劉紅燕，郭亞男，閆背背,，王建東，岳 康,，何生虎*

（1.寧夏大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川 750021；2.寧夏農(nóng)林科學(xué)院動(dòng)物科學(xué)研究所，寧夏 銀川 750002）

牛支原體（Mycoplasma bovis,M.bovis）是無(wú)細(xì)胞壁的原核生物，侵入機(jī)體后可導(dǎo)致多種臨床癥狀，如肺炎、關(guān)節(jié)炎、角膜結(jié)膜炎、乳房炎甚至孕畜流產(chǎn)等[1-2]。牛支原體呈世界性分布，造成的經(jīng)濟(jì)損失難以估量[3]。1961年，牛支原體首次從有乳房炎的牛乳中分離出來(lái)，10多年后，研究確定了牛支原體可引發(fā)各類(lèi)呼吸系統(tǒng)疾病[4]。2008年，我國(guó)首次從患病犢牛肺臟中分離到該病原體，隨后我國(guó)10多個(gè)省市陸續(xù)發(fā)生了牛支原體病，嚴(yán)重影響了我國(guó)養(yǎng)牛業(yè)的發(fā)展[5]。在集約化牛場(chǎng)中，伴隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大，牛支原體的感染率和發(fā)病率也隨之增加，給養(yǎng)殖企業(yè)造成了難以挽回的損失。因此，應(yīng)用高靈敏度、高精確度的牛支原體快速檢測(cè)技術(shù)尤為重要。目前，對(duì)牛支原體檢測(cè)技術(shù)的研究主要有4個(gè)方面：病原學(xué)診斷方法、免疫學(xué)診斷方法、血清學(xué)診斷方法和分子生物學(xué)診斷方法。

1 病原學(xué)診斷方法

牛支原體感染后無(wú)示病癥狀，通常與巴氏桿菌、鏈球菌、肺炎克雷伯等其他病原菌混合感染，采用實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)有助于確診。檢測(cè)和鑒定牛支原體可采用微生物培養(yǎng)方法，因?yàn)橹гw結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，膽固醇、長(zhǎng)鏈脂肪酸和生長(zhǎng)因子等不能由自身提供，所以培養(yǎng)基中要加入血清、酵母浸出液、蛋白胨和葡萄糖等其他試劑；同時(shí)，培養(yǎng)基pH值須調(diào)至7.3～7.8，pH值低于7.0會(huì)抑制其生長(zhǎng)。由于牛支原體基因組較小，生物合成途徑有限，對(duì)營(yíng)養(yǎng)和環(huán)境的需求比一般細(xì)菌高，因此要在培養(yǎng)基中加入20%馬血清，置于含有5% CO2、37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)4 d左右，在光學(xué)顯微鏡下觀察固體培養(yǎng)基，菌落會(huì)呈現(xiàn)出特有的“油煎蛋”形態(tài)。雖然分離鑒定法是診斷牛支原體病的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但由于牛支原體人工培養(yǎng)難度大、生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，因此該方法存在一定的局限性[6]。

2 免疫學(xué)診斷方法

2.1 免疫組化

研究者通過(guò)免疫組化檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)機(jī)體感染牛支原體后會(huì)引起嚴(yán)重的肺部病變，肺間質(zhì)擴(kuò)大，外觀呈現(xiàn)大理石樣病變，并且在支氣管上皮細(xì)胞表面和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)均檢測(cè)到牛支原體抗原。Rodríguez等[7]通過(guò)免疫組織化學(xué)方法評(píng)估了自然發(fā)生和實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)感染牛支原體肺炎后犢牛機(jī)體內(nèi)炎性病變中環(huán)氧化酶的表達(dá)，結(jié)果顯示牛支原體抗原位于呼吸道管腔和周?chē)鷫乃澜M織的上皮細(xì)胞和炎癥細(xì)胞中，并且在支氣管、細(xì)支氣管、肺泡上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中均檢測(cè)到環(huán)氧化酶，結(jié)果顯示環(huán)氧化酶蛋白在牛支原體感染期間過(guò)度表達(dá)，它始終與肺炎區(qū)域牛支原體抗原的存在有關(guān)。Nunoya等[8]利用免疫組織化學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)患牛支原體肺炎的犢牛肺組織有深紅色實(shí)變區(qū)域，同時(shí)伴隨有亞急性化膿性細(xì)支氣管炎以及周?chē)馨徒M織增生。該方法在肺炎病灶的細(xì)支氣管上皮細(xì)胞表面、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)支氣管吞噬細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中均發(fā)現(xiàn)牛支原體抗原存在。

2.2 免疫印跡

牛支原體膜蛋白種類(lèi)豐富，包括VSP家族成員、pMB67、P26、P30和P48等抗原蛋白。目前學(xué)者普遍認(rèn)為，牛支原體導(dǎo)致的呼吸道感染具有大量免疫病理學(xué)成分，其特征是感染組織中淋巴細(xì)胞大量積聚、炎細(xì)胞因子和肺部炎癥出現(xiàn)。Chen等[9]利用免疫印跡法對(duì)牛支原體進(jìn)行定量和定性檢測(cè)，結(jié)果顯示P27是牛支原體的膜蛋白，這有助于了解牛支原體的分子致病機(jī)制。Kumar[10]通過(guò)免疫印跡法區(qū)分牛支原體（M.bovis）和無(wú)乳支原體（Mycoplasma agalactiae）的免疫原性蛋白，發(fā)現(xiàn)這2種支原體的蛋白質(zhì)譜幾乎相似，存在許多發(fā)生交叉反應(yīng)的多肽，但可以用特異性免疫原性蛋白進(jìn)行區(qū)分。

3 血清學(xué)診斷方法

3.1 ELISA

血清學(xué)診斷是檢測(cè)牛支原體的有效方法，其特異性和靈敏性都較高。Fu等[11]基于重組P48蛋白和單克隆抗體（10E）建立了直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法，并且與其他病原體無(wú)交叉反應(yīng)。通過(guò)對(duì)比試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)這種直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法的陽(yáng)性檢出率高于商品化間接ELISA試劑盒的檢出率。胡國(guó)明[12]將P48蛋白純化后包被在96孔板上檢測(cè)單克隆抗體效價(jià)，其效價(jià)可達(dá)640 000左右，并且與其他病原體無(wú)交叉反應(yīng)，具備特異性高、穩(wěn)定性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。Han等[13]將蛋白作為包被抗原，檢測(cè)牛支原體的特異性抗體，從而建立了檢測(cè)該病原體的ELISA方法。在此方法基礎(chǔ)上，研發(fā)出了硫氰酸鈉（NaSCN）競(jìng)爭(zhēng)ELISA法，用于檢測(cè)IgG親和力，成功建立起了能區(qū)分免疫牛和感染牛的檢測(cè)方法，并且能可靠評(píng)估牛支原體感染程度和疫苗效價(jià)。ELISA檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)單、快速，在調(diào)查大規(guī)模流行病學(xué)時(shí)具有顯著優(yōu)勢(shì)。

3.2 膠體金

膠體金免疫層析法是20世紀(jì)80年代誕生的一項(xiàng)快速檢測(cè)技術(shù)，它是以膠體金作為示蹤物，用于抗原抗體結(jié)合反應(yīng)的免疫標(biāo)記技術(shù)。簡(jiǎn)瑩娜[14]基于牛支原體分離菌株的P48重組蛋白，構(gòu)建了膠體金免疫層析試紙條檢測(cè)方法，該試紙條檢測(cè)牛支原體高免血清效價(jià)可至1∶106。與間接血凝試驗(yàn)法相比較（IHA），膠體金免疫層析法陽(yáng)性檢出率和陰性檢出率都在93%以上，具有檢測(cè)速度快、靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，適用于牛支原體的快速檢測(cè)。周華倩等[15]利用牛支原體重組膜蛋白P48和P80雙抗原建立了免疫膠體金抗體檢測(cè)試紙條方法，該方法可以檢出人工感染和接種疫苗2周后牛血清中的支原體抗體。通過(guò)最低檢測(cè)下線、交叉反應(yīng)性和人工感染血清檢測(cè)等試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該試紙條的特異性和敏感性較好，適用于臨床血清中牛支原體的快速檢測(cè)。膠體金免疫層析法不需要實(shí)驗(yàn)室儀器和專(zhuān)業(yè)人員，操作簡(jiǎn)單，數(shù)分鐘內(nèi)便可得到可視化結(jié)果，更適合于生產(chǎn)一線的現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用。

4 分子生物學(xué)診斷方法

4.1 普通PCR及熒光定量PCR方法

分子生物學(xué)診斷方法是牛支原體實(shí)驗(yàn)室診斷中的最常用方法。PCR技術(shù)比其他檢測(cè)方法具有更高檢測(cè)效率，它是鑒別牛支原體與其他支原體的一項(xiàng)重要檢測(cè)技術(shù)[16]。當(dāng)前基于牛支原體P48、P80和Polc等為靶基因建立的PCR檢測(cè)方法取得了優(yōu)異的檢測(cè)效果[17]，因此市售檢測(cè)試劑盒不斷研發(fā)出來(lái)。包世俊等[18]依據(jù)牛支原體脂蛋白P48基因序列，設(shè)計(jì)了一對(duì)具有特異性的引物，建立了牛支原體的PCR檢測(cè)方法。結(jié)果顯示，常見(jiàn)病原菌的DNA樣品無(wú)相應(yīng)的擴(kuò)增條帶，其可檢測(cè)出的牛支原體DNA最低下限濃度約為0.002 875 ng/mL，該方法的檢出率與病原分離率一致。翟肖輝等[19]將牛支原體P80基因作為靶基因，設(shè)計(jì)出了qPCR特異性引物及探針，建立了牛支原體的TaqMan探針檢測(cè)方法，最低檢測(cè)下限為3.89 copies/μL，其靈敏度是普通PCR的4～10倍，為牛支原體的快速診斷和核酸定量檢測(cè)提供了方法。該方法具有檢測(cè)速度快、定量準(zhǔn)確、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，為各類(lèi)疫病防控奠定了基礎(chǔ)。

4.2 多重PCR方法

Parker等[20]根據(jù)牛支原體基因，設(shè)計(jì)了特異性引物，建立了一種多重PCR方法，同時(shí)檢測(cè)鼻拭子、奶樣和精液中的牛支原體。結(jié)果顯示，PCR檢測(cè)線最低的是奶樣，其次是鼻拭子和精液。楊莉等[21]利用牛支原體oppD基因序列、牛多殺性巴氏桿菌Pm-kmt基因序列和牛結(jié)核分枝桿菌IS6110基因序列，設(shè)計(jì)出了3對(duì)特異性引物，建立起多重PCR檢測(cè)方法。結(jié)果表明，該方法能同時(shí)對(duì)這3種病原體的靶基因進(jìn)行擴(kuò)增，特異性強(qiáng)、靈敏度高，并且可以對(duì)單一感染和混合感染進(jìn)行鑒別診斷。邢小勇等[22]基于牛傳染性鼻氣管炎病毒（IBRV）gB基因、牛支原體P48基因和肺炎克雷伯（KP）khe基因，設(shè)計(jì)了3對(duì)特異性引物，從而建立起檢測(cè)這3種病原體的多重PCR技術(shù)。結(jié)果顯示，IBRV最低檢出量為103TCID50，牛支原體最低檢出量為6.5×101cfu，KP的最低檢出量為8.1×101cfu，并且該方法與牛群中常見(jiàn)的其他病原體無(wú)交叉反應(yīng)。與傳統(tǒng)PCR方法相比較，多重PCR方法操作簡(jiǎn)便，只需要加樣1次，運(yùn)行1次反應(yīng)程序，便可檢測(cè)出多種病原體，具有成本低、檢出結(jié)果快等優(yōu)點(diǎn)。

4.3 等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）是21世紀(jì)初誕生的一種新型核酸擴(kuò)增技術(shù)。該方法操作簡(jiǎn)單，不需要實(shí)驗(yàn)室專(zhuān)業(yè)儀器，在60 ℃左右的等溫條件下，便可實(shí)現(xiàn)核酸擴(kuò)增，其擴(kuò)增效率是傳統(tǒng)PCR方法的10倍以上。Itoh等[23]將超快速提取技術(shù)和環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)相結(jié)合，建立起更簡(jiǎn)單、更快速、更靈敏的方法檢測(cè)牛奶中的牛支原體。結(jié)果表明，該方法可以在120 min內(nèi)得到檢測(cè)結(jié)果，對(duì)罐裝奶、初乳以及乳腺炎奶均適用。范晴等[24]基于牛支原體和牛傳染性鼻氣管炎病毒（IBRV）的保守基因序列，設(shè)計(jì)了2對(duì)特異性的LAMP引物，建立了能夠檢測(cè)牛支原體和IBRV的雙重?zé)晒釲AMP檢測(cè)方法。結(jié)果顯示，該方法與其他病原體無(wú)交叉反應(yīng)，最低檢測(cè)線可達(dá)到100 copies/μL。環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，可用于臨床大量樣本的檢測(cè)，但存在假陽(yáng)性高的缺點(diǎn)，雖然目前已經(jīng)找到措施對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化，但仍需進(jìn)一步驗(yàn)證[25]。

RPA技術(shù)利用重組酶與引物結(jié)合形成DNA復(fù)合物，對(duì)模板中的靶基因進(jìn)行對(duì)數(shù)式擴(kuò)增，在數(shù)分鐘內(nèi)便可得到擴(kuò)增產(chǎn)物。翟肖輝等[26]利用牛支原體P80基因序列，設(shè)計(jì)了特異性引物和探針，對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，建立了牛支原體的RPA檢測(cè)方法。最后將RPA與側(cè)向流（LF）試紙條結(jié)合，形成LF-RPA檢測(cè)方法，其最低可檢測(cè)基因組DNA 5 pg/μL，與熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果符合率為94%。該方法可現(xiàn)場(chǎng)操作，檢測(cè)結(jié)果可視化，為牛支原體快速檢測(cè)提供了技術(shù)支持。Li等[27]基于牛支原體的uvrC基因，建立了熒光檢測(cè)的RPA技術(shù)（實(shí)時(shí)RPA）與測(cè)流試紙條（LF）相結(jié)合的檢測(cè)技術(shù)，最低檢測(cè)線為1.0×101copies/μL，與熒光定量PCR檢出率一致。該方法未與其他病原體發(fā)生交叉反應(yīng)，可有效檢測(cè)牛支原體。

5 小結(jié)與展望

現(xiàn)階段牛支原體的實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)已經(jīng)取得了較大進(jìn)展，但每種診斷方法都存在著一定程度的局限性，在進(jìn)行診斷時(shí)，可以綜合考慮多種因素進(jìn)行選擇，多種診斷方法聯(lián)合檢測(cè)以提高牛支原體診斷的精確度。隨著研究者對(duì)牛支原體的研究不斷深入，快速、準(zhǔn)確、新型的診斷技術(shù)逐漸被報(bào)道，為牛支原體的診斷提供了科學(xué)依據(jù)。相信未來(lái)會(huì)有更多可靠、靈敏、成本低的診斷技術(shù)出現(xiàn)，為牛支原體病的防控奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。