張 達，李蓮蓮，莫江玲，李 緣，張超超，吳學尉，王麗花

(1.云南大學農(nóng)學院, 昆明 650504; 2.云南省農(nóng)業(yè)科學院花卉研究所, 昆明 650205)

【研究意義】百合是百合科百合屬(Lilium)球根花卉植物，是重要的鮮切花[1]，中國切花生產(chǎn)用百合種球主要依賴進口，每年需向荷蘭進口約3億粒百合種球[2]。中國從20世紀90年代開始研究百合種球國產(chǎn)化，目前已取得一定成果[3]，但在百合種球繁育周期長及采后處理技術(shù)等方面還有進一步研究和進步的空間[4]。通常百合鱗莖需要培育到一定圍徑規(guī)格才能開花，不同類型百合鱗莖培育膨大速率不同[5-8]。鱗莖的膨大及植株發(fā)育受淀粉合成代謝的影響[9-12]，離不開相關酶的調(diào)控，相關酶的活性及表達會影響淀粉的合成與累積[12]。在淀粉生物合成的相關酶中，腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)作為淀粉合成限速酶調(diào)控淀粉生物合成的第一步，其活性及表達量對淀粉的生物合成至關重要[13-16]。因此，對AGPase酶活性及其基因的表達量與淀粉含量的相關性進行研究，探索出的其相關性可作為前期優(yōu)良品種的鑒定及為后續(xù)分子實驗提供理論基礎，有利于促進百合種球國產(chǎn)化?！厩叭搜芯窟M展】在東方百合種球鱗莖中，AGPase酶活性與淀粉積累量表現(xiàn)為正相關[17]。百合AGPase基因RNAi載體構(gòu)建也已有報道[18]。已有使用轉(zhuǎn)錄組測序的方法對蘭州百合籽鱗莖形成發(fā)育過程中不同時期淀粉合成相關酶的基因的研究，結(jié)果表明，與淀粉合成方向相關的酶，如ADPG焦磷酸化酶(AGPase)、可溶性淀粉合成酶(SSS)、淀粉分支酶(SBE)和顆粒結(jié)合型淀粉合成酶(GBSS)在鱗莖形成和膨大期表現(xiàn)為母鱗片中活性減少，小鱗莖中基因表達量增加，而裂解方向的淀粉去分支酶(SDBE)在母鱗片中的基因表達量高于小鱗莖，這說明淀粉合成相關酶與鱗莖的膨大密切相關，并在分子水平上證明了碳水化合物代謝在小鱗莖發(fā)生和發(fā)育中的重要性[19]。針對食用百合蘭州百合的3個淀粉合成相關酶(AGPase、SSS、GBSS)的基因克隆，表達量分析也已見報道，研究結(jié)果表明淀粉合成酶對于百合淀粉積累以及種球膨大發(fā)育具有重要作用[20]?！颈狙芯壳腥朦c】不同種類百合的AGPase表達量與淀粉含量的相關性、不同種類百合的AGPase酶活性與淀粉含量的相關性以及直接針對切花種球的相關研究尚未見報道。【擬解決的關鍵問題】本研究從AGPase的大小亞基基因AGPS及AGPL作為出發(fā)點，克隆并預測其結(jié)構(gòu)與功能，并通過研究其基因表達的模式，測定淀粉酶活性，使用皮爾遜相關性分析最終得出淀粉含量，AGPase酶活性，AGPase亞基基因表達量之間的相關性，從而更好的了解百合中淀粉合成的影響因素，若AGPase基因與淀粉合成及淀粉含量正相關，則可作為篩選高淀粉含量百合種質(zhì)的標記，為早期快速鑒定百合新種質(zhì)提供新途徑，也可為后續(xù)基因編輯等分子實驗提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

本實驗所采取的研究對象為亞洲百合川百合及東方百合‘白佩琪’。本實驗所采取的百合鱗片均采集自云南大學農(nóng)學院溫室。鱗片分為3個發(fā)育階段取樣：花期即第1朵花開后的2 d進行采集；倒苗期即地上莖完全枯萎后的第5天進行采集；出苗期即第2年鱗莖出芽后的第5天進行采集，所有鱗片均采集鱗莖內(nèi)部鱗片。本實驗所采取的葉片為花期的葉片，采集時間為花開后的2 d進行采集。采樣時每個樣品采集3份百合組織作為生物學重復材料。

1.2 樣品的總RNA提取及cDNA合成

使用北京擎科生物科技有限公司的多糖多酚植物總RNA提取試劑盒在液氮冷凍的研缽中進行RNA的提取，提取鱗片時使用100 mg材料；提取葉片時，使用200 mg材料。使用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測核酸純度，使用微量紫外分光光度計測量濃度，提取后的RNA置于-80 ℃冰箱保存。取1000 ng RNA，使用北京擎科生物科技有限公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行基因組DNA的去除以及反轉(zhuǎn)錄。

1.3 基因克隆

以各個組織的混合樣品提取cDNA作為模板，根據(jù)云南大學農(nóng)學院花卉產(chǎn)業(yè)研究中心所測的轉(zhuǎn)錄組Unigene序列，通過Blast的方法在nr/nt數(shù)據(jù)庫比對得到兩類百合的AGPase基因序列信息，設計特異性引物(表1)進行擴增。使用KOD FX酶進行克隆，PCR擴增體系為20 μL。PCR產(chǎn)物使用1.2%瓊脂糖凝膠電泳，將目的片段膠回收后連接于T載體上，再轉(zhuǎn)化于DH5α大腸桿菌感受態(tài)細胞中，涂布于含卡那霉素抗性的LB平板上。培養(yǎng)24 h后進行陽性克隆篩選，將陽性菌液送到北京擎科生物昆明分公司進行測序。將測序所得結(jié)果在NCBI上進行CD-search保守結(jié)構(gòu)域分析，在其保守結(jié)構(gòu)域內(nèi)設計qPCR引物。

1.4 qPCR及分析

使用Primer6軟件(http://www.premierbiosoft.com)進行引物設計。設計的引物由北京擎科生物科技有限公司進行合成(表1)。對克隆得到的AGPase1 個小亞基、2 個大亞基序列進行引物設計，使用設計的引物，使用 Takara TB Green?Premix ExTaqTMII 試劑盒(RR820A)，以EIF為內(nèi)參基因，對所有樣品進行 qPCR。得到的結(jié)果使用2-ΔΔCT的方法計算結(jié)果，數(shù)值使用 GraphPad Prism 8.0.1 進行分析及作圖。

表1 引物序列

1.5 淀粉含量及酶活性的測定

使用索萊寶的淀粉含量檢測試劑盒(BC0700)，對所有材料進行淀粉含量的測定；使用索萊寶的AGP活性檢測試劑盒(BC0430)，對所有材料進行AGPase酶活性的測定，U為酶活單位，定義為每克組織在反應體系中每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol 還原型輔酶Ⅱ(NADPH)定義為一個酶活單位(U)。

1.6 相關性分析

借助R語言，使用R包Hmisc下的rcorr命令進行皮爾遜相關性分析(Pearson correlation analysis)，再使用R包corrplot進行可視化展示。對所有時期鱗片的AGPase基因相對表達量，酶活性及淀粉含量進行相關性分析；葉片由于不是淀粉的貯藏器官，故采用AGPase基因相對表達量，酶活性與同時期的鱗片淀粉含量進行相關性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 AGPase基因克隆

AGPase是由2個小亞基基因和2個大亞基基因組成的異源四聚體，由不同的基因編碼。本次實驗克隆測序后得到AGPase小亞基基因序列1個，命名為AGPS；大亞基基因2個，分別命名為AGPL1及AGPL2，所得保守結(jié)構(gòu)域見圖1。本次克隆到的2類百合各3個基因都具有PLN02241超級家族中的PLN02241家族蛋白結(jié)構(gòu)特征。

A：亞洲百合川百合小亞基基因AGPS；B：亞洲百合川百合大亞基基因AGPL1；C：亞洲百合川百合大亞基基因AGPL2；D：東方百合‘白佩琪’小亞基基因AGPS；E：東方百合‘白佩琪’大亞基基因AGPL1；F：東方百合‘白佩琪’大亞基基因AGPL2。

2.2 AGPase相對表達量

通過對AGPase的3個基因序列在兩類百合不同時期的內(nèi)層鱗片中的表達量分析表明，大亞基基因在不同百合中表達趨勢總體是相似的，但相同的發(fā)育階段，兩類百合的表達量也呈現(xiàn)出一定差異。小亞基基因在東方百合‘白佩琪’中倒苗期表達量最高，另外兩個時期表達量較低，但亞洲百合川百合倒苗期表達量最低，另外兩個時期都高于倒苗期且另外兩個時期表達量差異不大。總體上來看，大亞基基因的表達量要高于小亞基基因(圖2～3)。

bc：出苗期；bh：花期；bd：倒苗期，圖中同一基因不同小寫字母表示有顯著性差異(P<0.05)，下同。

cc：出苗期；ch：花期；cd：倒苗期。

此外，本研究還測定了花期時葉片的3個AGPase亞基基因相對表達量，發(fā)現(xiàn)葉片中的大亞基基因表達量遠低于內(nèi)層鱗片，亞洲百合川百合及東方百合‘白佩琪’的AGPL1在內(nèi)層鱗片中的表達量都約為葉片中的3倍；AGPL2在亞洲百合川百合鱗片中約為葉片的40倍，東方百合‘白佩琪’則約為36倍。但小亞基基因的表達量兩類百合呈現(xiàn)不同的趨勢，亞洲百合川百合小亞基基因的表達量鱗片中約為葉片的一半，而東方百合‘白佩琪’鱗片則是葉片的2倍左右。

2.3 兩類百合的淀粉含量

由圖4可知，不同種類的百合鱗片在發(fā)育過程中的變化趨勢一致，但是東方百合‘白佩琪’僅花期含量比亞洲百合川百合高，其余時期都是亞洲百合川百合淀粉含量更高。同一時期(花期)不同組織的淀粉含量(圖5)表明，葉片的淀粉含量相對鱗片低很多，且在該時期，東方百合‘白佩琪’的葉片及鱗片淀粉含量都高于亞洲百合川百合。

圖5 兩種百合葉片和鱗片在同一時期(花期)的淀粉含量

2.4 兩類百合AGPase酶活性

由圖6可知，不同種類的百合鱗片在發(fā)育過程中的酶活性變化趨勢一致，但是東方百合‘白佩琪’僅倒苗期活性比亞洲百合川百合高，其余時期均是亞洲百合川百合酶活性更高。

圖6 兩類百合不同時期內(nèi)層鱗片中的AGPase酶活性

由圖7可知，葉片的酶活性相對鱗片都很高，且在該時期，東方百合‘白佩琪’的葉片及鱗片的酶活性都高于亞洲百合川百合。

圖7 兩種百合葉片和鱗片在同一時期(花期)的AGPase酶活性

2.5 百合淀粉含量與AGPase酶活性、AGPase基因表達間的相關性分析

2.5.1 百合鱗莖的AGPase基因、酶活性、淀粉含量的相關性 相關性分析(圖8)表明，百合鱗莖的淀粉含量與AGPase酶活性及AGPS基因表達量高度線性正相關，相關系數(shù)分別為0.90及0.71。由此可以得出，酶活性及AGPS表達量都與淀粉含量正相關。

圖中*表示有顯著性差異(P<0.05)，下同。

2.5.2 百合葉片的AGPase基因、酶活性、同時期鱗片淀粉含量的相關性 葉片相關性分析(圖9)表明，葉片中3個AGPase基因之間都高度線性正相關，相關系數(shù)分別為0.96，0.89，0.92，這與鱗片中的3個基因的相關性模式不同，說明這3個基因在葉片中與在鱗片中可能存在不同的協(xié)同表達模式。此外，葉片中AGPase基因表達量與鱗片淀粉含量相關性不顯著。

圖9 葉片3個AGPase基因表達量及酶活性與同時期鱗片淀粉含量間的相關性分析

3 討 論

本次克隆得到的亞洲百合川百合和東方百合‘白佩琪’的3個AGPase基因序列相似度都在95%以上。此外，本次克隆得到的AGPase基因序列均用Blast進行了驗證，結(jié)果表明，所克隆到的基因與前人在蘭州百合中所克隆基因序列相似度在90%以上[19]。由此可見，不同百合中AGPase相同亞基基因相對比較穩(wěn)定保守。

本次所測淀粉含量及酶活性表明，不同類型百合的淀粉含量雖然有差異，但總體差別不大，與蘭州百合及亞洲百合各發(fā)育時期總碳水化合物變化的趨勢大體上也是一致的[21]。新鐵炮百合的研究結(jié)果表示，在開花前植株鱗莖的淀粉積累達到最大值，而后淀粉含量開始下降[13]，然而本實驗均在倒苗期淀粉含量最高，這一點契合孫紅梅等[21]在之前研究中提出的不同種類百合鱗莖發(fā)育過程中淀粉積累及轉(zhuǎn)化的趨勢不完全相同這一結(jié)論。

本次表達量分析中發(fā)現(xiàn)兩類百合小亞基基因AGPS的表達量相較于大亞基基因AGPL1和AGPL2更低，這與蘭州百合的小鱗莖發(fā)過程中這3個基因的表達量結(jié)果相一致[19]。水稻在不同溫度處理下的相對表達量結(jié)果也表明，大部分時期小亞基基因的表達量都要低于大亞基基因[23]。根據(jù)本次相關性分析，小亞基基因AGPS表達量與淀粉累積正相關，故猜測這種現(xiàn)象或許是因為小亞基基因直接行使代謝功能而大亞基基因承擔小亞基基因代謝活性的調(diào)控[24]，所以在淀粉合成旺盛的時期小亞基基因才高度表達，而大亞基基因每個時期都在表達。造成表達量差異的具體原因是否與猜測想符合，還需要進一步研究證實。

相關性分析結(jié)果表明，AGPase小亞基基因的表達量與百合淀粉含量及酶活性都表現(xiàn)出正相關，說明小亞基基因是影響AGPase活性及淀粉合成的關鍵因子。此外，葉片的酶活性也可以直接影響鱗片淀粉含量，這說明鱗莖作為庫器官，其貯藏的淀粉除了自身合成外，還有很重要的一部分來自其他源器官。鱗片和葉片中AGPase基因之間的相關性呈現(xiàn)較大差異，這與玉米中同一AGPase基因不同部位，不同時間的表達差異性很大這一結(jié)果一致[25]；與小麥中不同亞基基因存在組織特異性表達這一結(jié)果也一致[26]，故可以推測百合AGPase不同亞基基因可能也存在組織特異性表達。

綜上所述，本研究說明亞洲百合川百合和東方百合‘白佩琪’的AGPase基因序列，表達模式、AGPase酶活性、鱗片淀粉含量等除了小亞基基因表達模式存在差異外都很相似，故不同類型的百合在對AGPase進行研究時應可參考或直接使用一些其他百合中的相關結(jié)論。此外，AGPase大小亞基基因表達量差異及二者的相互作用等在百合中研究較少，值得進行深入研究以探明AGPase調(diào)控淀粉合成從而影響種球膨大的基因機理。另外，相關性分析的結(jié)果為鱗莖的繁育提供了可通過調(diào)節(jié)淀粉合成限速酶小亞基基因表達及調(diào)節(jié)其酶活性以促進百合鱗莖膨大的實踐思路。

4 結(jié) 論

本研究通過對東方百合‘白佩琪’及亞洲百合川百合的AGPase基因的克隆及qPCR、淀粉含量及酶活性的測定得到這兩類百合AGPase基因序列，表達量，不同時期淀粉含量及AGPase酶活性以及在兩類百合中的異同。兩類百合不同時期的淀粉含量及酶活性變化趨勢相同，但同一發(fā)育時期不同類型百合的淀粉含量及酶活性存在差異。兩類百合大小亞基基因的表達量在鱗莖不同時期的表達模式是相似的，但同一發(fā)育時期不同類型百合的表達量存在差異。AGPase小亞基基因的表達量與淀粉含量正相關。