陳 剛，宋國新，韓 雪，張煒明

常規(guī)石蠟組織免疫組化染色定位清晰，具有特異性和敏感性，是病理診斷中重要的輔助檢查，但抗體孵育時間較長，染色流程平均需2.5～3 h。冷凍快速免疫組化染色應用超敏感抗體標記技術，具有特異性、敏感性、操作簡便、用時短的特點，但冷凍組織形態(tài)結構不如石蠟組織清晰，限制了其在臨床中的應用。筆者將冷凍快速免疫組化抗體應用于常規(guī)石蠟切片免疫組化染色，取得了較好的染色效果，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料選取2021～2022年南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院存檔的肺癌蠟塊標本10例，其中肺鱗狀細胞癌、肺腺癌各5例。

1.2 試劑快速免疫組化一步法專用酶標聚合物一抗CK5/6、p63、CKpan、TTF-1，均購自美鑫達醫(yī)療公司?？焖倜庖呓M化兩步法專用一抗CK5/6、p63、CKpan、TTF-1，專用酶標聚合物二抗，均購自賽諾特生物公司。檸檬酸抗原修復液(pH 6.0)，常規(guī)免疫組化一抗CK5/6、p63、CKpan、TTF-1，鼠兔通用型MaxVision二抗，DAB顯色試劑盒，均購自福州邁新公司。

1.3 方法肺鱗狀細胞癌蠟塊每例連續(xù)3 μm厚切片9張，肺腺癌蠟塊每例連續(xù)3 μm厚切片3張，65 ℃烤片30 min，常規(guī)脫蠟至水，所有切片均經檸檬酸抗原修復液(pH 6.0)高壓熱修復12 min后分為3組：A實驗組采用快速免疫組化一步法，B實驗組采用快速免疫組化兩步法，標準對照組采用常規(guī)免疫組化兩步法，分別對肺癌石蠟切片中腫瘤細胞標志物CK5/6、p63、CKpan、TTF-1進行染色。具體操作步驟：(1)A實驗組：加冷凍快速專用一抗，室溫孵育3 min，PBS沖洗3次×1 min，DAB顯色3 min。(2)B實驗組：加冷凍快速專用鼠源性一抗，室溫孵育4 min，PBS沖洗3次×1 min，加專用酶標抗鼠聚合物二抗室溫孵育3 min，PBS沖洗3次×1 min，DAB顯色3 min。(3)標準對照組：加常規(guī)福州邁新公司一抗37 ℃孵育1 h，PBS沖洗3次×1 min，加鼠兔通用型MaxVision二抗室溫孵育20 min，PBS沖洗3次×1 min，DAB顯色5 min。顯色完成后三組切片均經蘇木精復染，常規(guī)封固，鏡檢。

2 結果

2.1 染色質量對比采用快速免疫組化一步法(A實驗組)、兩步法(B實驗組)，分別對肺鱗狀細胞癌石蠟切片中CK5/6、p63、CKpan和肺腺癌石蠟切片中TTF-1進行染色。結果顯示：兩種檢測方法均定位準確，背景清晰，染色強度適中(圖1、2)。A、B實驗組染色質量與標準對照組(圖3)相比，差異無顯著性。

2.2 染色時間對比三組實驗分別記錄免疫組化染色時間，包括一、二抗孵育、PBS沖洗、DAB顯色時間。本實驗中快速免疫組化一步法(A實驗組)用時最短，染色總時間僅需9 min；快速免疫組化兩步法(B實驗組)用時稍長，染色時間需16 min。A、B實驗組染色時間均明顯低于標準對照組(表1)。

表1 各組染色時間對比分析

3 討論

石蠟組織切片是常規(guī)免疫組化染色首選的標本類型[1]，其具有細胞形態(tài)結構好，染色定位清晰，反應敏感且特異等特點。免疫組化技術根據酶標記位置可分為直接法和間接法。直接法是將酶標記在一抗上，操作簡便，特異性強，但因抗體只能結合有限的酶分子，敏感性較低，且每種特異性抗體均需標記，制作成本高。間接法是將酶標記于二抗上，在特異性一抗與組織中的抗原反應后，再用酶標二抗與一抗結合后顯色，由于二抗對一抗的多點識別模式，其染色敏感性更高，通用性更強。隨著酶標聚合物技術的發(fā)展，現行石蠟組織常規(guī)免疫組化染色大多采用間接法[2]，為了能達到良好的染色效果，一、二抗孵育時間長，各類主流全自動免疫組化染色儀實際染色全流程平均需用時2.5 h以上。

①A①B②A②B③A③B

冷凍快速免疫組化法與常規(guī)免疫組化法相比，其抗體濃度高且純[3]，既減少抗體的孵育時間，也保證染色的特異性。在本實驗中，A實驗組(直接法)運用獨特的抗體納米超敏感多聚體直接偶聯標記技術，將辣根過氧化物酶多聚體直接標記一抗，不僅簡化操作步驟，更有效提高染色敏感性，整個染色流程僅需9 min即可達到良好的染色效果。B實驗組(間接法)二抗采用獨特的微聚合物層疊技術，將二抗F(ab′)2片段和酶通過新型偶聯化學在微骨架上分層有序聚合，提升了特異性和敏感度，總染色時間也僅需16 min就能取得和標準法相同的染色效果。與常規(guī)免疫組化法相比，兩種快速免疫組化法在染色時長上優(yōu)勢明顯，本實驗4種抗體染色定位準確，背景清晰，強度適中，與常規(guī)標準對照法差異無顯著性。綜上所述，本實驗將冷凍快速免疫組化試劑應用于石蠟組織切片可縮短染色時間，提高病理診斷的及時率，減少患者報告等待時間。

由于抗體制備成本高、種類少等原因，冷凍快速免疫組化試劑尚不能廣泛應用于石蠟切片的快速免疫組化染色。隨著抗體制備成本的降低以及超敏酶標技術的發(fā)展，快速石蠟組織免疫組化有望成為未來免疫組化的發(fā)展方向。