biāo)志物有助于對(duì)DN患者的腎臟損傷情況進(jìn)行連續(xù)監(jiān)測(cè)。DN中的外泌體研究雖為微觀分子學(xué)，其在不同狀態(tài)下的不同表達(dá)及可反應(yīng)來(lái)源母細(xì)胞狀態(tài)等特點(diǎn)，與中醫(yī)辨證的整體觀、恒動(dòng)觀不謀而合。

中醫(yī)各家在DN證候認(rèn)識(shí)方面觀點(diǎn)雖不盡相同，但多數(shù)中醫(yī)學(xué)家以本虛標(biāo)實(shí)、虛實(shí)夾雜為DN的主要病機(jī)特點(diǎn)，目前臨床有以虛實(shí)劃分的分型辨證及以疾病階段劃分的分期辨證等辨證方法，DN辨證分型呈現(xiàn)出多樣化的特點(diǎn)［17］。目前公認(rèn)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子－β1（TGF－β1）參與DN關(guān)鍵信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因調(diào)控機(jī)制［18］。已有多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)資料證實(shí)外泌體調(diào)控TGF－β1信號(hào)通路參與到腎小球、腎小管和腎間質(zhì)病變中［19］，導(dǎo)致腎臟纖維化，且該病變過(guò)程影響DN預(yù)后效果［20］。呂仁和教授認(rèn)為“腎絡(luò)徵瘕”是造成DN腎臟損害的重要原因，腎絡(luò)癥瘕的形成與腎臟纖維化的發(fā)生相呼應(yīng)［21］。DN病理狀態(tài)下，腎臟功能和機(jī)體氣血津液運(yùn)行失常，痰、熱、濕、瘀等病理產(chǎn)物郁結(jié)為濁毒，濁毒羈留，則痰熱濕瘀更加膠結(jié)難化，日久形成腎絡(luò)癥瘕，導(dǎo)致腎纖維化，使得腎臟功能受損［22］。痰熱濕瘀濁毒等病理產(chǎn)物蓄積引起了腎臟功能結(jié)構(gòu)的損害，這些病理產(chǎn)物的生成與外泌體生理病理狀態(tài)下的功能變化具有相通之處。因此，痰熱濕瘀濁毒等病理產(chǎn)物是外泌體攜帶的致病信息媒介，可以將痰、熱、濕、瘀等DN標(biāo)實(shí)證中的外泌體作為研究對(duì)象，從整體上分析外泌體在不同證型中的表達(dá)情況，可為DN標(biāo)實(shí)證的標(biāo)準(zhǔn)化診斷提供更精準(zhǔn)的參考，從而探索DN中證候規(guī)律與發(fā)病機(jī)制。外泌體作為由臟腑分泌的物質(zhì)基礎(chǔ)，可以作為靶向信使溝通相關(guān)臟腑間的信息。在研究中醫(yī)證候機(jī)制的過(guò)程中引入外泌體，以微觀辨證的思維作為橋梁，分析外泌體在DN證候發(fā)生過(guò)程中的變化，這將開(kāi)啟系統(tǒng)性研究DN中醫(yī)證候微觀辨證的現(xiàn)代生物機(jī)制的新篇章［23］。

3 中醫(yī)藥治療DN中外泌體的研究

中醫(yī)藥在治療DN方面具有獨(dú)特的作用和優(yōu)勢(shì)。腎臟為先天之本，內(nèi)藏先天之精，與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)相關(guān)理論進(jìn)行分析聯(lián)系得出臟腑之精與細(xì)胞外基質(zhì)、組織液和細(xì)胞間信號(hào)分子等構(gòu)成的細(xì)胞微環(huán)境有關(guān)［24］。安笑葉等［25］通過(guò)CiteSpace對(duì)外泌體應(yīng)用于中醫(yī)藥研究相關(guān)文獻(xiàn)分析發(fā)現(xiàn)，自2018年起DN已成為外泌體應(yīng)用于中醫(yī)藥領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。EBRAHIM［26］在誘導(dǎo)的糖尿病大鼠模型中發(fā)現(xiàn)，來(lái)源于間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）的外泌體可以提高小鼠自噬能力來(lái)抑制mTOR通路，從而起到抗纖維化、保護(hù)腎功能的作用。這為使用外泌體作為DN新的生物治療方法提供了支持。研究證實(shí)，中藥單體及復(fù)方可以通過(guò)調(diào)控外泌體調(diào)節(jié)多種信號(hào)通路來(lái)改善DN癥狀、延緩DN的進(jìn)展、保護(hù)腎功能。

3.1 中藥單體調(diào)控外泌體研究

已有研究表明黃連可通過(guò)調(diào)節(jié)相關(guān)細(xì)胞因子和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑延緩DN的進(jìn)展，而小檗堿是黃連的主要活性成分。WANG等［27］首次證實(shí)了高糖誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞可通過(guò)釋放外泌體轉(zhuǎn)化TGF－β1來(lái)?yè)p害足細(xì)胞的功能，且100 μmol/L小檗堿可下調(diào)外泌體TGF－β1的表達(dá)和足細(xì)胞的凋亡，增加足細(xì)胞的黏附能力和足細(xì)胞特異性標(biāo)志蛋白的表達(dá)，抑制TGF－β1從腎小球系膜細(xì)胞向足細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，從而起到保護(hù)足細(xì)胞的作用。穿山龍總皂苷處理后的腎小球系膜細(xì)胞外泌體中TGF－β1表達(dá)明顯降低，且經(jīng)干預(yù)的外泌體刺激下的系膜細(xì)胞增殖及細(xì)胞外基質(zhì)沉積減少，因此可以證明外泌體TGF－β1是穿山龍總皂苷發(fā)揮治療作用的靶點(diǎn)［28］。最新的研究也發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷可通過(guò)介導(dǎo)外泌體miR－192－5P及GLP－1R途徑恢復(fù)DN腎小管上皮細(xì)胞自噬功能，從而減輕腎小管間質(zhì)纖維化程度，為DN腎臟纖維化治療提供一種新選擇［29］。

3.2 中藥復(fù)方調(diào)控外泌體研究

通心絡(luò)膠囊是由人參、水蛭、全蝎、蟬蛻、蜈蚣等12種中草藥組成的中藥復(fù)方，近年來(lái)被應(yīng)用于DN的治療，對(duì)糖尿病大鼠模型灌胃200 μg/mL的通心絡(luò)膠囊，提取模型大鼠的腎小球內(nèi)皮細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)經(jīng)通心絡(luò)膠囊處理的腎小球內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體不能在體內(nèi)外觸發(fā)系膜細(xì)胞的激活、增殖和細(xì)胞外基質(zhì)的過(guò)量產(chǎn)生，這就提示通心絡(luò)膠囊可以阻止TGF－β1通過(guò)外泌體向腎小球系膜細(xì)胞轉(zhuǎn)移，從而起到治療DN的作用［30］。崔方強(qiáng)等［31］研究發(fā)現(xiàn)，保腎通絡(luò)方（黃芪、熟地黃、菟絲子、劉寄奴、鬼箭羽、水蛭和丹參）可使細(xì)胞外基質(zhì)中的基膜膠原、大分子糖蛋白及外泌體miR－192 mRNA的表達(dá)水平下降，同時(shí)抑制DN腎小球系膜細(xì)胞的增殖活性，細(xì)胞外基質(zhì)增生減少?？梢?jiàn)，保腎通絡(luò)可通過(guò)下調(diào)外泌體miR－192的表達(dá)，進(jìn)而降低腎小球系膜細(xì)胞活化及減少足細(xì)胞損傷，從而延緩DN病情進(jìn)展。

綜上所述，中醫(yī)藥可通過(guò)作用于外泌體靶向影響效應(yīng)細(xì)胞，發(fā)揮對(duì)DN的治療作用，可為中醫(yī)藥提供治療DN新的思路。但目前關(guān)于外泌體在中醫(yī)藥治療DN中具體作用機(jī)制的研究尚不夠完善，還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)明確挖掘。

4 中藥載體治療DN中外泌體的研究

雖然中醫(yī)學(xué)擁有完整的理論體系支撐，其良好的臨床療效也得到了驗(yàn)證，但目前中藥以湯、丸、散、顆粒等為主要制劑為主，存在著有效成分難以完全溶解、生物利用度相對(duì)較低、起效時(shí)間較長(zhǎng)等不足［32］。探尋更加有效、精準(zhǔn)、科學(xué)、現(xiàn)代化的給藥方式是提高中醫(yī)藥治療DN臨床療效的重要途徑。外泌體攜帶的多種內(nèi)容物質(zhì)可以對(duì)某些病變起到治療作用；與其他載體相比，由于外泌體來(lái)源于細(xì)胞自身，免疫系統(tǒng)將其識(shí)別為“自我”，因此外泌體的免疫原性低；外泌體的表面結(jié)構(gòu)使得網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)不易將其捕獲，可以提高其在血液中的穩(wěn)定性；外泌體負(fù)載藥物由于外泌體結(jié)構(gòu)的有效保護(hù)而表現(xiàn)出高有效率；外泌體在攜帶藥物時(shí)發(fā)揮其靶向性的生物特性，易與受體細(xì)胞融合，達(dá)到被動(dòng)靶向作用；外泌體獨(dú)特的雙重親水性和疏水性膜結(jié)構(gòu)使其易于通過(guò)生物膜屏障，可以設(shè)計(jì)特定的給藥方式和修飾發(fā)揮載體的作用；外泌體是與受體細(xì)胞結(jié)構(gòu)相似的來(lái)源于生物細(xì)胞的納米顆粒，這種特性使其易于被多種細(xì)胞吸收［33］。綜上所述，外泌體作為藥物傳遞的良好載體因具有免疫原性低、穩(wěn)定性好、半衰期長(zhǎng)、傳遞率高和能穿越血腦屏障等優(yōu)點(diǎn)從而具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)［34］。目前對(duì)姜黃素、紫杉醇、花青素、雷公藤紅素等中藥有效成分以牛奶來(lái)源外泌體為藥物載體的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，牛奶來(lái)源外泌體可以提高中藥濃度、穩(wěn)定性、療效及減輕不良反應(yīng)［35］。在數(shù)字化今天， 研究利用外泌體等更加高效精準(zhǔn)安全的藥物載體，可以更好實(shí)現(xiàn)中藥對(duì)于DN的治療作用。目前外泌體作為新興領(lǐng)域，不同中藥、不同疾病如何選擇合適的外泌體、如何將藥物更加高效地加載于外泌體上等問(wèn)題，是今后開(kāi)發(fā)外泌體需要著力解決的問(wèn)題。

5 小結(jié)

外泌體在介導(dǎo)健康和疾病的細(xì)胞間通訊中起著至關(guān)重要的作用，越來(lái)越多的研究表明，外泌體參與了與DN相關(guān)的病理、生理過(guò)程，尿液外泌體中攜帶的內(nèi)容物，如miRNA和蛋白質(zhì)，可以用作糖尿病的早期標(biāo)志物，并有可能預(yù)測(cè)疾病進(jìn)展［36］。深入探討在DN證候中各類外泌體的表達(dá)情況，能夠?yàn)樽C候診斷及標(biāo)準(zhǔn)化提供新的發(fā)展思路，也可為各證候機(jī)制研究提供新的研究方法。中醫(yī)藥對(duì)于DN作用于多靶點(diǎn)、多途徑，外泌體可通過(guò)影響外泌體分泌量或內(nèi)含成分延緩DN的進(jìn)展、保護(hù)腎功能，外泌體作為藥物載體的應(yīng)用可使治療更加高效精準(zhǔn)。目前外泌體在中醫(yī)藥研究領(lǐng)域尚未完全成熟，外泌體對(duì)于DN的調(diào)節(jié)機(jī)制比較復(fù)雜，將其投入到臨床實(shí)際應(yīng)用還需不斷探索其具體機(jī)制內(nèi)涵。確定哪些外泌體可作為早期DN診斷標(biāo)志物、外泌體何種成分發(fā)揮了中藥的治療作用、如何更好地利用外泌體運(yùn)載中藥成分等問(wèn)題，也是下一步科研人員攻堅(jiān)克難的方向。