陳馨，劉霞霞，王文君，王萌，程卉*（1.安徽中醫(yī)藥大學藥學院，合肥 230012；2.安徽中醫(yī)藥大學科研技術(shù)中心，合肥 230038）

惡性黑色素瘤是由黑色素細胞惡性轉(zhuǎn)化后形成的惡性腫瘤，其發(fā)病位置大多集中在皮膚表面，但有時也會在黏膜組織如眼脈絡(luò)膜等其他身體部位發(fā)現(xiàn)[1]。黑色素瘤的發(fā)展是一個動態(tài)的過程，容易發(fā)生轉(zhuǎn)移形成血管瘤，具有高侵襲性，是皮膚病變中病死率最高的一種疾病，目前其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈上升趨勢[2-5]。目前研究發(fā)現(xiàn)與鐵死亡相關(guān)的細胞死亡途徑對于黑色素瘤的調(diào)節(jié)具有關(guān)鍵作用，與未處理的細胞相比，鐵死亡抑制劑預處理細胞后會導致黑色素瘤細胞發(fā)生更多轉(zhuǎn)移[6]。這表明新的黑色素瘤的治療方法的開發(fā)可以從參與鐵死亡調(diào)節(jié)的靶點入手。

鐵死亡是最近發(fā)現(xiàn)的一種調(diào)控細胞死亡形式。其形態(tài)學特征是存在比正常線粒體更小的線粒體，線粒體膜密度濃縮，線粒體嵴減少或消失，外線粒體膜破裂。而影響鐵死亡的因素有亞鐵、活性氧（ROS）和谷胱甘肽過氧化物酶 4（GPX4）[7]。在形態(tài)學、生化和遺傳水平上，鐵死亡與其他調(diào)控細胞死亡的形式不同。研究表明，人類和動物的多種生理條件和病理應激均可引發(fā)鐵死亡[8]。

重樓為合科植物云南重樓ParispolyphyllaSmithvar.Yunnanensis（Franch.）Hand.-Mazz .或七葉一枝花Paris polyphylla Smithvar.chinensis（Franch.）Hara 的干燥根莖[9]，是一種常用中藥，至今有兩千多年的用藥歷史，性苦，微寒，具有清熱解毒、消腫止痛、涼肝定驚的功效。其化學成分主要有甾體皂苷類、胡蘿卜苷、氨基酸類的有效成分等，其中重樓皂苷Ⅱ是重樓主要有效成分之一。據(jù)報道，重樓皂苷Ⅱ在肺癌、膀胱癌、卵巢癌、黑色素瘤等癌癥中均表現(xiàn)出較好的抗腫瘤特性[10-14]。本實驗旨在研究重樓皂苷Ⅱ抑制黑色素瘤的增殖，并探討其抑制黑色素瘤B16F10細胞增殖是否通過誘導腫瘤細胞鐵死亡來介導。

1 材料

1.1 細胞株

黑色素瘤細胞 B16F10（中國科學院細胞庫）。

1.2 試藥

重樓皂苷Ⅱ（純度91.4%，中國食品藥品檢定研究院）。胎牛血清（上海逍鵬生物科技有限公司）；Roswell Park Memorial Institute-1640（RPMI-1640）培養(yǎng)基（武漢塞維爾生物科技有限公司）；青霉素-鏈霉素溶液、ROS試劑盒、BCA蛋白濃度試劑盒、一抗稀釋液（碧云天生物技術(shù)有限公司）；丙二醛（MDA）試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒、谷胱甘肽（GSH）試劑盒、Fe 試劑盒（南京建成生物工程研究所）；β-肌動蛋白（β-actin，成都正能生物技術(shù)有限責任公司）；谷胱甘肽過氧化物酶 4（GPX4，美國 Cell Signaling Technology公司）；溶質(zhì)載體家族7成員11（SLC7A11）重組蛋白、重組人鐵蛋白重鏈1（FTH-1）（江蘇親科生物研究中心有限公司）；?；o酶A合成酶長鏈家族成員4（ACSL4）重組蛋白（美國 abcam 公司）；腫瘤蛋白53（P53）、山羊抗兔的 IgG-HRP 標記（成都正能生物技術(shù)有限責任公司）；ECL化學發(fā)光底物試劑盒（北京biosharp公司）。

1.3 儀器

CO2培養(yǎng)箱（美墨爾特貿(mào)易有限公司）；全波段多功能酶標儀iD3（美國 MD 公司）；流式細胞儀FC500（美國 BECKMAN 公司）；凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）；透射電子顯微鏡HITACHI-600（日本日立公司）。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)

細胞在含10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并且置于37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每日更換培養(yǎng)基，取對數(shù)生長細胞，用于后續(xù)實驗。

2.2 MTT法檢測細胞活力

將黑色素瘤細胞B16F10以每孔5×103個細胞的密度接種于96孔板，待細胞匯合度達到70%～80%后分別用0、1、2、4、8、16、32 μmol·L-1的重樓皂苷Ⅱ處理后培養(yǎng)24 h和48 h，采用MTT法檢測細胞存活率，在每孔中加入MTT（終質(zhì)量濃度為0.5 mg·mL-1）后將細胞放置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育4 h。吸棄舊培養(yǎng)基后加入二甲基亞砜溶解細胞中的甲瓚，并在搖床上震搖10 min。最后，在570 nm處檢測OD值。

2.3 透射電鏡（TEM）觀察線粒體結(jié)構(gòu)

取對數(shù)生長期的B16F10細胞，將細胞以2×106個·mL-1的密度接種于100 mm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，待細胞匯合度達到70%～80%后，分別用0、2 μmol·L-1的重樓皂苷Ⅱ處理后培養(yǎng)24 h后，收集細胞，離心去上清液（4500 r·min-1，10 min）；用電鏡固定液（2.5%戊二醛）于4℃固定 24 h，四氧化鋨固定細胞25 min 以上，然后不同濃度的乙醇溶液將細胞團塊梯度脫水并包埋于環(huán)氧樹脂中，使用電鏡專用切片機制成電鏡切片；醋酸雙氧鈾染色后再用醋酸鉛染色，于透射電子顯微鏡下觀察細胞并攝片。

2.4 流式細胞儀檢測ROS含量

取對數(shù)生長期的B16F10細胞，將細胞以2×105個·mL-1的密度接種于6孔板，待細胞匯合度達到70%～80%后，分別用0、1、2、4 μmol·L-1的重樓皂苷Ⅱ處理后培養(yǎng)24 h。棄去舊培養(yǎng)基，加入用無血清培養(yǎng)液稀釋的 DCFHDA 探針，于37℃細胞培養(yǎng)箱中孵育 20 min后消化收集細胞于流式細胞儀上機檢測。實驗數(shù)據(jù)通過FlowJo_V10 軟件進行分析。

2.5 MDA含量的檢測

取對數(shù)生長期的B16F10細胞，將細胞以2×105個·mL-1的密度接種于6孔板，待細胞匯合度達到70%～80%后，分別用0、1、2、4 μmol·L-1的重樓皂苷Ⅱ處理后培養(yǎng)24 h。在冰上消化收集細胞，超聲破碎細胞后，根據(jù)MDA試劑盒說明書進行操作。每組設(shè)3個復孔，使用酶標儀在 532 nm 處測量吸光度A。

2.6 SOD含量的檢測

取對數(shù)生長期的B16F10細胞，將細胞以2×105個·mL-1的密度接種于6孔板，待細胞匯合度達到70%～80%后，分別用0、1、2、4 μmol·L-1的重樓皂苷Ⅱ處理后培養(yǎng)24 h。在冰上消化收集細胞，超聲破碎細胞后，根據(jù) SOD試劑盒說明書進行操作。每組設(shè)3個復孔，使用酶標儀在 450 nm 處測量吸光度A。

2.7 GSH含量的檢測

取對數(shù)生長期的B16F10細胞，將細胞以2×105個·mL-1的密度接種于6孔板，待細胞匯合度達到70%～80%后，分別用0、1、2、4 μmol·L-1的重樓皂苷Ⅱ處理后培養(yǎng)24 h。在冰上消化收集細胞，超聲破碎細胞后離心取上清液（3500 r·min-1，10 min），根據(jù) GSH 試劑盒說明書進行操作。每組設(shè)3個復孔，使用酶標儀在405 nm 處測量OD值。

2.8 Fe含量的檢測

取對數(shù)生長期的B16F10細胞，將細胞以2×105個·mL-1的密度接種于6孔板，待細胞匯合度達到70%～80%后，分別用0、1、2、4 mol·L-1的重樓皂苷Ⅱ處理后培養(yǎng)24 h。在冰上消化收集細胞，超聲破碎細胞后離心取上清液（2500 r·min-1，10 min），根據(jù) Fe 試劑盒說明書進行操作。每組設(shè)3個復孔，使用酶標儀在520 nm 處測量吸光度A。

2.9 Western blot檢測相關(guān)蛋白表達

取對數(shù)生長期的B16F10細胞，將細胞以2×106個·mL-1的密度接種于100 mm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，待細胞匯合度達到70%～80%后，用0、1、2、4 μmol·L-1的重樓皂苷Ⅱ處理后培養(yǎng)24 h。在冰上消化收集細胞，用含有磷酸酶抑制劑的蛋白裂解液超聲提取蛋白。采用BCA蛋白測定法測定蛋白含量。加入10% SDS-PAGE處理蛋白質(zhì)，加熱變性后，得到蛋白質(zhì)樣品。根據(jù)蛋白質(zhì)的分子量的不同使用特定的電壓來分離蛋白質(zhì)，分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝化纖維素濾膜上，在5%的脫脂牛奶中封膜，然后一抗4℃孵育過夜。主要抗體及稀釋比：β-actin（1∶1000）；GPX4（1∶1000）；SLC7A11（1∶1000）；FTH-1（1∶1000）；P53（1∶1000）；ACSL4（1∶1000）。最后，用含有1%Tween-20的Tris緩沖鹽溶液沖洗3遍膜，在二抗（1∶10 000）中室溫孵育2 h。使用ECL試劑盒顯色在凝膠分析系統(tǒng)進行檢測，使用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值，計算目的蛋白相對表達量。

2.10 統(tǒng)計學分析

所有數(shù)據(jù)均采用GraphPad Prism 7軟件進行處理，數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用配對t檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 重樓皂苷Ⅱ?qū)谏亓鯞16F10細胞的抑制作用

MTT結(jié)果表明，與空白組比較，B16F10細胞存活率隨著重樓皂苷Ⅱ作用劑量的增大和時間的延長而降低（P＜0.01，見圖1）。重樓皂苷Ⅱ作用于黑色素瘤細胞B16F10 24 h和48 h后的IC50值分別為（1.568±0.219）、（1.293±0.199）μmol·L-1，綜合考慮以1、2、4 μmol·L-1為后續(xù)實驗重樓皂苷Ⅱ的低、中、高劑量。

圖1 重樓皂苷Ⅱ?qū)16F10細胞活力的影響Fig 1 Effect of polyphyllinⅡ on the viability of B16F10 cells

3.2 重樓皂苷Ⅱ?qū)谏亓鯞16F10細胞中線粒體結(jié)構(gòu)的影響

透射電鏡觀察B16F10 細胞線粒體的形態(tài)和微觀結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，空白組細胞的細胞核形態(tài)完整，細胞核膜明顯，線粒體結(jié)構(gòu)清晰；重樓皂苷Ⅱ（2 μmol·L-1）作用細胞后，細胞核形態(tài)不完整，細胞核的核膜破裂，線粒體明顯皺縮變小，線粒體的膜密度明顯增加（見圖2），這些都是細胞發(fā)生鐵死亡的重要特征。

圖2 透射電鏡下B16F10細胞線粒體的結(jié)構(gòu)（×4000）Fig 2 Structure of mitochondria in B16F10 cells observed under transmission electron microscope（×4000）

3.3 重樓皂苷Ⅱ?qū)谏亓鯞16F10細胞ROS的影響

結(jié)果顯示，ROS隨著重樓皂苷Ⅱ給藥濃度的增加在B16F10細胞中不斷積累，與空白組相比，ROS的含量顯著上升，且具有劑量依賴性（見圖3）。

圖3 重樓皂苷Ⅱ?qū)16F10細胞ROS含量的影響Fig 3 Effect of polyphyllinⅡ on the ROS content of B16F10 cells

3.4 重樓皂苷Ⅱ?qū)谏亓鯞16F10細胞MDA、SOD、GSH和Fe含量的影響

結(jié)果顯示MDA和Fe的含量隨著重樓皂苷Ⅱ給藥濃度的增大而升高，與空白組比較，中、高劑量組差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，P＜0.01）；SOD和GSH的含量隨著重樓皂苷Ⅱ給藥濃度的增大而顯著降低，與空白組比較，中、高劑量組差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，P＜0.01）（見圖4）。

圖4 重樓皂苷Ⅱ?qū)16F10細胞中MDA、SOD、GSH和Fe含量的影響Fig 4 Effect of polyphyllinⅡ on the content of MDA，SOD，GSH and Fe in B16F10 cells

3.5 重樓皂苷Ⅱ?qū)谏亓鯞16F10細胞鐵死亡相關(guān)蛋白的影響

與空白組比較，鐵死亡標志性蛋白GPX4、FTH-1、SLC7A11在重樓皂苷Ⅱ作用于B16F10細胞后的表達水平呈下降趨勢（P＜0.05，P＜0.01），且呈現(xiàn)劑量依賴性；而P53和ACSL4在中、高劑量重樓皂苷Ⅱ作用于B16F10細胞后的表達水平呈上升趨勢（P＜0.01）（見圖5）。

圖5 重樓皂苷Ⅱ?qū)16F10細胞中鐵死亡相關(guān)蛋白表達的影響Fig 5 Effect of polyphyllinⅡ on the expression of ferroptosis-related proteins in B16F10 cells

4 討論

黑色素瘤是一種來源于皮膚表皮層中黑色素細胞的皮膚惡性腫瘤[15]，作為一種侵襲性皮膚癌，皮膚惡性黑素瘤導致的相關(guān)死亡在所有皮膚癌中占75%[3]，目前治療黑色素瘤主要以手術(shù)切除為主，輔助放化療和免疫治療，但治療效果有限，亟待開發(fā)新的有效治療手段[16]。鐵死亡是Dixon在2012年首次提出的一種新的細胞死亡方式[17]。研究表明，鐵死亡可能是由人類和動物的多種生理條件和病理應激引起的[18]。目前鐵死亡已經(jīng)逐漸成為消除惡性細胞的關(guān)鍵特征之一，它通過去除環(huán)境中缺乏關(guān)鍵營養(yǎng)素或因感染或環(huán)境應激而受損的細胞，在抑制腫瘤發(fā)生中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[19]。重樓皂苷Ⅱ是中藥重樓的有效成分之一，具有抑制多種腫瘤的作用[20-22]。本實驗通過重樓皂苷Ⅱ作用于黑色素瘤細胞B16F10，從體外研究發(fā)現(xiàn)重樓皂苷Ⅱ可以通過誘導B16F10細胞發(fā)生鐵死亡從而抑制細胞增殖生長。

鐵死亡是一種由GPX4活性喪失和隨后產(chǎn)生的ROS積累引起細胞死亡的調(diào)節(jié)形式，主要依賴鐵和ROS的調(diào)控[23]。SOD和GSH是維持細胞內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)的重要核心組成部分，任何使GSH和SOD減少的因素都會引起細胞內(nèi) ROS 水平的升高。MDA可能由于脂質(zhì)氧化而受到大量自由基的影響而增加，是一種脂質(zhì)過氧化的標志物，可以直接反映細胞氧化應激水平[24]。此外，鐵作為一種催化劑，將過氧化物轉(zhuǎn)化為自由基，發(fā)生芬頓反應，這可能是鐵死亡誘導細胞死亡發(fā)生所起到的作用[23]。重樓皂苷Ⅱ可以在B16F10細胞內(nèi)增加MDA 含量，降低SOD和GSH的含量從而引起的大量ROS積累。表明重樓皂苷Ⅱ可以引起B(yǎng)16F10細胞中ROS和鐵的積累從而誘導細胞發(fā)生鐵死亡。

抑癌蛋白P53可以引起腫瘤細胞的細胞周期阻滯、衰老、凋亡等，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要的作用。P53還可調(diào)節(jié)大量不同的細胞功能，如代謝調(diào)節(jié)、ROS應激反應和鐵死亡，這些新出現(xiàn)的功能在P53介導的腫瘤抑制中發(fā)揮關(guān)鍵作用[25]。P53由于其可以誘導腫瘤細胞發(fā)生鐵死亡，所以仍然發(fā)揮抑制腫瘤增殖的能力[19]。研究表明SLC7A11基因是P53介導的轉(zhuǎn)錄抑制的一個靶點[26]，SLC7A11是胱氨酸/谷氨酸逆向轉(zhuǎn)運體的一個組成部分，通過介導胱氨酸轉(zhuǎn)運促進GSH的合成，而GSH是主要的細胞抗氧化劑，可以抑制ROS的累積，對ROS誘導的鐵死亡至關(guān)重要[7]。P53的激活可以抑制SLC7A11的轉(zhuǎn)錄，進而減少了胱氨酸的攝取，這反過來又限制了細胞內(nèi) GSH的產(chǎn)生。因此，ROS誘導的鐵死亡在P53激活的細胞中明顯增加[27]。實驗結(jié)果表明重樓皂苷Ⅱ可以通過促進P53 的表達、抑制SLC7A11 的表達，從而促進細胞鐵死亡的發(fā)生。

GPX4可以作為判斷細胞鐵死亡的指標之一，GPX4將GSH轉(zhuǎn)化為氧化型谷胱甘肽（GSSG），同時將脂質(zhì)氫過氧化物轉(zhuǎn)化為相應的醇或游離過氧化氫轉(zhuǎn)化為水[7]。FTH-1是鐵蛋白重鏈1，在鐵蛋白結(jié)構(gòu)中起到關(guān)鍵作用，也是鐵死亡發(fā)生的標志性蛋白。ACSL4可以通過參與易被氧化的膜磷脂合成過程而成為鐵死亡發(fā)生的必需分子[28]。GPX4、FTH-1蛋白的表達隨著重樓皂苷Ⅱ的濃度的增加而下降，而ACSL4蛋白的表達呈現(xiàn)上升趨勢。這些重要蛋白分子表達水平的變化顯示重樓皂苷Ⅱ?qū)16F10細胞的抑制作用可能與鐵死亡相關(guān)。

綜上所述，本研究初步證明了鐵死亡是重樓皂苷Ⅱ誘導黑色素細胞B16F10細胞發(fā)生死亡的重要途徑，但是發(fā)生鐵死亡的具體機制還有待進一步實驗研究驗證。