王瑜婷，鄺敏，何榮榮，潘玲，黎桃敏，鐘志奎，孫冬梅（廣東一方制藥有限公司/廣東省中藥配方顆粒企業(yè)重點實驗室，廣東 佛山 528244）

艾葉為菊科植物艾Artemisia argyiLevl. et Vant.的干燥葉，性溫，味辛、苦，具有溫經(jīng)止血、散寒止痛的功效，內(nèi)服治療吐血、衄血、崩漏、月經(jīng)過多、胎濡下血、少腹冷痛、經(jīng)寒不調(diào)、宮冷不孕等疾病，外用可治療皮膚痛癢[1-3]?，F(xiàn)代研究表明，艾葉的主要化學(xué)成分為揮發(fā)油、酚酸類、黃酮類、萜類等，具有抗菌、抗病毒、平喘鎮(zhèn)咳祛痰、止血、抗凝血、抗過敏、鎮(zhèn)靜、護(hù)肝利膽及補體激活等作用[4]。

酚酸類成分具有清除自由基、抗菌、消炎、抗病毒、保肝利膽、降血壓、降血脂等作用，是艾葉重要的藥效物質(zhì)。植物中廣泛存在的綠原酸異構(gòu)體有綠原酸（3-咖啡?？崴幔?、隱綠原酸（4-咖啡酰奎尼酸）、新綠原酸（5-咖啡?？崴幔惥G原酸A（3，5-二咖啡酰奎尼酸）、異綠原酸B（3，4-二咖啡?？崴幔?、異綠原酸C（4，5-二咖啡?？崴幔┑萚5]。一測多評（quantitative analysis of multi-components by single marker，QAMS）法是選定一個成分作內(nèi)參物，同時實現(xiàn)多個同類型化合物的含量測定方法，回避了多對照品、高配置檢測儀器的檢測條件，適合中藥質(zhì)量評價檢測特點[6]。因此，本文以綠原酸作為內(nèi)參物，建立艾葉配方顆粒的QAMS法，同時測定新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C的含量，不僅節(jié)約了檢測成本，同時為進(jìn)一步提高艾葉配方顆粒整體質(zhì)量控制水平提供了科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

Waters H-Class型超高效液相色譜儀（Waters公司）；Agilent 1290型超高效液相色譜儀（Agilent公司）；Shimadzu LC-40型超高效液相色譜儀（島津公司）；XP26型百萬分之一天平、ME204E型萬分之一天平（METTLER TOLEDO公司）；Milli-Q Direct型超純水系統(tǒng)（Merck公司）；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

綠原酸（批號：110753-202018，純度：96.1%，中國食品藥品檢定研究院）；新綠原酸（批號：DSTDX001503，純度：99.58%）、隱綠原酸（批號：DST220104-035，純度：99.3%）、異綠原酸C（批號：DSTDY003802，純度：99.58%）（德思特生物技術(shù)有限公司）；異綠原酸B（批號：wkq210222206，純度：99.85%）、異綠原酸A（批號：wkq21020306，純度：99.45%）（四川省維克奇生物科技有限公司）；甲醇、乙腈（色譜純，Merck股份有限公司），甲酸（色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；水為超純水，其他試劑均為分析純。13批艾葉配方顆粒（編號：S1～S13，廣東一方制藥有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3（150 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動相：乙腈（A）-0.1%甲酸溶液（B），梯度洗脫（0～2 min，8%A；2～4 min，8%～10%A；4～8 min，10%～15%A；8～12 min，15%～18%A；12～18 min，18%～19%A；18～22 min，19%～21%A；22～25 min，21%～37%A；25～28 min，37%～100%A；28～32 min，100%A；32～35 min，100%～8%A；35～45 min，8%A）；流速：0.3 mL·min-1；柱溫：30℃；檢測波長：325 nm；進(jìn)樣量：1 μL。

2.2 對照品溶液的制備

分別取新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C對照品適量，精密稱定，加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為55.140、68.189、56.138、121.078、71.121、135.035 μg·mL-1的混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取艾葉配方顆粒適量，研細(xì)，取約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇25 mL，稱定重量，超聲處理（功率300 W，頻率40 kHz）30 min，取出，放冷，再稱定重量，用80%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 專屬性試驗 分別精密吸取空白溶劑、混合對照品溶液及供試品溶液（S12）進(jìn)樣測定，結(jié)果見圖1?？梢?，供試品溶液色譜在與對照品溶液色譜相應(yīng)的保留時間處具有相同的色譜峰，且空白溶劑無干擾，表明該方法專屬性良好。

圖1 專屬性試驗UPLC色譜圖Fig 1 UPLC diagram of specific test

2.4.2 線性關(guān)系考察 分別精密吸取“2.2”項下混合對照品儲備液0.5、1.0、3.0、5.0、8.0、10 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成系列質(zhì)量濃度的混合對照溶液。按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，以對照品溶液質(zhì)量濃度（μg·mL-1）為橫坐標(biāo)（X），以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表1?？芍?個成分在相應(yīng)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

表1 6個成分的線性關(guān)系考察結(jié)果Tab 1 Linearity of 6 components

2.4.3 精密度考察 精密吸取“2.2”項下混合對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，計算得新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C峰面積的RSD均小于2.0%，表明儀器精密度良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗 取艾葉配方顆粒（S12），精密稱定，按“2.3”項下方法制備，分別在0、4、8、12、24、48 h進(jìn)樣測定，計算得新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C峰面積的RSD均小于2.0%，表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.5 重復(fù)性試驗 取艾葉配方顆粒（S12），精密稱定，平行稱定6份，按“2.3”項下方法制備，進(jìn)樣測定。計算得新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C含量的RSD均小于2.0%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.6 加樣回收試驗 取已知含量的艾葉配方顆粒（S12），精密稱取9份，每份約0.1 g，置具塞錐形瓶中，均分為3組，每組分別精密加入相當(dāng)于含有量50%、100%、150%的混合對照品溶液，按“2.3”項下方法制備，進(jìn)樣測定，計算加樣回收率及RSD，結(jié)果見表2。新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C的平均加樣回收率在90.6%～102.0%，RSD均小于5.0%，表明該方法準(zhǔn)確性良好。

表2 6個成分的加樣回收試驗結(jié)果(n＝3)Tab 2 Recovery of the 6 components (n＝3)

2.5 QAMS法的建立

2.5.1 相對校正因子（?）的確定 取“2.2”項下混合對照品溶液，以綠原酸作為內(nèi)參物，考察不同進(jìn)樣量（0.2、0.5、0.8、1.0、1.5 μL）下新綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C的?。公式為?s/i＝?i/?s＝（Ci/Ai）/（Cs/As）＝（Ci×As）/（Cs×Ai），式中As為內(nèi)參物峰面積，Cs為內(nèi)參物濃度，Ai為某待測成分峰面積，Ci為待測成分濃度[7]。計算得?分別為1.00、0.94、1.20、1.25、1.16，RSD分別為0.00%、0.48%、0.95%、1.0%、1.7%，結(jié)果見表3。

表3 5個成分的相對校正因子(n＝5)Tab 3 Relative correction factors of 5 components (n＝5)

2.5.2 色譜儀及色譜柱對?的影響 以綠原酸為內(nèi)標(biāo)物，考察其他成分在不同超高效液相色譜儀Waters H-Class型、Agilent 1290型、Shimadzu LC-40型，以及不同色譜柱ZORBAX RRHD SB C18（150 mm×2.1 mm，1.8 μm）、ACQUITY UPLC HSS T3（150 mm×2.1 mm，1.8 μm）、CORTECS UPLC T3（150 mm×2.1 mm，1.6 μm）下的?，結(jié)果見表4，各成分的?的RSD均小于2.0%，表明不同色譜系統(tǒng)和色譜柱對各成分的?無顯著影響。

表4 不同色譜儀和色譜柱對相對校正因子的影響(n＝3)Tab 4 Effect of instrument and column on relative correction factor (n＝3)

2.5.3 流速對?的影響 以綠原酸為內(nèi)標(biāo)物，考察不同流速（0.20、0.25、0.30、0.35、0.40 mL·min-1）下的?，結(jié)果見表5，各成分的?的RSD均小于1.0%，表明不同流速對各成分的?無顯著影響。

表5 不同流速對相對校正因子的影響(n＝3)Tab 5 Effect of flow velocity on relative correction factor (n＝3)

2.5.4 柱溫對?的影響 以綠原酸為內(nèi)標(biāo)物，考察不同柱溫（25、28、30、35℃）下的?，結(jié)果見表6，各成分的?的RSD均小于1.0%，表明不同柱溫對各成分的?無顯著影響。

表6 不同柱溫對相對校正因子的影響(n＝3)Tab 6 Effect of column temperature on relative correction factor (n＝3)

2.5.5 檢測波長對?的影響 以綠原酸為內(nèi)標(biāo)物，考察不同檢測波長（320、323、325、327、330 nm）下的?，結(jié)果見表7，各成分的?的RSD均小于2.0%，表明不同檢測波長對各成分的?無顯著影響。

表7 不同檢測波長對相對校正因子的影響(n＝3)Tab 7 Effect of detectionwavelength on relative correction factor (n＝3)

2.5.6 梯度程序?qū)?的影響 以綠原酸為內(nèi)標(biāo)物，考察“2.1”項下梯度程序波動（-5%～+5%）下的?，結(jié)果見表8，各成分的?的RSD均小于5.0%，表明不同梯度程序?qū)?無顯著影響。

表8 不同梯度程序?qū)ο鄬πＵ蜃拥挠绊?n＝3)Tab 8 Effect of gradient program on relative correction factor (n＝3)

2.6 待測成分色譜峰的定位

目前，常用的色譜峰定位方法有相對保留值法、保留時間差法、時間校正法、對照提取物法等。保留時間差法計算公式為Δti/s＝ti-ts；相對保留值法計算公式為ti/＝ti/ts

[8]。本文采用相對保留值法，以綠原酸為內(nèi)參物，考察其他成分在不同超高效液相色譜儀以及色譜柱下的相對保留值，結(jié)果見表9，各成分相對保留值的RSD均小于2.0%，表明不同色譜系統(tǒng)和色譜柱對各成分相對保留值無顯著影響。

表9 不同色譜儀和色譜柱對相對保留值的影響(n＝3)Tab 9 Effect of instrument and column on relative retention time (n＝3)

2.7 外標(biāo)法（ESM）和QAMS法結(jié)果對比

取13批艾葉配方顆粒適量（S1～S13），精密稱定，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測定，分別采用ESM和QAMS法測定各成分含量，利用SPSS 26.0軟件對結(jié)果進(jìn)行Pearson相關(guān)系數(shù)（r）分析，結(jié)果見表10，兩種方法的r均為1.000，具有高相關(guān)性（P＞0.05）。驗證ESM和QAMS法測定艾葉配方顆粒中新綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A和異綠原酸C的含量，計算2種測定方法下的相對誤差，相對誤差（%）＝（QAMS含量-ESM含量）/QAMS含量×100%[9]，結(jié)果顯示新綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A和異綠原酸C的測定相對誤差范圍分別為0.85%～1.10%、0.00%～0.24%、0.44%～0.59%、0.14%～0.39%、0.65%～0.79%，均小于1.2%，表明建立的艾葉配方顆粒QAMS法測定結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

表10 6個成分的含量測定結(jié)果(n＝3，%)Tab 10 Content determination of 6 components (n＝3，%)

3 討論

3.1 待測組分的選擇

艾葉配方顆粒為艾葉飲片經(jīng)水提、分離、濃縮、干燥、制粒而成的顆粒，在中醫(yī)藥理論指導(dǎo)下，按照中醫(yī)臨床處方調(diào)配后，沖服使用。目前有關(guān)艾葉藥材或飲片的多指標(biāo)含量測定報道較多[10-13]，對相關(guān)制劑定量分析的報道較少。艾葉中含量較高的藥效成分有酚酸類、揮發(fā)油等，其中酚酸類成分為水溶性成分，易于檢測，因此本研究將6個酚酸類成分作為艾葉配方顆粒質(zhì)量控制的指標(biāo)[14-15]，其中，綠原酸含量、保留時間適中，易于對其他成分進(jìn)行定位，且綠原酸對照品來源充足，化學(xué)性質(zhì)較穩(wěn)定，選其作為內(nèi)參物能夠充分體現(xiàn)QAMS法低成本的優(yōu)勢。

3.2 提取方法及色譜條件的選擇

本研究對供試品溶液的提取方式（超聲法、回流法），提取溶劑（50%乙醇、80%乙醇、無水乙醇、50%甲醇、80%甲醇、甲醇），提取時間（30、45、60 min）和稀釋倍數(shù)（25、50、100 倍）進(jìn)行考察。結(jié)果表明，按“2.3”項下方法制備供試品溶液時色譜峰分離度較好。采用PDA檢測器在210～400 nm內(nèi)對供試品溶液進(jìn)行掃描，發(fā)現(xiàn)在325 nm時色譜圖基線平穩(wěn)、噪聲小，各組分的響應(yīng)值較高，因此，選擇325 nm作為檢測波長。

3.3 QAMS法的建立

正確定位各待測成分的色譜峰是評價QAMS法可行性的重要步驟，本研究應(yīng)用不同高效液相色譜儀和品牌色譜柱，分別考察保留時間差和相對保留時間的可靠性，最終發(fā)現(xiàn)相對保留時間更能準(zhǔn)確定位各待測成分色譜峰。常用來計算?的方法有多點校正法和斜率校正法，而采用斜率校正法，要求標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系較好，斜率與截距之比大于100，計算得到的校正因子才具有較好的重復(fù)性和準(zhǔn)確性[16]，故本研究采用多點校正法計算?，方法學(xué)耐用性考察中RSD均小于5.0%，表明該方法穩(wěn)定可行，可為艾葉配方顆粒的質(zhì)量控制提供參考。