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芽孢桿菌生物合成納米硒條件優(yōu)化及活性評價

2023-03-31 07:00:12朱燕云陳丹艷馬敬澤靳紅梅
農業(yè)工程學報 2023年1期
關鍵詞:枯草芽孢桿菌

朱燕云,王 欣,陳丹艷,馬敬澤,朱 寧,靳紅梅,

芽孢桿菌生物合成納米硒條件優(yōu)化及活性評價

朱燕云1,2,3,王欣4,陳丹艷5,馬敬澤5,朱寧1,2,靳紅梅1,2,4※

(1. 江蘇省農業(yè)科學院資源與環(huán)境研究所,南京 210014;2. 江蘇省有機固體廢棄物資源化協(xié)同創(chuàng)新中心,南京 210095;3. 農業(yè)農村部種養(yǎng)結合重點實驗室,南京 210014;4. 南京農業(yè)大學資源與環(huán)境學院,南京 210095;5. 金陵科技學院園藝園林學院,南京 210038)

作為生防菌的枯草芽孢桿菌XP(subspeciesstrainXP)不僅具有較強的耐硒與耐鹽能力,而且還可將毒性較高的無機硒轉化為安全性高、生物活性好的納米硒 (SeNP),然而目前其合成SeNP的效率并不高。為提升菌株XP生物合成SeNP的效率,該研究針對其合成工藝條件做了進一步優(yōu)化。首先,通過單因素試驗,初步篩選出適宜范圍量值的初始亞硒酸鹽Se (IV)濃度、搖床轉速、XP接種量;其次,將這三個因子作為影響因素,以SeNP產量為響應指標,利用Box-Behnken響應面法 (RSM) 進行分析;最終,通過響應面法獲得枯草芽孢桿菌XP產SeNP的最優(yōu)發(fā)酵工藝條件。研究結果表明,枯草芽孢桿菌XP合成納米硒的最佳發(fā)酵條件為:初始Se (IV) 3.4 mmol/L、搖床轉速157 r/min、菌株XP接種量9.9%,此發(fā)酵條件下納米硒的產量達到1.82 mmol/L,相對優(yōu)化前提升了60%以上。此外,通過種子發(fā)芽試驗,進一步證明此工藝條件下合成的納米硒具有較高的生物活性,可有效提升油麥菜種子活力,促進種子萌發(fā)。

菌;發(fā)酵;響應面法;枯草芽孢桿菌;納米硒;生物活性

0 引 言

硒(Selenium, Se)是一種天然微量元素,在維持人體健康和動物機體正常代謝方面發(fā)揮著重要作用[1-2]。目前,硒已被廣泛應用于眾多領域,包括農業(yè)、化工以及臨床醫(yī)學等[3-6]。硒雖然是動物和人類必需的微量營養(yǎng)元素,但其過量攝入則會導致機體中毒。研究表明,人體硒的安全攝入范圍在40~400 μg/d,過多或過少攝入硒均會導致人體產生嚴重的健康問題[7]。硒具有四種典型價態(tài),即:硒酸鹽[Se(VI)]、亞硒酸鹽[Se(IV)]、硒化物[Se(?II)] 和單質硒[Se(0)][4],不同價態(tài)之間可以進行相互轉化。一些植物可以通過自身代謝過程,將環(huán)境中的無機硒或單質硒轉化為有機硒儲存在植物組織中,人類則可通過食用這些含硒植物間接攝取機體代謝所需的硒。自然界中的硒普遍以無機態(tài)存在于水體或土壤中,有機態(tài)硒多存在于生物體當中。然而,無機硒易流動,潛在環(huán)境風險高,而有機硒因其有效范圍狹窄易造成生物毒害,單質硒毒性相對較低,但是生物利用度低[8]。

近年人們通過研究發(fā)現(xiàn)一種新型單質態(tài)硒—納米硒(Selenium Nanoparticle, SeNP),并已證明納米硒相對于無機硒、有機硒和一般的單質硒來說具有生物活性高、毒性小、粒子分散度高、表面積大等一系列更優(yōu)異的特性[9-12],被視作一種具有廣泛應用前景的材料。目前已有的納米硒合成手段主要包括:化學法、物理法以及生物法,相對于前兩者而言,生物法不僅能耗低、環(huán)境友好且所得納米硒的活性更高,更易被機體吸收利用[13]。因此,利用生物法合成納米硒更受人們青睞。國內外已有研究表明,自然界中的許多微生物能夠通過自身代謝過程,將毒性較高的無機硒(硒酸鹽或亞硒酸鹽)轉化為毒性較低的納米硒[14-16]。這些產納米硒的微生物中以細菌居多,如:克雷伯氏菌屬(sp.)[17]、草螺菌屬(sp.)[18]、鏈酶菌屬(sp.)[19]、假單胞菌屬(sp.)等[20]。不同種類細菌之間,生物合成納米硒的能力存在較大差異,這主要是因為種類不同的細菌對底物硒酸鹽/亞硒酸鹽的耐受能力不同,且參與納米硒合成的代謝途徑不同[21]。此外,相同菌株在不同的生長環(huán)境下,其代謝硒酸鹽/亞硒酸鹽的能力也有所不同,對底物的利用度以及轉化能力也會表現(xiàn)出較大差異[22]。因此,篩選耐受硒脅迫能力強的菌株,并確定其培養(yǎng)的最佳條件參數,從而有效提升納米硒的合成效率,這對推動納米硒的實際生產應用十分關鍵。

枯草芽孢桿菌作為一種生防菌,在食品加工和保鮮、生物發(fā)酵以及綠色有機農產品生產中具有潛在的應用價值。此外,枯草芽孢桿菌也是微生態(tài)環(huán)境中的優(yōu)勢種群,不僅具有植物促生等優(yōu)勢,其繁殖力和理化性質穩(wěn)定性也優(yōu)于大部分生防菌株。本團隊通過前期研究已篩選到一株耐高鹽且耐受硒能力較強的菌株—枯草芽孢桿菌菌株XP(subspeciesstrain XP),并明確了其合成納米硒的基本規(guī)律[23]。為了滿足納米硒后續(xù)實際生產應用的需求,菌株XP合成納米硒的工藝條件參數還需進一步優(yōu)化。本研究主要通過單因素試驗與響應面試驗相結合的方法,對菌株XP合成納米硒的主要條件參數進行優(yōu)化。不僅有效提升了生物納米硒產量,而且進一步對其生物活性進行了評價,這將為后續(xù)耐硒枯草芽孢桿菌菌株功能的開發(fā)以及生物納米硒在富硒作物生產與環(huán)境修復中的應用提供有力支撐。

1 材料和方法

1.1 試驗菌株與供試植物種子

將枯草芽孢桿菌XP(subspeciesstrainXP)作為本研究的供試菌株,此前由本實驗室工作人員分離于廢棄生物質的厭氧發(fā)酵產物中,菌株XP在此用于納米硒的生物合成。供試蔬菜種子為油麥菜(品牌為四季香,購自綠寶種業(yè))。

1.2 主要試劑與培養(yǎng)基

1.2.1 試劑

Na2SeO3(98%, Sigma-Aldrich) 固體粉末用于配制亞硒酸鹽母液(1 mol/L);Na2S(≥98%,上海凌峰化學試劑有限公司)用于配制硫化鈉溶液(1 mol/L);NaCl (≥99.5%,西隴科學股份有限公司)用于配制生理鹽水(0.85%,/)及培養(yǎng)基的制備;酵母提取物和胰蛋白胨均為賽默飛世爾科技公司OXIOD品牌,用于配制培養(yǎng)基;丙三醇、NaOH、鹽酸及其他常規(guī)試劑均為國藥集團試劑,分析純;試驗所用水均為去離子水。

1.2.2 培養(yǎng)基

Luria-Bertani (LB) 液體培養(yǎng)基成分:NaCl 10 g、胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、去離子水1 000 mL,pH值7.0~7.3,121 ℃條件下高壓蒸汽滅菌20 min,晾至室溫后用于菌株的活化。含硒LB液體培養(yǎng)基:將滅菌的LB液體培養(yǎng)基置于超凈工作臺上,用移液槍吸取上述無菌亞硒酸鈉母液(Se(Ⅳ)=1 mol/L),加至LB液體培養(yǎng)基中,使Se(IV)初始濃度達4 mmol/L,作為菌株XP合成納米硒的發(fā)酵培養(yǎng)基。

1.3 主要儀器

桌面式冷凍離心機(5424R,Eppendorf,德國)、生化培養(yǎng)箱(DNP-9162,精宏,中國)、恒溫搖床(HZQ-F160,華美,中國)、水浴鍋(HH-3A,國華,中國)、超低溫冰箱(DW-HL528,美菱,中國)、酶標儀(EPOCH 12,Bio Tek,美國)、旋渦振蕩器(VORTEX-5,其林貝爾,中國)、真空冷凍干燥儀(Alpha 2-4 LSCbasic,CHRIST,德國)、烘箱(DHG-9076Y,精宏,中國)、pH計(FE28,Mettler Toledo,瑞士)。

1.4 試驗方法

1.4.1 菌株活化與擴大培養(yǎng)

將–20 ℃低溫保存的芽孢桿菌XP甘油管于4 ℃條件下解凍,之后置于超凈臺上備用。按照1%(體積分數)的接種比將解凍后的菌株XP菌液接至5 mL的 LB培養(yǎng)基中,180 r/min、35 ℃恒溫培養(yǎng)過夜;次日,再將菌液轉接至50 mL的LB培養(yǎng)基中,相同轉速與溫度條件恒溫培養(yǎng)至對數生長期(OD600≈0.8),此時的菌液用于后續(xù)試驗。

1.4.2 納米硒生物合成及其含量測定

納米硒生物合成:基于1.2.2的方法配制LB培養(yǎng)基,將其事先分裝至250 mL三角錐形瓶中(100 mL/瓶),滅菌后添加亞硒酸鈉,獲得無菌含硒(Se(Ⅳ)= 4 mmol/L)LB培養(yǎng)基;于超凈工作臺上,用移液槍吸取活化好的枯草芽孢桿菌XP菌液,按照1%(體積分數) 的接種量加至上述含硒LB培養(yǎng)基中,不加硒的為對照組;每個處理設置3個重復。將所有樣品放置于恒溫搖床上,180 r/min、35 ℃恒溫連續(xù)培養(yǎng)48 h[23],之后分析發(fā)酵液中的納米硒含量。

發(fā)酵液中納米硒含量測定采用改進的Biswas[24]。具體步驟如下:1)從每個錐形瓶中各取發(fā)酵液6 mL分裝至3個2 mL離心管中,即每個生物學樣品對應3個技術重復;2)將上述裝有樣品的離心管置于離心機中,4 ℃、8 000 r/min離心10 min,用移液槍輕輕吸出上清,得到沉淀;3)向上述沉淀中加入1 mol/L的Na2S溶液各1 mL,蓋上管蓋,輕輕振蕩以使沉淀充分溶解,室溫靜置,期間手動振蕩一次;4)靜置1 h后離心收集上清,加入到96孔板中,200 μL/孔,置于酶標儀上測定500 nm 處的吸光值。同時,按照文獻[24]所述繪制標準曲線并得到標準曲線方程。最后,將樣品測定的吸光值代入標準曲線方程,計算出原供試發(fā)酵液中納米硒的含量。

1.4.3 合成納米硒的單因素試驗

本團隊通過前期研究[23]已明確耐鹽枯草芽孢桿菌菌株XP生長的最佳pH值以及培養(yǎng)溫度依次為pH值7.2和35 ℃。此外,底物初始Se (IV) 濃度、搖床轉速、菌株XP接種量也是影響納米硒產量的三大主要因素,至今這3個因素各自的最優(yōu)區(qū)間尚不清楚。為此分別設置底物Se (IV) 不同初始濃度水平 (1、2、4、6、8 mmol/L)、不同搖床轉速(120、150、180、200 r/min)、XP不同接種量(0.5%、1%、2.5%、5%、10%,/)進行培養(yǎng),以48 h時發(fā)酵液中的納米硒含量為標準,分別評價這3個因素(初始Se (IV) 濃度、搖床轉速、菌株XP接種量)對菌株XP生物合成納米硒的影響。考察單一因素時,其余因素的量值固定為:搖床轉速180 r/min、菌株XP接種量1%、底物Se(IV) 濃度4 mmol/L。

1.4.4 響應面優(yōu)化試驗設計

基于單因素試驗結果,確定每個因素的最優(yōu)區(qū)間,依據Box-Behnken試驗設計原理,進一步運用Design-Expert 12 軟件設計多因素正交組合試驗。選擇以上三個因子(初始Se (IV)濃度、搖床轉速、接種量)作為變量,試驗因素及水平編碼如表1所示,A、B、C分別表示初始Se(IV)濃度、搖床轉速、接種量3個變量。以SeNP產量為響應值,獲得多元二次回歸模型,求解產SeNP發(fā)酵條件參數的最優(yōu)組合。采用三因素三水平的響應面法對培養(yǎng)條件進一步優(yōu)化,從而獲得菌株XP生物合成SeNP的最佳發(fā)酵工藝條件。

表1 Box-Behnken試驗因素與水平

1.4.5 模型驗證

根據響應面模型優(yōu)化得到菌株XP合成SeNP的最佳發(fā)酵工藝條件,按照初始Se (IV) 濃度、搖床轉速和接種量的最優(yōu)值再次進行發(fā)酵試驗合成納米硒,設置4組重復。發(fā)酵溫度35 ℃,48 h后測定發(fā)酵液中的納米硒含量,將其與模型預測值對比,從而驗證響應面預測模型是否合理。

1.4.6 納米硒活性分析

通過種子萌發(fā)試驗對優(yōu)化工藝條件下合成的納米硒生物活性進行評價[25]。挑選籽粒飽滿大小均一的油麥菜種子,用3%的雙氧水消毒后再用去離子水沖洗4次,濾紙吸干種子表面水分后備用。設置含不同濃度納米硒(0.25、0.5、1、2.5、5、10 mmol/L)的種子培養(yǎng)液,發(fā)芽試驗方法參照呼鳳蘭等[25]的研究。準備無菌培養(yǎng)皿(12 cm),皿內鋪墊2~3層濾紙,每個皿中放入40粒種子,按照不同處理加入相應濃度的納米硒培養(yǎng)液10 mL,等量水做對照組,蓋上皿蓋。每個處理設置3個重復,培養(yǎng)皿置于(25±1) ℃的恒溫培養(yǎng)箱中,次日開始統(tǒng)計種子發(fā)芽個數,以油麥菜種子吐白1 mm為標準。連續(xù)3 d無新增發(fā)芽種子則視為不發(fā)芽,連續(xù)觀察和記錄,7 d后統(tǒng)計油麥菜的發(fā)芽勢(GE)和發(fā)芽指數(GI)。GE/%=(發(fā)芽高峰期種子數/40)×100;GI/%=∑(G/D)×100,其中G為第天當天的發(fā)芽數,D為發(fā)芽時間。

1.5 數據處理

本研究中涉及的所有試驗沒有特殊說明的均設置3個重復,所得數據采用軟件SAS 9.4進行統(tǒng)計學分析,利用origin 2021分析作圖,利用Design-Expert 12.0進行Box-Behnken試驗設計。

2 結果與分析

2.1 枯草芽孢桿菌XP生物合成納米硒工藝條件單因素試驗

2.1.1 底物Se(IV)初始濃度對納米硒產量的影響

底物濃度是影響生物發(fā)酵過程目標物質產量的主要因素之一。不同初始Se(IV)濃度條件下,菌株XP合成納米硒的結果如圖1所示。由圖1可知,隨著發(fā)酵體系中的底物Se(IV)濃度逐漸增加,納米硒的產量隨之呈先增加后降低的趨勢,當Se(IV)濃度為2 mmol/L時,納米硒產量最高為0.73 mmol/L。李嚴等[26]研究了1~4 mmol/L亞硒酸鹽Se(IV)條件下,產堿桿菌(sp.)和普羅菲登斯菌(sp.)合成納米硒的能力,發(fā)現(xiàn)了類似的規(guī)律,推測是由于Se(IV)濃度過高會對菌株產生毒性作用,從而造成菌株還原Se(IV)的能力降低。BORAH等[27]通過研究發(fā)現(xiàn),擬蕈狀芽孢桿菌()在1.25~10 mmol/L亞硒酸鹽Se(IV)條件下,合成納米硒的效率和底物Se(IV)初始濃度密切相關,表現(xiàn)為硒初始濃度越高納米硒合成效率逐漸降低。因此,選擇合適的初始Se (IV) 添加量,對于維持菌株XP的正常代謝生長和納米硒的高效合成至關重要,基于圖1結果,確定1~4 mmol/L作為下步Box-Behnken試驗的Se(IV)初始濃度范圍。

注:考察單一因素時,其余因素的量值固定為:搖床轉速180 r·min-1、菌株XP接種量1%、底物Se(IV) 濃度4 mmol·L-1,不同字母表示差異明顯(P<0.05),下同。

2.1.2 搖床轉速對納米硒產量的影響

除底物濃度之外,搖床轉速對菌株代謝產物的合成過程也至關重要。轉速對枯草芽孢桿菌菌株XP合成納米硒的影響結果如圖2所示,在120~200 r/min范圍內,菌株XP發(fā)酵產納米硒的量在0.88~0.57 mmol/L之間。當搖床轉速為150 r/min時,發(fā)酵液中納米硒含量最高(0.88 mmol/L);搖床轉速增加至200 r/min,發(fā)酵液中納米硒的含量最低(0.57 mmol/L)。任玉文等[28]的研究表明,轉速過快會對培養(yǎng)體系中的菌體產生一定程度的機械損傷,從而造成菌體衰亡,抑制代謝產物的合成;王宏浩等[29]在對枯草芽孢桿菌進行發(fā)酵時,發(fā)現(xiàn)轉速過慢則易致使發(fā)酵體系中的溶解氧含量降低,導致好氧菌株生長繁殖變緩,甚至使培養(yǎng)基發(fā)生沉淀,造成代謝產物合成量大幅降低。因此,搖床轉速過高或過低都不利于微生物的生長及代謝物的合成,選擇合適的轉速對于促進菌株XP生物合成納米硒至關重要?;趫D2結果,確定120~180 r/min作為下步Box-Behnken試驗的搖床轉速范圍。

2.1.3 接種量對納米硒產量的影響

發(fā)酵過程中,菌株的接種量過高或過低均會對整個發(fā)酵過程產生不利影響。菌株XP接種量對納米硒合成量的影響結果如圖3所示。當菌株XP接種量在0.5%~10%之間時,納米硒產量隨接種量增加而增加;當接種量為5%時納米硒合成量最高,為1.04 mmol/L;當接種量增加到10%時,納米硒產量有輕微下降,但與5%接種量處理組相比無顯著性(>0.05)差異,納米硒合成量保持在相對恒定的水平。孫雨佳等[30]的研究表明,接種量過高,會導致發(fā)酵體系溶解氧快速消耗殆盡,進而抑制菌株自身的生長以及代謝產物的合成。張羽竹等[31]通過研究植物乳酸桿菌還原亞硒酸鹽產納米硒,發(fā)現(xiàn)適宜的接種量(2%~4%)可使納米硒合成效果維持在較高的水平,接種量過低會顯著降低納米硒的合成量。合成同一目標產物的最適接種量會因菌株種類的不同而表現(xiàn)出較大的差異,明確菌株XP的最適接種量將能有效提升菌株XP發(fā)酵產納米硒的量。基于圖3結果推測菌株XP最佳接種量在5%附近,雖10%處理與5%處理之間無顯著性差異,但二者之間差值較大,最佳值也可能位于5%~10%之間,綜合考量最終選定2.5%~10%作為下步Box-Behnken試驗的接種量范圍。

圖2 搖床轉速對納米硒產量的影響

圖3 枯草芽孢桿菌XP接種量對納米硒合成的影響

2.2 響應面優(yōu)化試驗

2.2.1 響應面試驗設計及其結果

運用Design-Expert 12 軟件對發(fā)酵體系初始Se (IV) 濃度、搖床轉速、菌株XP接種量進行三因素三水平的Box-Behnken試驗,結果見表2。

2.2.2 回歸方程及方差分析

運用Design-Expert 12 軟件中“Analysis”對表2中的數據進行分析。得到初始Se (IV) 濃度()、搖床轉速()、接種量()之間的二次回歸方程=1.767 1+ 0.516 6–0.091 8+0.130 7+0.049 5+0.001 2+ 0.185 6–0.419 92–0.270 52–0.075 32。由表3中的二次回歸模型方差分析結果可知,此回歸模型極顯著(= 0.000 4<0.01),失擬項不顯著(=0.057 1>0.05),說明方程模擬較好,可用此模型對納米硒產量進行分析與預測;該模型的決定系數2=0.961 2,信噪比13.311 1>4,表明模型可信度較高;模型一次項極顯著(<0.01)、顯著(<0.05),交互項顯著(<0.05),二次項2、2極顯著(<0.01)。

表2 Box-Behnken試驗設計及其結果

表3 二次回歸模型的方差分析

2.2.3 響應面立體圖分析

根據回歸方程所得的響應面立體圖如圖4所示,主要反映了初始Se(IV)濃度、搖床轉速、XP接種量三者之間的相互作用,通過2.2.2中的回歸方程可知,二次項系數為負值,表明方程具有最大值。利用Design-Expert 12.0 分析求解得到模型最大值,最優(yōu)產納米硒的發(fā)酵條件為:初始Se(IV) 3.4 mmol/L、搖床轉速157 r/min、菌株XP接種量9.9%,此時由模型預測的SeNP產量為1.99 mmol/L。

圖4 初始Se(IV)濃度、搖床轉速與菌株XP接種量交互作用對納米硒產量影響的響應面圖

2.2.4 模型預測納米硒合成量的試驗驗證結果

根據上述模型優(yōu)化的結果,設置菌株XP合成納米硒的實際發(fā)酵條件為:初始Se (IV) 3.4 mmol/L、搖床轉速157 r/min、菌株XP接種量9.9%,發(fā)酵溫度35 ℃,發(fā)酵時間為48 h。對模型優(yōu)化的結果進一步驗證,試驗設置3個重復,最終結果取平均值。最終,試驗結果表明菌株XP發(fā)酵液中SeNP的含量為 (1.82±0.25) mmol/L,接近理論預測值,表明上述優(yōu)化的模型可靠。

2.3 不同濃度生物納米硒對種子活力的影響

優(yōu)化條件下發(fā)酵產物中菌體和納米硒的形態(tài)如圖5a所示(箭頭所指為納米硒顆粒),分離去除細胞得到的純納米硒顆粒形態(tài)如圖5a中的小圖所示。通過種子發(fā)芽試驗,對已去除細胞的純納米硒生物活性做進一步分析。如圖5b所示,當SeNP處理濃度在0.25~1 mmol/L范圍時,油麥菜種子的發(fā)芽勢和發(fā)芽指數呈上升趨勢;當SeNP濃度達到1 mmol/L時,發(fā)芽勢與發(fā)芽指數均顯著(<0.05)高于無硒對照組(Control),分別為66%和31%。這說明0.25~1 mmol/L SeNP處理對油麥菜種子的萌發(fā)具有促進作用,1 mmol/L的SeNP處理最有利于油麥菜種子的萌發(fā)。ANTONY等[32]用納米硒處理硬皮豆()種子,發(fā)現(xiàn)適宜濃度的納米硒可以增強種子的生命力,原因是由于納米硒處理促進了種子快速萌發(fā)所需的H2O和O2的攝入。此外,納米材料也可以通過降低植物種子內脫落酸的含量,從而提高赤霉素含量,改變種子的休眠周期[33]。通過納米硒處理后的種子具有較強的抗病能力,可以進一步提升幼苗期耐受環(huán)境污染的能力,促進種子的萌發(fā)、幼苗的生長以及后續(xù)植株的發(fā)育[34-36]。

圖5 納米硒掃描電鏡圖像和不同濃度SeNP對油麥菜種子活性的影響

3 結 論

本研究針對枯草芽孢桿菌菌株XP生物合成納米硒的發(fā)酵條件進行了優(yōu)化,并對優(yōu)化條件下發(fā)酵產生的納米硒生物活性做了進一步分析。首先通過單因素試驗,解析了“初始Se (IV) 濃度、搖床轉速、菌株XP接種量”3個主要因素對納米硒合成的影響規(guī)律,確定了后續(xù)試驗這3個因素的范圍值依次為1~4 mmol/L、120~180 r/min、2.5%~10%。基于此,進行了三因素三水平正交試驗,并利用響應面Box-Behnken試驗建立了二次多項式回歸模型。最終,確定菌株XP合成納米硒的最佳發(fā)酵條件為:初始Se(IV) 3.4 mmol/L、搖床轉速157 r/min、菌株XP接種量9.9%。進一步通過實際試驗驗證優(yōu)化工藝下納米硒產量(1.82 mmol/L)比優(yōu)化前的(1.04 mmol/L)提高了60%以上。在此條件下合成的納米硒可以有效提升蔬菜種子的活力,促進種子萌發(fā)。本研究采用的發(fā)酵工藝優(yōu)化技術大大提升了目前芽孢桿菌產納米硒的效率,有效解決了微生物合成納米硒產率低這一瓶頸問題。研究結果不僅為今后生物納米硒的規(guī)?;a提供了理論參考,而且也為后續(xù)耐硒菌株的功能開發(fā)、納米硒的綠色高效合成及其在富硒農作物安全生產中的應用推廣提供了有力支撐。

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Optimization and bio-activity evaluation of nano-selenium biosynthesis bysp.

ZHU Yanyun1,2,3, WANG Xin4, CHEN Danyan5, MA Jingze5, ZHU Ning1,2, JIN Hongmei1,2,4※

(1.210014,; 2.210095,; 3.,210014,; 4.210095,; 5.210038,)

Nano-selenium, as a kind of new functional nanomaterials, has attracted wide attention from all over the word. Compared with inorganic selenium, organic selenium or elemental selenium, nano-selenium has a lot of outstanding features, including high biological activity, low toxicity, and large surface area. Biosynthetic process is regarded as a relatively efficient and environment-friendly pathway to produce nanomaterials. Our previous study found thatsubspeciesstrainXP, as a biocontrol bacteria strain, not only had strong resistance to selenium or salt, but also had strong ability of transform inorganic selenium with higher toxicity into selenium nanoparticle (SeNP) with higher bioactivity and safety. Furthermore, the strain XP has been confirmed to have higher safety and bioactivity compared to those identified strains. But so far, the SeNP yield from selenite reduction by strain XP metabolism is inefficient, which seriously hinders the wide application of this technology. As we all known, fermentation process parameters have great influence on the selenite reduction and SeNP yield. Choosing appropriate parameters can increase in the SeNP production, as well as reduce the cost of SeNP synthesis. Response surface methodology (RSM) has been considered to be an effective method of process parameter optimization. In this study, the synthesis conditions (e.g., selenite concentration, speed of cultivation, dosage of inoculation) were further optimized to improve the biological efficiency of SeNP synthesis by strain XP. The fermentation conditions were optimizedby single factor test, Box-Behnken design (BBD), and response surface methodology. Firstly, the effects of different initial Se (IV) concentrations (1-8 mmol/L) in the culture medium, shaker speeds (120-200 r/min), and the amounts of strain XP inoculation (0.5-10%) on SeNP production were tested by single factor experiment. The production of SeNP increased first and then decreased with gradual increase of initial Se (IV) concentrations. With the shaking speed going up from 120 r/min to 200 r/min, SeNP production also increased first and then decreased. When the inoculum amount of strain XP was between 0.5% and 10%, the yield of SeNP enhanced rapidly along with the increase of inoculum amount. The results showed that each selected experiment parameter had a strong influence on the SeNP production within their scopes: 1-4 mmol/L Se(IV), 120-180 r/min, and 2.5%-10%, respectively. Based on it, the optimal range of each indicator was confirmed. Meanwhile, the above three factors were taken as the influencing factors and SeNP production was used as the response index. Secondly, the Box-Behnken response surface methodology (RSM) was applied to optimize the fermentation conditions of strain XP used for SeNP biosynthesis. Finally, the optimal theoretical value of fermentation condition obtained through response surface experiments were verified by actual experiments. The results indicated that the optimal fermentation condition for SeNP biosynthesis byXP were as follows: initial Se (IV) concentration of 3.4 mmol/L, shaker speed of 157 r/min, and inoculum amount of 9.9%. The SeNP production was 1.82 mmol/L under the optimum condition, which was increased by more than 60% over that under normal condition. Moreover, the seed germination experiment was conducted for confirming the bio-activity of SeNP biosynthesis under optimized culture condition. Application of SeNP could effectively stimulate the Indian lettuce seed vigor and promote the germination process.

bacteria; fermentation; response surface methodology;; nano-selenium; bio-activity

10.11975/j.issn.1002-6819.202208144

S2

A

1002-6819(2023)-01-0269-08

朱燕云,王欣,陳丹艷,等. 芽孢桿菌生物合成納米硒條件優(yōu)化及活性評價[J]. 農業(yè)工程學報,2023,39(1):269-276.doi:10.11975/j.issn.1002-6819.202208144 http://www.tcsae.org

ZHU Yanyun, WANG Xin, CHEN Danyan, et al. Optimization and bio-activity evaluation of nano-selenium biosynthesis bysp.[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2023, 39(1): 269-276. (in Chinese with English abstract) doi:10.11975/j.issn.1002-6819.202208144 http://www.tcsae.org

2022-07-28

2022-12-02

國家自然科學基金青年科學基金項目(42107026);江蘇省農業(yè)科技自主創(chuàng)新資金(CX(20)3078);江蘇省重點研發(fā)計劃(社會發(fā)展)項目(BE2022788)

朱燕云,博士,助理研究員,研究方向為納米硒的生物合成機制以及納米硒在環(huán)境修復方面的應用研究。Email:yyz_leo@126.com

靳紅梅,博士,研究員,研究方向為新型污染物的遷移轉化及產地投入品污染防控研究。Email:hmjin@jaas.ac.cn

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