管慶霞，周小影，劉宇萌，于欣，趙芳園（.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，哈爾濱 50040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，哈爾濱 50040）

甘草次酸（GA）及其衍生物的抗腫瘤作用已被廣泛研究。GA可通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和激活半胱天冬酶依賴途徑來(lái)誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡，還通過(guò)下調(diào)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、淋巴管內(nèi)皮透明質(zhì)酸受體1（LYVE-1）和基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）蛋白的表達(dá)來(lái)抑制肝癌的血管化和淋巴轉(zhuǎn)移[1-2]。聚乙二醇（PEG）修飾的納米給藥系統(tǒng)可延長(zhǎng)納米粒在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間，且透過(guò)細(xì)胞膜的能力增強(qiáng)。細(xì)胞內(nèi)外存在氧化還原電位，而二硫鍵能夠在細(xì)胞外環(huán)境中穩(wěn)定存在，在還原性的細(xì)胞內(nèi)環(huán)境中被谷胱甘肽（GSH）還原，腫瘤細(xì)胞中GSH的濃度比細(xì)胞外及正常細(xì)胞均較高，能夠提供還原環(huán)境，使得二硫鍵發(fā)生斷裂，實(shí)現(xiàn)高效釋藥的目的[3-4]。

馬錢子堿具有抗炎、抗腫瘤及增強(qiáng)機(jī)體免疫力等作用，是一種高效的抗腫瘤單體，但水溶性差、具有毒性等缺點(diǎn)制約了其在臨床上的應(yīng)用[5-6]。如何將藥物靶向于肝，使其更好地發(fā)揮療效，已成為目前亟需攻克的難題。

本試驗(yàn)基于GA的肝靶向性及抗腫瘤的藥理作用，PEG長(zhǎng)循環(huán)特性及二硫鍵細(xì)胞內(nèi)可斷裂特點(diǎn)，將GA、PEG以及二硫鍵進(jìn)行制備，構(gòu)建GA介導(dǎo)的馬錢子堿自組裝納米粒，以期提高馬錢子堿生物利用度，發(fā)揮長(zhǎng)效作用。采用HPLC法建立馬錢子堿在血漿中含量測(cè)定的體內(nèi)分析方法，經(jīng)尾靜脈注射后在不同時(shí)間點(diǎn)大鼠眼眶取血，HPLC含量測(cè)定后DAS 2.0軟件對(duì)藥時(shí)數(shù)據(jù)進(jìn)行方程擬合，得出藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，從而分析體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)差異。

1 儀器與試藥

DF-101Z恒溫磁力攪拌器（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）；氮?dú)獯蹈蓛x（BFC八方世紀(jì)）；微型渦旋混合器（上海滬西分析儀器廠有限公司）；e2695-2698高效液相色譜儀（美國(guó)Waters公司）；離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；十萬(wàn)分之一分析電子天平（瑞士METTLER TOLEDO公司）；微量移液器（大龍合資）。

肝素鈉注射液（江蘇萬(wàn)邦生化醫(yī)藥股份有限公司，批號(hào)：1209124，規(guī)格：2 mL：12 500 U）；B-GPSG-NPs凍干品、B-PSG-NPs凍干品（自制，載藥量約2.58%）；羥基酪醇（HT）對(duì)照品（批號(hào)：20130301，蘇州皓翔化學(xué)科技有限公司）、馬錢子堿對(duì)照品（批號(hào)：110706-200505，純度均＞98%，中國(guó)食品藥品檢定研究院）。

SPF級(jí)SD大鼠，雌雄各半（200±20）g（批準(zhǔn)文號(hào)2016101601，黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)試驗(yàn)動(dòng)物中心）。

2 方法與結(jié)果

2.1 GA介導(dǎo)的馬錢子堿自組裝納米粒的制備及表征

2.1.1 GA介導(dǎo)的馬錢子堿自組裝納米粒的制備 課題組前期通過(guò)酰胺、酯化等方法將GA、PEG以及二硫鍵進(jìn)行制備，構(gòu)建出GA介導(dǎo)的馬錢子堿自組裝納米粒載體；溶劑乳化超聲法制備GA介導(dǎo)的馬錢子堿自組裝納米粒；制備成B-GPSG-NPs凍干粉[7]，GA介導(dǎo)的馬錢子堿自組裝納米粒結(jié)構(gòu)如圖1所示。

圖1 GA介導(dǎo)的馬錢子堿自組裝納米粒結(jié)構(gòu)圖Fig 1 Structure of GA-mediated brucine self-assembled nanoparticles

2.1.2 GA介導(dǎo)的馬錢子堿自組裝納米粒的表征

① 外觀：B-GPSG-NPs凍干粉，外觀均為白色疏松的固體粉末，色澤均勻，外觀飽滿且光潔細(xì)膩，輕輕振搖后能成塊脫落，見圖2。

圖2 納米凍干粉Fig 2 Freeze-drying powder of B-GPSG-NPs

② 形態(tài)觀察：將B-GPSG-NPs凍干粉復(fù)溶后，經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾，滴入覆有支持膜的銅網(wǎng)上，吸去過(guò)量液體，自然干燥，隨后滴加濃度為2%的磷鎢酸溶液，染色2～3 min，自然干燥，置于透射電子顯微鏡（TEM）下觀察并拍照。結(jié)果見圖3。凍干后粒徑和形態(tài)基本沒(méi)有變化，為分散均勻的圓球形納米粒。

圖3 B-GPSG-NPs透射電鏡照片F(xiàn)ig 3 B-GPSG-NPs by TEM

③ 再分散性：取適量B-GPSG-NPs凍干粉樣品3批，加入適量注射用水進(jìn)行復(fù)溶，經(jīng)數(shù)次輕輕振搖后，很快分散成均勻淡藍(lán)色的納米粒溶液，說(shuō)明B-GPSG-NPs凍干粉再分散性良好（見圖4）。④ 粒徑及Zeta電位：取B-GPSG-NPs凍干粉用注射用水復(fù)溶后，得到納米溶液，測(cè)定粒徑及Zeta電位。結(jié)果其粒徑為（108.91±8.62）nm，Zeta電位為（-19.63±3.40）mV，PDI為（0.187±0.005），粒徑分布及電位見圖5。

圖4 B-GPSG-NPs凍干品復(fù)溶后的外觀圖Fig 4 B-GPSG-NPs after re-dissolving

圖5 粒徑分布圖及電位圖Fig 5 Particle size distribution and Zeta potential

⑤ 包封率及載藥量的測(cè)定

采用低溫超速離心法：量取3批B-GPSG-NPs溶液置于離心管中，超速離心（15 000 r·min-1，30 min），將沉淀的納米粒收集，再用蒸餾水超聲使其分散，繼續(xù)離心，重復(fù)3次，取沉淀部分。精密量取B-GPSG-NPs混懸液，加色譜甲醇超聲20 min（頻率：40 kHz，功率：200 W），使納米粒破乳，將包載的藥物充分釋放，過(guò)0.22 μm微孔濾膜，即得B-GPSG-NPs供試品溶液。同法制備不加藥物的GPSG空白納米粒溶液。過(guò)0.22 μm微孔濾膜，在流動(dòng)相為甲醇-（水-乙酸-三乙胺＝230∶2.4∶0.3）（30∶70）；色譜柱為Dikma C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；檢測(cè)波長(zhǎng)265 nm；流速1 mL·min-1；進(jìn)樣量20 μL；柱溫30℃條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算包封率以及載藥量。結(jié)果包封率及載藥量分別為（68.37±1.83）%和（1.86±0.05）%，均略有增加，RSD均小于5%，與前期相比，重現(xiàn)性良好，工藝可行。

⑥ 穩(wěn)定性評(píng)價(jià)：配制0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mol·L-1的Na2SO4溶液，制備GPSG空白納米粒，取0.5 mL的GPSG空白納米粒溶液加入至2.5 mL不同濃度的Na2SO4溶液中，37℃靜置10 min，560 nm波長(zhǎng)處紫外檢測(cè)各個(gè)樣品的吸光度值，進(jìn)行濃度-吸光度曲線的繪制，用于納米粒的穩(wěn)定性評(píng)價(jià)。

GPSG納米粒與一系列濃度的Na2SO4溶液作用后的吸光度變化曲線見圖6。由圖6可知，當(dāng)Na2SO4濃度低于0.7 mol·L-1時(shí)，體系的吸光度幾乎沒(méi)有變化，而當(dāng)電解質(zhì)濃度繼續(xù)增加后，體系的吸光度突然增大，這可能由于隨著電解質(zhì)濃度的進(jìn)一步增加，納米粒子穩(wěn)定性降低，體系吸光度發(fā)生突變。其臨界絮凝濃度為0.7 mol·L-1，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于人體血液中的電解質(zhì)濃度（主要成分為0.14 mol·L-1的鈉離子和0.10 mol·L-1的氯離子），表明納米粒子在電解質(zhì)水溶液中具有高度的穩(wěn)定性。

圖6 納米粒穩(wěn)定性Fig 6 Stability of nanoparticles

2.2 體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)分析方法的建立

2.2.1 色譜條件 流動(dòng)相為甲醇-（水-乙酸-三乙胺＝230∶2.4∶0.3）（30∶70）；色譜柱為Dikma C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；檢測(cè)波長(zhǎng)：265 nm；流速：1 mL·min-1；進(jìn)樣量：20 μL；柱溫：30℃。

2.2.2 血漿樣品的處理 取大鼠血漿250 μL，加入內(nèi)標(biāo)（20 μg·mL-1羥基酪醇甲醇溶液）20 μL，加入100 μL的NaOH溶液（1 mol·L-1），渦旋1 min，超聲20 min，放入2 mL萃取劑（二氯甲烷∶甲醇＝9∶1），渦旋5 min，超聲溶解20 min，離心5 min（轉(zhuǎn)速5000 r·min-1），收集下層液，上層血漿繼續(xù)加2 mL萃取劑，重復(fù)上述操作，合并下層液，置于37℃水浴氮?dú)獯蹈?，?00 μL色譜甲醇復(fù)溶，渦旋2 min，12 000 r·min-1離心10 min，取上清液進(jìn)樣測(cè)定。

2.2.3 專屬性考察 取空白血漿、含馬錢子堿對(duì)照品和內(nèi)標(biāo)物羥基酪醇對(duì)照品的血漿、尾靜脈注射馬錢子堿后的血漿樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行處理，結(jié)果見圖7，血漿樣品處理的過(guò)程中未引入干擾物質(zhì)，馬錢子堿與內(nèi)標(biāo)羥基酪醇的分離度良好，血漿的內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)測(cè)定無(wú)干擾。

圖7 高效液相色譜圖Fig 7 HPLC chromatogram

2.2.4 線性關(guān)系的考察

① 馬錢子堿溶液的配制：稱取馬錢子堿對(duì)照品2.60 mg置于25 mL量瓶中，用適量甲醇定容，即得質(zhì)量濃度為104 μg·mL-1的對(duì)照品溶液，備用。

② 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：將馬錢子對(duì)照品溶液，用空白大鼠血漿逐級(jí)稀釋得到0.65、3.25、6.50、13.00、26.00、52.00 μg·mL-1系列質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液，按“2.2.2”項(xiàng)下方法處理，橫坐標(biāo)（X）為血漿中馬錢子堿質(zhì)量濃度，縱坐標(biāo)（Y）為對(duì)照品與內(nèi)標(biāo)物峰高之比，用加權(quán)最小二乘法進(jìn)行回歸運(yùn)算，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y＝0.038X+0.082，R2＝0.9986，馬錢子堿在0.65～52.00 μg·mL-1內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.2.5 精密度考察 精密量取馬錢子堿供試品溶液200 μL（40.00、20.00、4.00 μg·mL-1），揮干有機(jī)溶劑加入等量空白血漿，按“2.2.2”項(xiàng)下方法處理后進(jìn)樣分析，記錄峰面積，在日內(nèi)、日間分別測(cè)定6次，考察其精密度。結(jié)果表明，日內(nèi)與日間精密度RSD均小于10%，符合方法學(xué)要求。

2.2.6 穩(wěn)定性考察 精密量取等量馬錢子堿供試品溶液，分為高、中、低3個(gè)濃度（40.00、20.00、4.00 μg·mL-1）（n＝6），氮?dú)鈸]干，將適量的空白血漿加入其中，室溫靜置6、12、24 h，分別取樣并冷凍；間隔1、2、3周后取樣，按血漿樣品的處理和進(jìn)樣分析，記錄峰面積，結(jié)果RSD均小于5%，符合方法要求。

2.2.7 檢測(cè)限及定量限 將馬錢子堿對(duì)照品溶液不斷稀釋后進(jìn)行分析，測(cè)得馬錢子堿對(duì)照品溶液測(cè)定的檢測(cè)限為0.428 μg·mL-1，定量限為0.650μg·mL-1。由此可見，該方法的靈敏度較高，能滿足馬錢子堿含量測(cè)定的要求。

2.2.8 回收率考察 精密量取52、13、0.65μg·mL-1的馬錢子堿供試品溶液200 μL，各3份揮干有機(jī)溶劑，加入等量空白血漿，按“2.2.2”項(xiàng)下方法處理，進(jìn)樣分析，記錄峰面積。馬錢子堿峰高與未經(jīng)提取的相同量對(duì)照品（甲醇液）的峰高比較，得馬錢子堿的絕對(duì)回收率；另將馬錢子堿與羥基酪醇峰高之比代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方法，計(jì)算測(cè)得藥物濃度，與加入量比較，考察樣品的方法回收率，結(jié)果見表1，符合生物樣品的測(cè)定要求。

表1 回收試驗(yàn)結(jié)果(x±s，n＝3)Tab 1 Recovery (x±s，n＝3)

2.2.9 體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究

① 動(dòng)物分組及給藥：取18只健康大鼠，雌雄各半，隨機(jī)分成3組，分別為原料藥馬錢子堿溶液組，B-GPSG-NPs溶液組以及B-PSG-NPs溶液組，于給藥前的12 h進(jìn)行禁食不禁水，采用尾靜脈推注給藥的方式，每組注射馬錢子堿的劑量均為10 mg·kg-1。分別于給藥后的不用時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行取血（眼底靜脈叢毛細(xì)血管取血），取血時(shí)間點(diǎn)為10、30、60、90、120、150、180、210、240、300、420、600 min，取血量約為0.5 mL，隨后置于涂有肝素鈉的尖底離心管（規(guī)格：1.5 mL）中，6000 r·min-1離心10 min，取上層血漿，按“2.2.2”項(xiàng)下方法處理，進(jìn)樣分析，計(jì)算血藥濃度。

② 血藥濃度-時(shí)間：分別在給藥后各時(shí)間點(diǎn)取血，進(jìn)樣測(cè)定后計(jì)算血藥濃度。馬錢子堿溶液組，B-PSG-NPs溶液組以及B-GPSG-NPs溶液組各時(shí)間點(diǎn)的馬錢子的血藥濃度值繪制三組的平均血藥濃度-時(shí)間曲線，見圖8。

圖8 馬錢子堿溶液組，B-PSG-NPs溶液組，B-GPSG-NPs溶液組中馬錢子堿的血藥濃度-時(shí)間曲線Fig 8 Plasma concentration-time curves of brucine in the brucine group，the B-PSG-NPs group and the B-GPSG-NPs group

由圖8可知，B-GPSG-NPs溶液組與B-PSGNPs溶液組顯著提高馬錢子堿在體內(nèi)的血藥濃度；顯著延長(zhǎng)了馬錢子堿在體內(nèi)的時(shí)間。B-GPSG-NPs經(jīng)GA介導(dǎo)，較未介導(dǎo)的B-PSG-NPs不僅提高了血藥濃度還延長(zhǎng)了作用時(shí)間。

③ 藥動(dòng)學(xué)參數(shù)：通過(guò)運(yùn)用DAS 2.0軟件對(duì)所得進(jìn)行血藥濃度-時(shí)間曲線擬合，結(jié)合F檢驗(yàn)，根據(jù)AIC值最小和擬合優(yōu)度最優(yōu)原則，可判定大鼠尾靜脈注射馬錢子堿溶液組、B-GPSG-NPs溶液組以及B-PSG-NPs溶液組后的血藥濃度-時(shí)間曲線均符合權(quán)重因子為1/C2的二室模型，藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見表2。

由表2可知，與馬錢子堿溶液組相比，BGPSG-NPs溶液組和B-PSG-NPs溶液組AUC、tl/2α和t1/2β均顯著增加，CL大大降低。B-GPSGNPs溶液組中藥物的tl/2α、t1/2β分別是馬錢子堿溶液組中藥物的3.11、2.18倍，AUC值是溶液組中藥物的3.7倍，血漿清除率是溶液組的0.31倍。B-PSG-NPs溶液組中藥物的tl/2α、t1/2β分別是馬錢子堿溶液組中藥物的1.5、1.7倍，AUC值是溶液組中藥物的3.2倍，血漿清除率是溶液組的0.36倍。

B-GPSG-NPs溶液組和B-PSG-NPs溶液組均改變了馬錢子堿的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，B-GPSG-NPs溶液組效果更好，藥物在大鼠體內(nèi)的半衰期和體內(nèi)滯留時(shí)間更長(zhǎng)，更有助于提高藥物的生物利用度，發(fā)揮長(zhǎng)效作用。

3 小結(jié)

GA介導(dǎo)的馬錢子堿自組裝納米粒的體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究結(jié)果表明，B-GPSG-NPs溶液組、B-PSG-NPs溶液組與馬錢子堿原料藥組相比，馬錢子堿溶液組在180 h，基本已代謝完全，而B-PSG-NPs溶液組以及B-GPSG-NPs溶液組藥物在體內(nèi)的作用時(shí)間延長(zhǎng)，分別為420 h和600 h，達(dá)到長(zhǎng)效緩釋的效果，但B-GPSG-NPs溶液組更為長(zhǎng)效，原因可能是GPSG載體有效地保護(hù)了藥物，避免被酶類分解，有助于藥物生物利用度的提高，從而達(dá)到長(zhǎng)效的作用；也有可能是GA水解后可生成18β-甘草次酸（β-GA），具有較大的位阻效應(yīng)，對(duì)代謝具有一定影響，從而使其半衰期延長(zhǎng)[8]。綜上，若進(jìn)一步優(yōu)化及研究，GA介導(dǎo)的馬錢子堿自組裝納米粒將有成為臨床抗腫瘤治療新劑型的潛力，對(duì)臨床治療有巨大的研究意義。