楊 浩, 吳潤(rùn)生, 張永輝, 郭仕平, 夏 春, 雷 曉, 劉 雷, 劉雅潔, 曾淑華

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，成都 611130；2.四川省煙草公司瀘州市公司，四川 瀘州 646000；3.四川省煙草專賣局，成都 610041)

【研究意義】烤煙是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，在國(guó)民經(jīng)濟(jì)中占有重要地位,其中烤煙上部葉占單株煙葉的1/3，約占總產(chǎn)量的40%，品質(zhì)僅次于中部葉[1-2]。目前國(guó)內(nèi)上部煙葉普遍存在烤后煙葉青筋、浮青煙多、煙堿偏高、刺激性強(qiáng)、煙葉品質(zhì)差等問題[3-4]。研究表明，上部6片葉的一次性采收可提升上部葉烤后質(zhì)量和經(jīng)濟(jì)性狀[5-6]。然而在烤煙上部葉的一次性采烤過程中，葉片間成熟差異大，導(dǎo)致烤后煙葉質(zhì)量下降，出現(xiàn)烤后顏色不均勻、厚薄差異大等問題[7-14]。因此，改善上部6片煙葉同步成熟成為亟待解決的問題。【前人研究進(jìn)展】目前，關(guān)于促進(jìn)烤煙上部葉同步成熟方面的研究鮮有報(bào)道，但關(guān)于使用乙烯利、赤霉素、鉀肥等來延緩上部從上往下第4～6片煙葉衰老或促進(jìn)上部從上往下第1～3片煙葉成熟已有較多報(bào)道。任志廣等[15]研究表明赤霉素和鉀肥互作可促進(jìn)上部煙葉開片，SOD、POD活性顯著高于CK，兩者互作有效增強(qiáng)上部葉的抗衰老能力。周穎[16]研究認(rèn)為，外施赤霉素、硝普鈉、油菜素內(nèi)酯、亞精胺處理的煙葉葉綠素含量、SPAD值、細(xì)胞膜穩(wěn)定性明顯高于對(duì)照，可有效提高煙葉耐熟性，其中以赤霉素、硝普鈉、油菜素內(nèi)酯處理效果較好。劉華山等[17]指出，噴施生長(zhǎng)素IAA和赤霉素GA對(duì)打頂后煙葉的煙堿含量具有降低作用。劉中陽(yáng)等[18]研究表明，植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)煙草植株的株高、莖圍、最大葉面積、節(jié)距、根體積、根鮮重、倒二葉葉面積均有促進(jìn)作用，其中以BR和GA3的影響最大。K+作為多種酶(如NAD激酶、ATP合酶等)的激活劑，在一定程度上提高了多種代謝酶的活性，同時(shí)參與誘導(dǎo)植物體內(nèi)生長(zhǎng)促進(jìn)性激素(如生長(zhǎng)素、赤霉素)的生物合成及其活性調(diào)控[19]，其中硝酸鉀價(jià)格低廉，適合在烤煙栽培中推廣應(yīng)用。溫心怡等[20]研究指出，外施鉀肥可以促進(jìn)煙草生成長(zhǎng)發(fā)育，提高光和效率和抗逆性，從而提高耐熟性。【本研究切入點(diǎn)】以烤煙中川208為試驗(yàn)研究對(duì)象，通過對(duì)煙株頂部從上往下的第4～6(T下)片葉合理配施赤霉素和硝酸鉀，延緩其衰老，提高耐熟性，達(dá)到調(diào)控與煙株從上往下第1～3(T上)片煙葉成熟一致的目的?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究通過赤霉素和硝酸鉀調(diào)控上部煙葉生長(zhǎng)，達(dá)到一致成熟，為上部葉一次性采烤和提高上部煙葉質(zhì)量提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地點(diǎn)及材料

試驗(yàn)于2019—2020年在瀘州市古藺縣大寨苗族鄉(xiāng)進(jìn)行，平均海拔 1021 m，屬亞熱帶高原氣候區(qū)；年平均氣溫15.9 ℃，無霜期在260 d以上，適宜作物生長(zhǎng)。試驗(yàn)地為沙壤土，基礎(chǔ)理化性質(zhì)：pH 5.03，有機(jī)質(zhì)含量41.67 g/kg，全氮含量0.8 g/kg，堿解氮含量129.97 mg/kg，全磷含量0.97 g/kg，有效磷含量12.73 mg/kg，全鉀含量16.77 g/kg，速效鉀含量96.18 mg/kg。

供試烤煙品種為中川208，試驗(yàn)使用的硝酸鉀由河北百禾豐化肥有限公司生產(chǎn)，赤霉素由北京索拉博科技有限公司生產(chǎn)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)設(shè)計(jì)3個(gè)因素，每個(gè)因素3個(gè)水平，因素X1：赤霉素(0、15、30 μmol/L)，因素X2：硝酸鉀(0、0.5、1.0 g/L)，因素X3：噴施時(shí)間(打頂后 20、25、30 d)。利用軟件Design Expert 8.0.6中的 Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)法，對(duì)各試驗(yàn)因素及水平進(jìn)行編碼設(shè)計(jì)，得到 16 個(gè)水平組合，如表 1～2所示。

表1 試驗(yàn)因素與水平編碼

將打頂后煙株頂部從上往下第1～3片葉記為T上葉，從上往下第4～6片葉記做T下葉。在打頂后20、25、30 d，對(duì)T下部位煙葉進(jìn)行噴施處理，采用雙面混合噴施法，單株噴施量為50 mL。噴施時(shí)間為9:00之前或17:00之后，噴施后12 h內(nèi)遭遇下雨，重新噴施。試驗(yàn)地施用純N、P2O5、K2O分別為132.15、217.50、402.00 kg/hm2，其他田間管理按照當(dāng)?shù)爻Ｒ?guī)措施進(jìn)行。

表2 Box-Behnken方案設(shè)計(jì)及因素水平組合

1.3 樣品采集

鮮樣采集：噴施處理過后的第14 天，各小區(qū)選取5株具有代表性的煙株，對(duì)T上和T下葉片進(jìn)行采摘，一部分煙葉剔除主脈和支脈，稱重后立即放入液氮罐中暫時(shí)保存，之后放在-80 ℃超低溫冰箱保存，用于測(cè)試葉綠素、脯氨酸、SOD、丙二醛、可溶性蛋白含量；另一部分煙葉在115 ℃下殺青30 min，然后在85 ℃下烘干至恒重，測(cè)定淀粉含量。

初烤煙葉采集：噴施處理后14 d對(duì)各小區(qū)煙株的T上與T下煙葉進(jìn)行一次性采收，按照瀘州當(dāng)?shù)貎?yōu)質(zhì)烤煙烘烤加工步驟進(jìn)行烘烤，之后每個(gè)處理選取烤后煙葉3 kg，進(jìn)行外觀質(zhì)量評(píng)價(jià)和化學(xué)成分測(cè)定。

1.4 鮮煙葉SPAD、生理指標(biāo)測(cè)定

使用SPAD-520 Plus分別測(cè)量每個(gè)處理打頂后14 d的 T上與T下部位煙葉葉基、中、尖3個(gè)部位的SPAD值，最后計(jì)算所得平均值即為該片煙葉SPAD值。

葉綠素含量測(cè)定利用乙醇—丙酮混合浸提法[21]；丙二醛含量測(cè)定采用硫代巴比妥酸法[21]；脯氨酸含量測(cè)定采用酸性茚三酮比色法[21]；超氧化物歧化酶活性測(cè)定根據(jù)黃嘌呤氧化酶法(羥胺法)，采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒進(jìn)行測(cè)定；可溶性蛋白含量測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)G-250法[21]；淀粉含量測(cè)定采用碘顯色法[22]。

1.5 鮮煙葉同步成熟狀態(tài)評(píng)價(jià)方法

同步成熟的量化以每個(gè)處理鮮煙葉SPAD值、葉綠素、淀粉、脯氨酸、丙二醛、SOD酶活力、可溶性蛋白的|T上-T下|總和(同步成熟值)來衡量。

1.6 烤后煙葉質(zhì)量評(píng)價(jià)

煙葉外觀質(zhì)量評(píng)價(jià)按照GB/T18771.4—2015標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行；煙葉常規(guī)化學(xué)成分測(cè)定參照王瑞新等[23]的方法?？竞鬅熑~綜合評(píng)價(jià)得分為：烤后煙葉綜合得分=外觀質(zhì)量評(píng)價(jià)得分×0.375+化學(xué)成分評(píng)價(jià)得分×0.625。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析方法

利用軟件Excel 2010對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理分析；使用SPSS 25.0對(duì)顏色指標(biāo)和生理指標(biāo)進(jìn)行方差分析，使用軟件Design-Expert 8.0.6對(duì)因素水平進(jìn)行編碼設(shè)計(jì)和響應(yīng)曲面分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 噴施赤霉素和硝酸鉀對(duì)上部煙葉同步成熟的影響

由表3可知，處理T2(0.16)、T9(0.16)、T16(0.17)、T5(0.31)的同步成熟值最小，最有利于實(shí)現(xiàn)上部葉的同步成熟，對(duì)照T4(4.01)的同步成熟值最大，上部葉片之間的成熟狀態(tài)最差，原因是噴施赤霉素和硝酸鉀后，鉀素和氮素對(duì)T2、T5、T9、T16的T下部葉的碳代謝具有促進(jìn)作用，延緩了成熟衰老，使葉綠素含量、脯氨酸含量、SOD酶活力等上升，故而達(dá)到與T上部位煙葉成熟狀態(tài)一致。此外，處理T6的同步成熟值與對(duì)照相比較小，說明打頂后20 d噴施15 μmol/L赤霉素和1.0 g/L硝酸鉀對(duì)同步成熟也有促進(jìn)作用。

表3 各處理煙葉生理指標(biāo)的同步成熟值

2.2 不同噴施處理對(duì)烤后煙葉質(zhì)量影響

2.2.1 不同噴施處理對(duì)烤后煙葉外觀質(zhì)量比較分析 由表4可知，4個(gè)處理T2、T5、T9、T16(打頂后25 d噴施15 μmol/L赤霉素和0.5 g/L硝酸鉀)的顏色、成熟度、身份等各項(xiàng)外觀質(zhì)量指標(biāo)得分較高，其總分分別為79.5、80.2、80.0、79.3，平均為79.8，說明其烤后煙葉顏色、成熟度、身份、油分等外觀質(zhì)量較好。對(duì)照T4總分最低(63.0)，外觀質(zhì)量最差。從赤霉素來看，T3、T7、T8、T11(噴施赤霉素濃度為30 μmol/L)的外觀質(zhì)量平均得分77.7，相較于處理T2、T5、T9、T16(噴施15 μmol/L赤霉素)得分較低；沒有噴施赤霉素的T4、T12、T13、T15外觀質(zhì)量平均得分67.5，相較于T2、T5、T9、T16明顯降低；T1、T6、T10、T14(噴施15 μmol/L的赤霉素)的平均得分72.4相對(duì)偏低。噴施硝酸鉀濃度為1 g/L的T6、T7、T12、T14，未噴施硝酸鉀的T1、T8、T10和噴施濃度為0.5 g/L的T3、T11、T13、T15平均得分分別為75.9、71.0和72.7，相較于T2、T5、T9、T16，得分均有所下降。硝酸鉀、赤霉素均有促進(jìn)煙葉細(xì)胞分裂生長(zhǎng)，加速碳氮代謝的作用，濃度過高時(shí)則不利于煙株生長(zhǎng)。因此，只有適宜的噴施濃度配合適宜的噴施時(shí)間，才能促進(jìn)煙株發(fā)育，提高外觀質(zhì)量。

表4 不同噴施處理煙葉外觀質(zhì)量得分

2.2.2 不同噴施處理對(duì)烤后煙葉化學(xué)成分比較分析 由表5可知，T2(80.4)、T5(81.7)、T9(80.9)、T16(80.7)處理得分最高，平均分為80.9，對(duì)照T4得分最低(66.6)。噴施赤霉素濃度為30 μmol/L 的T3、T7、T8、T11和未噴施赤霉素的T12、T13、T15的化學(xué)成分平均得分分別為76.9和72.3，相較于T2、T5、T9、T16，其得分較低，原因是噴施赤霉素濃度不適宜，導(dǎo)致烤后煙葉全氮、煙堿、淀粉等偏高或偏低，協(xié)調(diào)性差；T1、T6、T10、T14(噴施15 μmol/L的赤霉素)的平均得分相對(duì)較低(74.9)，原因是硝酸鉀濃度過高或過低和噴施時(shí)間不適。噴施硝酸鉀濃度為1 g/L的T6、T7、T12、T14和未噴施硝酸鉀的T1、T8、T10平均得分分別為78.4和74.3，相比T2、T5、T9、T16，其得分降低，原因是硝酸鉀濃度和噴施時(shí)間不適；處理T3、T11、T13、T15(噴施0.5 g/L的硝酸鉀)的平均得分相對(duì)較低(71.79)，原因是赤霉素濃度過高或未噴施赤霉素，導(dǎo)致烤后煙葉化學(xué)成分總體得分偏低。

表5 不同噴施處理烤后煙葉化學(xué)成分得分

2.3 硝酸鉀、赤霉素噴施濃度及噴施時(shí)間三因素回歸分析

2.3.1 綜合得分(Y)回歸模型的建立 將2.2的烤后煙葉外觀質(zhì)量、化學(xué)成分的總分按1.6中的公式進(jìn)行賦權(quán)得到烤后煙葉綜合得分(表6)，以綜合得分(Y)為響應(yīng)值，分別對(duì)各因素自變量(X1-赤霉素、X2-硝酸鉀、X3-噴施時(shí)間)進(jìn)行二元線性回歸分析，建立二次回歸模型方程：

表6 賦權(quán)后烤后煙葉綜合得分

(1)

對(duì)二次方程進(jìn)行逐步回歸，剔除不顯著項(xiàng)，將式(1)優(yōu)化為(2)。依據(jù)回歸方程的一次項(xiàng)系數(shù)X1(赤霉素)為3.71，X2(硝酸鉀)為3.11，X3(噴施時(shí)間)為-2.99，影響作用排序?yàn)槌嗝顾?硝酸鉀>噴施時(shí)間。

(2)

表7 方差分析

圖1 烤后煙葉綜合得分試驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值對(duì)比

2.3.2 各因素對(duì)烤后煙葉綜合得分影響關(guān)系分析 由圖2可以看出，X1(赤霉素)、X2(硝酸鉀)的影響曲線相互靠攏，說明XI、X2對(duì)烤后煙葉綜合得分影響作用相似，而X3(噴施時(shí)間)的影響曲線偏離X1、X2。此外，可以看出X1、X2兩個(gè)因素對(duì)綜合得分的影響極為相似，都是先增加后降低，而噴施時(shí)間則是先小幅度增加后下降。

圖2 各因素對(duì)烤后煙葉綜合得分的影響曲線

2.3.3 響應(yīng)面結(jié)果分析 由圖3可以看出，當(dāng)赤霉素噴施濃度21 μmol/L、硝酸鉀濃度0.6 g/L、噴施時(shí)間約24 d時(shí)，烤后煙葉綜合得分最高。當(dāng)赤霉素濃度由0 μmol/L逐漸增加到21 μmol/L，硝酸鉀濃度由0 g/L逐漸增加到0.8 g/L，噴施時(shí)間從打頂后20 d增加到25 d時(shí)，烤后煙葉綜合得分逐漸增加，而后得分降低，原因可能是由于噴施濃度過高導(dǎo)致煙株生長(zhǎng)受抑，出現(xiàn)生理干旱所致。

圖3 各因素對(duì)烤后煙葉綜合得分的交互影響

2.3.4 因素水平優(yōu)化 基于建立的回歸模型(1)和響應(yīng)曲面圖3對(duì)三因素三水平進(jìn)行優(yōu)化。為了獲得較高的烤后煙葉綜合得分，在本文因素水平范圍內(nèi)，使用Design-Expert的Numerical部分，以烤后煙葉綜合得分(Y)最大為條件，優(yōu)化得到幾組滿意度最高的因素水平組合，并抽取部分組合進(jìn)行第2年驗(yàn)證。由表8可以看出，各組綜合得分預(yù)測(cè)值與真實(shí)值接近。因此，在赤霉素噴施濃度為(21±1)μmol/L、硝酸鉀為(0.5±0.1)g/L、噴施時(shí)間為(24±1)d時(shí)，烤后煙葉綜合得分最高。

3 討 論

煙葉的生理特性是指煙葉在生長(zhǎng)發(fā)育過程中內(nèi)部各種生理生化成分的變化特性，通過分析這些成分的變化特點(diǎn)，可以判定出煙葉生長(zhǎng)和成熟的狀態(tài)。本研究發(fā)現(xiàn)，相比較于對(duì)照，打頂后25 d噴施15 μmol/L赤霉素和0.5 g/L硝酸鉀處理后的T下部位煙葉葉綠素、脯氨酸含量增加，顏色加深，同時(shí)SOD酶活力上升，說明內(nèi)含物質(zhì)增多，煙葉衰老程度減弱，這與已有研究結(jié)論一致[15,24]。原因是赤霉素能夠促進(jìn)煙株節(jié)間伸長(zhǎng)和生長(zhǎng)、細(xì)胞分裂分化和伸長(zhǎng)等，也能抑制IAA氧化酶活性[25]，進(jìn)而使得赤霉素能夠達(dá)到延緩衰老作用。同時(shí)，氮素、鉀素是煙葉質(zhì)量良好的保證，可以提高煙草的根系活力，增強(qiáng)煙葉對(duì)地下養(yǎng)分的吸收和運(yùn)輸效率[26]，促進(jìn)葉片生長(zhǎng)，因而能延緩T下部位煙葉的衰老，達(dá)到與T上部位煙葉成熟一致。

煙葉外觀質(zhì)量、化學(xué)成分的協(xié)調(diào)性對(duì)煙葉煙氣特征、吸食質(zhì)量具有較大影響，提高外觀質(zhì)量和協(xié)調(diào)化學(xué)成分是提高烤后煙葉質(zhì)量的重要措施[27]。羅定棋等[28]認(rèn)為，打頂抹芽后上部葉噴施赤霉素能有效促進(jìn)煙葉生長(zhǎng)，使葉面積增加，提高煙葉光合強(qiáng)度，促進(jìn)烤煙上部葉片干物質(zhì)積累，葉片結(jié)構(gòu)疏松，烘烤特性提高，顯著提高煙草外觀品質(zhì)，同時(shí)上部煙葉鉀含量增加8.1%，煙堿含量降低10%左右，煙葉的耐烤性和耐熟性增加，提高了煙葉內(nèi)在質(zhì)量。王林等[29]研究表明，赤霉素對(duì)煙葉理化性質(zhì)具有明顯改善作用，能提高鉀水平含量并顯著降低淀粉。許自成等[30]認(rèn)為在煙葉莖斷面涂抹生長(zhǎng)素并追施鉀肥，烤后煙葉煙堿適中，鉀含量上升。李健忠等[31]研究表明，打頂當(dāng)天噴施赤霉素可促進(jìn)煙株后期發(fā)育，一定程度上使煙葉碳氮代謝改變。本研究中，噴施赤霉素和硝酸鉀后，T下部位煙葉色度、成熟度、結(jié)構(gòu)等與T上部位煙葉接近一致，上部葉總體顏色更偏向于橘黃，其中打頂后25 d噴施15 μmol/L赤霉素和0.5 g/L硝酸鉀的煙葉外觀質(zhì)量平均得分明顯高于對(duì)照，有利于烤后煙葉外觀質(zhì)量改善，這與前人研究結(jié)果一致[32-33]。各噴施處理煙葉鉀、可溶性總糖、還原糖呈上升趨勢(shì)，氯離子、淀粉含量相較于對(duì)照有所下降，打頂后25 d噴施15 μmol/L赤霉素和0.5 g/L硝酸鉀的煙葉化學(xué)成分平均得分最高且明顯高于對(duì)照，說明噴施處理后內(nèi)在化學(xué)成分更協(xié)調(diào)，結(jié)論與已有研究一致[34-35]。葉面噴施赤霉素和鉀肥后，上部煙葉葉面積增大，厚度降低，內(nèi)含物質(zhì)淀粉、總氮等轉(zhuǎn)化更為徹底，同時(shí)較高的赤霉素可向根系傳達(dá)停止煙堿合成的信號(hào)，并增強(qiáng)對(duì)其他礦質(zhì)元素的吸收，因而內(nèi)在化學(xué)成分更協(xié)調(diào)。

4 結(jié) 論

噴施赤霉素和硝酸鉀能延緩T下部位煙葉的成熟，各處理同步成熟值明顯小于對(duì)照，烤后煙葉外觀質(zhì)量、化學(xué)成分總分高于對(duì)照，以打頂后25 d噴施15 μmol/L赤霉素和0.5 g/L硝酸鉀(T2、T5、T9、T16)處理的同步成熟狀態(tài)最好，外觀質(zhì)量總分、化學(xué)成分總分最高。響應(yīng)曲面結(jié)果顯示赤霉素、硝酸鉀對(duì)綜合得分具有極顯著影響，且影響曲線相似，噴施時(shí)間同樣具有極顯著性影響。模型驗(yàn)證及優(yōu)化結(jié)果顯示，烤后煙葉綜合得分與預(yù)測(cè)值接近，說明所建模型可靠，可以較好預(yù)測(cè)烤后煙葉綜合得分隨各因素水平的變化規(guī)律。