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上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院 上海市兒科醫(yī)學(xué)研究所 兒內(nèi)分泌遺傳代謝科（上海 200092）

罕見病種類繁多，包括各種器官畸形、綜合征及功能缺陷疾病。遺傳代謝?。╥nherited metabolic disease，IMD）又稱先天性代謝異常（inborn errors of metabolism,IEM），屬于功能缺陷型罕見病，是由于基因變異引起維持正常代謝所必需的酶、受體、載體等蛋白功能缺陷，導(dǎo)致中間或旁路代謝產(chǎn)物蓄積或終末代謝產(chǎn)物缺乏，引起一系列臨床癥狀的一類單基因遺傳病[1]。大部分IMD屬于常染色體隱性遺傳，總體發(fā)病率約1/5000～1/1400[2]。IMD臨床表現(xiàn)復(fù)雜，缺乏特異性，全身各器官均可受累。其分類方式多樣，如根據(jù)代謝物可分為氨基酸代謝異常、碳水化合物代謝異常、脂肪酸氧化障礙、尿素循環(huán)障礙、有機(jī)酸代謝異常、維生素代謝異常及金屬元素代謝障礙等[3]；根據(jù)受累的細(xì)胞器可分為溶酶體病、線粒體病及過氧化物酶體病等。IMD 種類繁多，涉及體內(nèi)代謝途徑廣泛，病因復(fù)雜，其確診和分型依賴各種檢測(cè)。常規(guī)生化檢測(cè)如血常規(guī)、尿常規(guī)、血糖、肝功能、腎功能、電解質(zhì)、血?dú)夥治觥⒀?、乳酸及肌酸激酶等?xiàng)目出現(xiàn)異常，不能確定某種疾病，但可為IMD的診斷提供線索，判斷病情程度。如血肌酸激酶增高，則需要鑒別是否為脂肪酸氧化代謝病、肌營(yíng)養(yǎng)不良及甘油酸激酶缺乏癥等。

1 特殊生化檢測(cè)技術(shù)

1.1 免疫熒光檢測(cè)技術(shù)

免疫熒光檢測(cè)技術(shù)包含化學(xué)發(fā)光免疫分析法和放射免疫分析法。其中化學(xué)發(fā)光免疫分析法廣泛用于新生兒篩查中促甲狀腺素、17-羥孕酮、苯丙氨酸、葡萄糖6-磷酸脫氫酶檢測(cè)。該技術(shù)還可通過在外周血白細(xì)胞或羊水細(xì)胞加入底物，計(jì)算產(chǎn)物與底物的比值得出酶活性，作為診斷溶酶體貯積病的金標(biāo)準(zhǔn)，如戈謝病需檢測(cè)β-葡糖苷酶活性、法布累病應(yīng)檢測(cè)α-半乳糖苷酶活性、尼曼皮克病需檢測(cè)酸性鞘磷脂酶活性，且酶活性檢測(cè)是黏多糖貯積病分型的重要依據(jù)[2]?，F(xiàn)已有部分地區(qū)開始利用此技術(shù)進(jìn)行新生兒溶酶體疾病的篩查[4]。另外該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于四氫生物蝶呤還原酶缺乏癥、生物素酶缺乏癥及酮氧化酶缺乏癥等疾病的診斷。

1.2 串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)

串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)(tandem mass spectrometry,MS/MS)因其特異性高、同時(shí)準(zhǔn)確區(qū)分及定量多種代謝物等特點(diǎn)，可用于遺傳代謝病的篩查、診斷及治療隨訪檢測(cè)。該技術(shù)通過檢測(cè)濾紙干血斑中氨基酸、?；鈮A、同型半胱氨酸及不同類型類固醇激素等物質(zhì)的質(zhì)荷比（質(zhì)量數(shù)/所帶電荷數(shù)）對(duì)其進(jìn)行定性及定量分析[5]，其優(yōu)點(diǎn)在于檢測(cè)方法快速、特異性強(qiáng)，可在2～3 分鐘內(nèi)對(duì)1 個(gè)3 mm 濾紙干血斑中幾十種代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析，對(duì)多種氨基酸、有機(jī)酸、脂肪酸氧化代謝紊亂的疾病及類固醇激素相關(guān)代謝病進(jìn)行新生兒篩查、臨床患者的診斷及鑒別診斷。該項(xiàng)技術(shù)除了可實(shí)現(xiàn)一個(gè)血斑一次實(shí)驗(yàn)檢測(cè)多種疾病[6]，并可設(shè)置相關(guān)氨基酸及酰基肉堿間的比值，進(jìn)一步降低檢測(cè)的假陽性率和假陰性率。1990年美國(guó)Millintong 等[5]首次將此技術(shù)用于IMD 的檢測(cè)。2002 年上海新華醫(yī)院率先將其應(yīng)用于新生兒疾病篩查及臨床患者檢測(cè)[7]，目前串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)已廣泛用于新生兒氨基酸代謝障礙、有機(jī)酸血癥、脂肪酸氧化代謝障礙、先天性腎上腺皮質(zhì)增生癥、溶酶體疾病及X-連鎖腎上腺腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良的篩查[8-11]，并形成了新生兒疾病串聯(lián)質(zhì)譜篩查技術(shù)專家共識(shí)[12]。

1.2.1 血氨基酸譜檢測(cè) 氨基酸水平測(cè)定是診斷IMD 的重要方法，尤其是與氨基酸代謝障礙相關(guān)。但血液中氨基酸水平受諸多因素影響，包括年齡、營(yíng)養(yǎng)狀況、生理變化、疾病及治療情況等，因此氨基酸結(jié)果分析應(yīng)結(jié)合臨床進(jìn)行綜合評(píng)估。部分氨基酸代謝病患者尿中特異的有機(jī)酸可增高，因此血中某些氨基酸增高結(jié)合其相應(yīng)的尿有機(jī)酸增高更有助于診斷。如酪氨酸血癥不僅血酪氨酸、酪氨酸與苯丙氨酸比值增高，同時(shí)尿4-羥基苯乳酸和4-羥基苯丙酮酸也可增高。

1.2.2 ?；鈮A譜檢測(cè) ?；鈮A是脂肪酸、有機(jī)酸代謝的中間產(chǎn)物，多種脂肪酸和有機(jī)酸代謝異常均伴有肉堿和?；鈮A的改變。如血游離肉堿降低可提示原發(fā)性肉堿缺乏或繼發(fā)性肉堿缺乏，其水平顯著降低常見于原發(fā)性肉堿缺乏癥；而輕度降低則多繼發(fā)于營(yíng)養(yǎng)不良、長(zhǎng)期素食、反復(fù)嘔吐、腹瀉或其他疾病消耗肉堿所致，如有機(jī)酸血癥和脂肪酸氧化代謝病等。臨床疑似有機(jī)酸血癥或脂肪酸氧化代謝病時(shí)首選串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)。另外，串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)羊水?；鈮A水平可用于判斷胎兒是否患有有機(jī)酸血癥，故有機(jī)酸血癥的產(chǎn)前診斷可利用串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)羊水?；鈮A水平[13]。

1.2.3 類固醇激素譜檢測(cè) 目前類固醇激素的測(cè)定主要采用各種不同的免疫分析方法，但由于各種類固醇激素在體內(nèi)水平極低，一般檢測(cè)水平在nmol/L或pmol/L 數(shù)量級(jí)，上述方法雖能達(dá)到一定準(zhǔn)確度，但仍存在不同激素間的交叉反應(yīng)、敏感度和特異度不高[14-15]。串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)通過檢測(cè)不同激素間質(zhì)荷比進(jìn)行定性，可有效降低假陽性率，提高陽性預(yù)測(cè)值，廣泛用于新生兒先天性腎上腺皮質(zhì)增生癥（congenital adrenal hyperplasia，CAH）的二級(jí)篩查[16]。此外，串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)通過檢測(cè)不同種類類固醇激素水平，還可篩查除21-羥化酶缺乏癥外的其他CAH類型[17]。

1.2.4 同型半胱氨酸檢測(cè) 同型半胱氨酸（homocysteine,Hcy）通常是利用循環(huán)酶法檢測(cè),但其高水平的內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)測(cè)定結(jié)果有較大干擾。高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）由于具有高敏感性、特異性及準(zhǔn)確性，且能更精確地測(cè)定各類同型半胱氨酸水平，近年來已被用于總Hcy的臨床檢測(cè)[18]。

1.2.5 溶酶體酶活性檢測(cè) 溶酶體酶活性檢測(cè)主要用于溶酶體貯積?。╨ysosomal storage disorders,LSDs）臨床疑似患者的診斷及新生兒篩查，檢測(cè)方法包括串聯(lián)質(zhì)譜法、熒光法和多免疫定量法。熒光法因每次實(shí)驗(yàn)只能檢測(cè)一種酶活性，多免疫定量法因尚未商品化還難以推廣[19-20]。串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)可根據(jù)酶反應(yīng)產(chǎn)物和內(nèi)標(biāo)特征離子對(duì)定量，得到產(chǎn)物與內(nèi)標(biāo)的信號(hào)強(qiáng)度比值，從而計(jì)算出酶活性，每次用1個(gè)干血斑樣本可同時(shí)檢測(cè)6種酶活性，包括酸性β-葡萄糖腦苷脂酶、酸性鞘磷脂酶、β-半乳糖腦苷脂酶、a-L-艾杜糖苷酸酶、a-半乳糖苷酶和酸性a-葡糖苷酶，具有較好的靈敏度和準(zhǔn)確度，更適用于開展高通量的新生兒LSDs篩查[21]。

1.2.6 極長(zhǎng)鏈脂肪酸檢測(cè) 血清極長(zhǎng)鏈脂肪酸（very long chain fatty acids,VLCFAs）定量檢測(cè)是診斷X-連鎖腎上腺腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良（X-linkedadrenoleukodystrophy,X-ALD）最主要的生化方法。國(guó)內(nèi)多采用衍生化的質(zhì)譜方法檢測(cè)二十二碳脂肪酸(C22:0)、二十四碳脂肪酸(C24:0)、二十六碳脂肪酸(C 26:0)水平以及C 24:0/C 22:0 比值、C 26:0/C 24:0 比值[22]。近年來通過非衍生化的串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)檢測(cè)濾紙干血片中極長(zhǎng)鏈?；鈮A（very long chain acylcarnitine,VLCAC）和溶血磷脂酰膽堿（lysophosphatidylcholine,LPC）可極大縮短每份樣本的檢測(cè)時(shí)間，精密度和準(zhǔn)確性較好，適合高通量的新生兒篩查。目前，國(guó)際上多采用LPC（特別是C26:0-LPC）作為X-ALD的篩查指標(biāo)[23]。但研究表明C26和C 26/C 22 比值更適合作為我國(guó)診斷X-ALD 的生物標(biāo)志物[11]。

1.3 氣相色譜質(zhì)譜檢測(cè)

氣相色譜質(zhì)譜技術(shù)（gas chromatography-mass spectrometry,GC/MS）是通過檢測(cè)尿液中有機(jī)酸質(zhì)荷比對(duì)其進(jìn)行定性及定量分析，可為40多種IMD的診斷提供可靠依據(jù)，是目前常用的IMD檢測(cè)方法之一[24]。自1966 年Tanaka 等[25]首次通過GC/MS 檢測(cè)尿有機(jī)酸譜診斷異戊酸血癥，GC/MS極大促進(jìn)了IMD的診治，成為有機(jī)酸血癥鑒別診斷的主要方法。卜欣欣等[26]采用GC/MS 技術(shù)對(duì)2 461 例IMD 患兒尿液中132種代謝物進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)32種氨基酸、有機(jī)酸及脂肪酸氧化代謝病，揭示了此項(xiàng)技術(shù)在IMD患兒中各類疾病的疾病譜，證明GC/MS技術(shù)對(duì)IMD診斷具有特異性。如甲基丙二酸血癥和丙酸血癥中血丙酰肉堿均增高，僅通過MS/MS 檢測(cè)難以鑒別，通過GC/MS檢測(cè)尿有機(jī)酸，若甲基丙二酸及甲基枸櫞酸等增高提示甲基丙二酸血癥，甲基枸櫞酸及3-羥基丙酸增高則提示丙酸血癥。此外，血MS/MS檢測(cè)中3-羥基異戊酰肉堿不同程度增高可提示的疾病包括3-甲基巴豆酰輔酶A羧化酶缺乏癥、多種羧化酶缺乏癥、β-酮硫解酶缺乏癥及3-羥基-3-甲基戊二酸尿癥等，但疾病明確診斷則需通過檢測(cè)尿特異有機(jī)酸水平。如尿3-甲基巴豆酰甘氨酸、3-羥基異戊酸伴3-羥基丙酸、甲基枸櫞酸等增高提示多種羧化酶缺乏癥，不伴3-羥基丙酸及甲基枸櫞酸增高提示3-甲基巴豆酰輔酶A羧化酶缺乏癥；尿3-羥-3-甲基戊二酸特異性增高提示3-羥基-3-甲基戊二酸尿癥；而大量酮尿提示β-酮硫解酶缺乏癥。

1.4 其他檢測(cè)技術(shù)

1.4.1 尿黏多糖電泳檢測(cè) 尿黏多糖檢測(cè)是診斷黏多糖貯積癥最常用的簡(jiǎn)便方法。正常情況下，黏多糖可被相應(yīng)的水解酶降解，故尿中黏多糖檢測(cè)為陰性。只有當(dāng)相應(yīng)酶缺陷或活性下降時(shí)，不完全降解的黏多糖在體內(nèi)貯積，最終從尿中排出，致尿中黏多糖檢測(cè)陽性[27]。因此，如尿黏多糖陽性，則間接反應(yīng)黏多糖水解酶缺乏或活性下降。由于不同酶缺陷導(dǎo)致降解產(chǎn)物不同，故可根據(jù)尿中黏多糖的不同，進(jìn)行初步分型及診斷。

1.4.2 尿蝶呤譜檢測(cè) 尿蝶呤譜分析是四氫生物蝶呤（tetrahydrobiopterin,BH4）缺乏癥篩查最重要的檢測(cè)方法之一。該方法通過檢測(cè)尿?yàn)V紙片中新蝶呤（N）、生物蝶呤（B），并計(jì)算B%[B/(B+N)X100%]來鑒別診斷6-丙酮酰四氫蝶呤合成酶（PTPS）缺乏、BH 4 合成酶尿苷三磷酸環(huán)水解酶（GTPCH）缺乏、BH 4 還原酶-紅細(xì)胞二氫蝶呤還原酶（DHPR）缺乏這三種分型[28]，具有有效且快速的特點(diǎn)。

2 遺傳學(xué)檢測(cè)

遺傳代謝病多為單基因病，染色體異常引起者少見。遺傳學(xué)檢測(cè)主要包括Sanger 測(cè)序、基因高通量測(cè)序、多重連接依賴探針擴(kuò)增技術(shù)（multiplex ligation dependent probe amplification,MLPA）、定量PCR及染色體芯片檢測(cè)。

2.1 Sanger測(cè)序

Sanger 測(cè)序也稱一代測(cè)序，廣泛應(yīng)用于已知單基因遺傳病致病基因或熱點(diǎn)致病位點(diǎn)的遺傳檢測(cè)。其優(yōu)點(diǎn)是可檢測(cè)點(diǎn)突變、特異性強(qiáng)及快速，缺點(diǎn)是不能檢測(cè)基因大片段缺失和重復(fù)，如肌營(yíng)養(yǎng)不良和脊肌萎縮癥，所以Sanger 測(cè)序結(jié)果陰性只能排除目標(biāo)區(qū)域的特定突變。

2.2 基因高通量測(cè)序

基因高通量測(cè)序技術(shù)（next generation sequencing,NGS）可同時(shí)對(duì)幾十個(gè)基因至全基因進(jìn)行測(cè)序，其優(yōu)點(diǎn)是高通量、自動(dòng)化程度高，疾病覆蓋廣，在臨床應(yīng)用中，對(duì)于與多個(gè)基因相關(guān)疾病的基因診斷更有意義。根據(jù)測(cè)序區(qū)域范圍大小，NGS 分為全基因組測(cè)序(whole genome sequencing，WGS)、全外顯子測(cè)序(whole exome sequencing，WES)和靶向捕獲測(cè)序（Panel），其中WES 是目前IMD 的主要分子診斷手段[29]。如黏多糖貯積癥有多種亞型，NGS技術(shù)可對(duì)其致病基因同時(shí)測(cè)序，縮短檢測(cè)時(shí)間，降低檢測(cè)費(fèi)用。因此NGS 可以快速、精確地檢測(cè)出常見IMD 的基因突變，為患者提供準(zhǔn)確的基因診斷。對(duì)于病因不明的疑似遺傳病患者優(yōu)選高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)基因變異，鑒別是否有基因變異導(dǎo)致的疾病。

2.3 MLPA檢測(cè)

多重連接依賴探針擴(kuò)增技術(shù)（multiplex ligation dependent probe amplification,MLPA）是針對(duì)待測(cè)核苷酸中靶序列進(jìn)行的定性和半定量分析技術(shù)。該方法靈敏度高、針對(duì)性強(qiáng)，主要檢測(cè)染色體數(shù)目非整倍體異常、基因或基因片段的缺失或重復(fù)及基因甲基化，臨床上多用于檢測(cè)由于染色體異?；蚧虼笃稳笔录膊。缍攀霞I(yíng)養(yǎng)不良、地中海貧血、脊髓性肌萎縮癥、貓叫綜合征（5 p 缺失）、DiGeoge綜合征等。雖然該技術(shù)具備較多優(yōu)點(diǎn)，但仍存在不能檢測(cè)未知點(diǎn)突變及染色體平衡易位等局限性，因此僅對(duì)于部分檢測(cè)不到基因突變的遺傳代謝病可進(jìn)行MLPA檢測(cè)，以便發(fā)現(xiàn)拷貝數(shù)異常。由于MLPA檢測(cè)的疾病數(shù)量較少，限制了此技術(shù)在臨床的開展。

2.4 熒光定量PCR檢測(cè)

熒光定量PCR 檢測(cè)（quantitative fluorescence PCR,QF-PCR）是快速靶向分子診斷技術(shù)，已廣泛用于檢測(cè)基因拷貝數(shù)變異領(lǐng)域，如脊髓性肌萎縮癥的診斷[30]，具有快速便捷、成本低廉、普及度高等特點(diǎn)。該方法可通過檢測(cè)SMN1基因第7外顯子的拷貝數(shù)判斷SMN1基因的缺失情況，從而快速明確是否患病、是否攜帶致病基因，尤其適用于該病攜帶者及其產(chǎn)前篩查[31]。定量PCR也常用于基因變異位點(diǎn)檢測(cè)，如耳聾基因檢測(cè)，利用定量PCR可以檢測(cè)數(shù)個(gè)耳聾基因的幾個(gè)已知變異位點(diǎn)，取得了較好的效果[32]。

2.5 染色體芯片檢測(cè)

染色體芯片技術(shù)也稱染色體微陣列芯片分析（chromosome array analysis,CMA），可以幫助臨床醫(yī)師對(duì)兒童發(fā)育異常相關(guān)的罕見病進(jìn)行明確診斷，如Prader-willi 綜合征、貓叫綜合征、22 q 11.2 缺失綜合征、Williams-Beuren綜合征、Angelman綜合征、Russell-silver 綜合征等。對(duì)于發(fā)育落后伴外觀畸形或多臟器畸形的患者優(yōu)選染色體芯片檢測(cè)。

上述檢測(cè)技術(shù)均是診斷IMD 的重要檢測(cè)方法，臨床醫(yī)師需要了解各項(xiàng)技術(shù)的檢測(cè)目標(biāo)、適應(yīng)疾病及檢測(cè)周期。在遺傳代謝病疑似患者的診治過程中，依據(jù)患者的臨床表現(xiàn)，選擇合適檢測(cè)方法，達(dá)到即經(jīng)濟(jì)又高效的目的，對(duì)患者進(jìn)行精準(zhǔn)的診斷或排除遺傳代謝病。