尹詩源，李雨晴，尹 玉，蔡永萍,2

骨肉瘤是一種高度惡性的骨原發(fā)性惡性腫瘤，好發(fā)于青少年。自20世紀(jì)70年代采用術(shù)前新輔助化療后，患者5年生存率從不足20%提升到60%～75%，但新輔助化療耐藥患者的預(yù)后仍較差，不足20%[1]。在過去的幾十年里，研究者雖然進(jìn)行不斷地探索，但多項臨床實(shí)驗(yàn)顯示改變化療藥物劑量或聯(lián)合使用新藥均未能明顯改善患者的預(yù)后[2]。目前，骨肉瘤患者的生存率停滯不前，化療耐藥是制約治療進(jìn)展的重要難題。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，叉頭框蛋白M1(forkhead box M1, FoxM1)與骨肉瘤細(xì)胞的增殖、遷移及化療耐藥相關(guān)[3-4]，但具體機(jī)制尚不清楚。最新一項研究[5]分析3個不同隊列的258例高級別骨肉瘤基因拷貝數(shù)讀數(shù)，發(fā)現(xiàn)c-myc顯著富集；同時，F(xiàn)u等[6]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)c-myc在骨肉瘤轉(zhuǎn)移組中比非轉(zhuǎn)移組表達(dá)明顯增高。骨肉瘤新輔助化療耐藥患者常出現(xiàn)轉(zhuǎn)移、預(yù)后差，但c-myc高表達(dá)是否與骨肉瘤化療耐藥有關(guān)尚不清楚。因此，本文重點(diǎn)探討c-myc與骨肉瘤化療耐藥的關(guān)系及是否受FoxM1的調(diào)控，其有望為臨床骨肉瘤化療耐藥尋找新的治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 試劑骨肉瘤細(xì)胞系HOS和U2OS購自中科院上海細(xì)胞庫。FoxM1抗體(ab207298)和c-myc抗體(ab32072)購自Abcam公司；RCM-1(CAS 339163-65-4)購自Sigma公司；順鉑購自南京制藥公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞在含10%滅活胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)，2～3天/次棄舊液，0.25%胰蛋白酶消化傳代繼續(xù)培養(yǎng)。課題組前期建立的HOS和U2OS順鉑耐藥細(xì)胞系在含2 μg/mL順鉑培養(yǎng)液里穩(wěn)定生長和傳代，分別命名為HOS/R和U2OS/R。

1.3 慢病毒轉(zhuǎn)染建立穩(wěn)定過表達(dá)FoxM1骨肉瘤細(xì)胞FoxM1克隆引物序列如下。FoxM1正向：5′-GCTAGCATCGATACGCGTAAAACTAGCCCCCGTCGG-3′；FoxM1反向：5′-TGCGGATCCTTCGAACTAGTC TACTGTAGCTCAGGAATAAACTGGG-3′。對FoxM1擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測序驗(yàn)證。過表達(dá)質(zhì)粒載體為pSIN-EF2-HA-Puro，使用SpeI和MluI兩種限制性核酸內(nèi)切酶，通過同源重組的方式將目的基因連接到載體上。配置750 μL opti-MEM、12 μg目的質(zhì)粒(空載體或FoxM1)、6 μg pCAG-dR8.9、1.5 μg VSVG和750 μL opti-MEM的混合物，混合后室溫靜置20 min，將其輕柔地滴加入293T細(xì)胞培養(yǎng)液中，培養(yǎng)6 h后更換培養(yǎng)基，隔天獲得293T的培養(yǎng)基病毒上清，并使用0.22 μm的濾器過濾。在細(xì)胞貼壁密度約70%時，加入8 μg/μL polybrene的病毒，6～8 h后補(bǔ)液至8 mL，待48 h后重新消化傳代，同時進(jìn)行1 μg/mL嘌呤霉素感染細(xì)胞，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.4 Western blot法收集細(xì)胞后加入裂解液，提取總蛋白，采用BCA法進(jìn)行蛋白定量，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜后5%脫脂牛奶封閉1 h以上，再加入一抗FoxM1(1 ∶1 000稀釋)、c-myc(1 ∶1 000稀釋)或GAPDH(1 ∶5 000稀釋)4 ℃孵育過夜，加入HRP標(biāo)記的兔二抗(1 ∶10 000稀釋)室溫孵育2 h，顯影。

1.5 CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)將處于對數(shù)生長期的骨肉瘤貼壁細(xì)胞取100 μL(每毫升5×104個細(xì)胞)分別接種于96孔板。培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)液，分別加入DMSO或10 μmol/L RCM-1和2 μg/mL順鉑。第1～4天，每孔中加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃保存2 h后棄去液體，450 nm處測定吸光度。

1.6 生物信息分析c-myc與FoxM1的Kaplan-Meier生存曲線圖來自GEPIA(http://gepia.cancer-pku.cn/)數(shù)據(jù)庫。

2 結(jié)果

2.1 骨肉瘤耐藥細(xì)胞中FoxM1和c-myc的表達(dá)本課題組前期已建立穩(wěn)定骨肉瘤順鉑耐藥細(xì)胞HOS/R和U2OS/R，在2 μg/mL順鉑中均穩(wěn)定生長。運(yùn)用Western blot法檢測FoxM1和c-myc的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示：與親本細(xì)胞相比(HOS：0.38±0.06，U2OS：0.32±0.02)，骨肉瘤耐藥細(xì)胞中FoxM1(HOS/R：0.69±0.06，U2OS/R：0.88±0.01)的蛋白表達(dá)水平升高(圖1A)，c-myc在骨肉瘤耐藥細(xì)胞中的表達(dá)也升高(圖1B)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 Western blot法檢測骨肉瘤親本細(xì)胞HOS、U2OS和順鉑耐藥細(xì)胞HOS/R、U2OS/R細(xì)胞中FoxM1(A)、c-myc(B)的蛋白表達(dá)：*P<0.05，**P<0.01

2.2 FoxM1與c-myc表達(dá)的關(guān)系運(yùn)用慢病毒載體構(gòu)建穩(wěn)定過表達(dá)FoxM1的骨肉瘤細(xì)胞HOS/FoxM1和U2OS/FoxM1。Western blot檢測顯示：與對照組相比，HOS/FoxM1和U2OS/FoxM1中FoxM1的蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05, 圖2A)，表明成功構(gòu)建穩(wěn)定過表達(dá)FoxM1骨肉瘤細(xì)胞；與對照組HOS/NC(0.35±0.07)和U2OS/NC(0.59±0.03)相比，HOS/FoxM1(1.19±0.08)和U2OS/FoxM1(1.61±0.13)中的c-myc蛋白表達(dá)升高(圖2B)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，表明c-myc的表達(dá)受FoxM1調(diào)控。

圖2 Western blot法檢測空載體對照HOS/NC、U2OS/NC和FoxM1穩(wěn)定過表達(dá)細(xì)胞HOS/FoxM1、U2OS/FoxM1細(xì)胞中FoxM1(A)、c-myc(B)蛋白表達(dá)水平:*P<0.05，**P<0.01

2.3 FoxM1抑制劑RCM-1對FoxM1、c-myc表達(dá)的影響在耐藥細(xì)胞和過表達(dá)FoxM1細(xì)胞中加入10 μmol/L RCM-1處理48 h后檢測蛋白表達(dá)。Western blot結(jié)果顯示：與對照DMSO組相比，10 μmol/L RCM-1處理耐藥細(xì)胞后，F(xiàn)oxM1和c-myc蛋白表達(dá)量顯著下降(P<0.01,圖3A)。同樣，經(jīng)10 μmol/L RCM-1處理過表達(dá)FoxM1細(xì)胞(FoxM1：0.11±0.03vs0.10±0.02，c-myc：0.35±0.01vs0.36±0.02)，F(xiàn)oxM1和c-myc蛋白表達(dá)比對照DMSO組(FoxM1：0.78±0.02vs1.11±0.10，c-myc：0.93±0.04vs0.82±0.02)也顯著降低(P<0.01,圖3B)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：抑制FoxM1表達(dá)后c-myc表達(dá)下降，提示c-myc表達(dá)受FoxM1的調(diào)控。

圖3 在耐藥細(xì)胞HOS/R、U2OS/R(A)和FoxM1過表達(dá)細(xì)胞HOS/FoxM1、U2OS/FoxM1(B)中FoxM1及c-myc的蛋白水平表達(dá)：DMSO.對照組，**P<0.01

2.4 FoxM1抑制劑RCM-1對骨肉瘤細(xì)胞順鉑化療敏感性的影響為了探討抑制FoxM1對骨肉瘤化療敏感性的影響，在骨肉瘤耐藥細(xì)胞和FoxM1過表達(dá)細(xì)胞中分別給予2 μg/mL順鉑+DMSO或2 μg/mL順鉑+10 μmol/L RCM-1。結(jié)果顯示：在骨肉瘤耐藥細(xì)胞中，聯(lián)合RCM-1和順鉑(HOS/R：0.22±0.07, U2OS/R：0.25±0.03)處理與單獨(dú)順鉑(HOS/R：0.64±0.04, U2OS/R：0.70±0.11)給藥組相比，細(xì)胞增殖能力明顯降低(圖4A、B)，在FoxM1過表達(dá)細(xì)胞組聯(lián)合RCM-1和順鉑(HOS/FoxM1：0.23±0.03，U2OS/FoxM1：0.26±0.04)與單獨(dú)順鉑給藥組(HOS/FoxM1：0.61±0.03，U2OS/FoxM1：0.65±0.05)相比細(xì)胞增殖能力也明顯降低(圖4C、D)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，聯(lián)合使用FoxM1抑制劑RCM-1，可以增加耐藥骨肉瘤細(xì)胞對化療藥物敏感性。

圖4 CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)：分別給予DMSO+順鉑(2 μg/mL)或RCM-1(10 μmol/L)+順鉑(2 μg/mL)后，HOS/R(A)、U2OS/R(B)、HOS/ FoxM1(C)和U2OS/ FoxM1(D)細(xì)胞增殖曲線：*P<0.05，**P<0.01

2.5 FoxM1和c-myc高表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系GEPIA數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)中FoxM1與c-myc的Kaplan-Meier生存曲線分析顯示，F(xiàn)oxM1和c-myc高表達(dá)組和低表達(dá)組總生存期差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，高表達(dá)組患者預(yù)后差(P<0.05，圖5)。

圖5 GEPIA數(shù)據(jù)庫顯示FoxM1(A)和c-myc(B)表達(dá)與患者總生存期的關(guān)系：P<0.05

3 討論

骨肉瘤是最常見的高度惡性骨原發(fā)性腫瘤，約占肉瘤的30%，好發(fā)于青少年[7]。自20世紀(jì)70年代，采用阿霉素、順鉑聯(lián)合甲氨蝶呤的新輔助化療使骨肉瘤患者的生存率大幅提升[2]。新輔助化療后，在瘤體切除標(biāo)本中評估腫瘤壞死率，分為反應(yīng)好者(>90%腫瘤細(xì)胞壞死)和反應(yīng)差者(<90%腫瘤細(xì)胞壞死)，研究發(fā)現(xiàn)在多變量Cox模型中，對化療反應(yīng)好者的無瘤生存率和總生存率均較高，而化療反應(yīng)差者預(yù)后較差[8]。因此，探索骨肉瘤化療耐藥機(jī)制，尋找新的治療靶點(diǎn)是骨肉瘤臨床治療的難題。

骨肉瘤是一種具有廣泛組織異質(zhì)性、基因組高度不穩(wěn)定性的惡性腫瘤，化療耐藥機(jī)制非常復(fù)雜。目前，研究發(fā)現(xiàn)耐藥可能與藥物在細(xì)胞內(nèi)蓄積、藥物失活、DNA損傷修復(fù)、腫瘤微環(huán)境等多種因素有關(guān)[2]。很多臨床試驗(yàn)嘗試在傳統(tǒng)化療藥物基礎(chǔ)上聯(lián)合使用新的藥物，如在一線化療方案中添加異環(huán)磷酰胺或依托泊苷，這些試驗(yàn)結(jié)果顯示增加新的藥物非但未改善患者預(yù)后，還帶來與治療相關(guān)的嚴(yán)重毒性[1,9]。因此，深入分析骨肉瘤化療耐藥分子機(jī)制，對改善骨肉瘤的治療意義重大。

FoxM1最初被認(rèn)為是一種細(xì)胞增殖相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，后來發(fā)現(xiàn)其在細(xì)胞分化、干細(xì)胞自我更新及腫瘤發(fā)生等多種生理或者病理過程中發(fā)揮重要作用[10-11]。近年研究發(fā)現(xiàn)FoxM1也參與化療藥物的耐藥[10,12]。本組發(fā)現(xiàn)FoxM1在骨肉瘤順鉑耐藥細(xì)胞中的表達(dá)比親本細(xì)胞明顯升高，F(xiàn)oxM1過表達(dá)細(xì)胞表現(xiàn)出對順鉑藥物的耐藥性增加。本組前期實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxM1高表達(dá)與骨肉瘤細(xì)胞增殖、侵襲相關(guān)[3]，F(xiàn)oxM1高表達(dá)促進(jìn)腫瘤干細(xì)胞特性表達(dá)[13]、DNA損傷修復(fù)增強(qiáng)[14]，且FoxM1高表達(dá)骨肉瘤患者的臨床預(yù)后更差[4]，提示FoxM1高表達(dá)可能與骨肉瘤化療耐藥密切相關(guān)。文獻(xiàn)報道FoxM1與三陰型乳腺癌的紫杉醇化療耐藥相關(guān)，聯(lián)合FoxM1抑制劑和紫杉醇治療可增加耐藥細(xì)胞的敏感性[15]。近年，研究提示FoxM1可能作為臨床化療耐藥治療的潛在靶點(diǎn)[12,16]，但其信號通路中存在眾多調(diào)控因子和效應(yīng)因子，具體調(diào)控機(jī)制仍不清楚。

c-myc是腫瘤中常見的活化原癌基因之一，與細(xì)胞分化、增殖和腫瘤惡性進(jìn)展及化療耐藥等相關(guān)[17-19]。近年研究發(fā)現(xiàn)c-myc有望成為潛在的腫瘤治療新靶點(diǎn)[20-21]。c-myc位于17p11.2～p12，早期研究發(fā)現(xiàn)13%～32%高級別骨肉瘤在此區(qū)域擴(kuò)增，該區(qū)域還包括PMP22、TOP3A和MAPK7基因[22]。De Noon等[5]對1例4歲兒童高度侵襲性骨肉瘤標(biāo)本進(jìn)行全基因組測序，發(fā)現(xiàn)c-myc高水平擴(kuò)增，他們也在其它隊列研究中發(fā)現(xiàn)約15%患者存在c-myc高擴(kuò)增。值得注意的是，生存分析也表明高c-myc擴(kuò)增與臨床轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[6]。目前，尚未有c-myc與骨肉瘤化療耐藥的相關(guān)報道。本組發(fā)現(xiàn)c-myc在骨肉瘤順鉑耐藥細(xì)胞中的表達(dá)明顯升高，F(xiàn)oxM1過表達(dá)細(xì)胞中c-myc表達(dá)增高，F(xiàn)oxM1抑制劑可以降低c-myc表達(dá)；聯(lián)合FoxM1抑制劑增加骨肉瘤細(xì)胞耐藥細(xì)胞對順鉑的敏感性；FoxM1和c-myc高表達(dá)組患者的總生存期顯著低于低表達(dá)組，表明c-myc高表達(dá)和骨肉瘤化療耐藥相關(guān)，并且c-myc表達(dá)可能受FoxM1調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)FoxM1高表達(dá)組肺癌患者化療后無進(jìn)展生存期較短[23]，與本組結(jié)果一致。Grunblatt等[24]發(fā)現(xiàn)c-myc過表達(dá)介導(dǎo)肺癌對順鉑的耐藥，抑制c-myc使耐藥腫瘤細(xì)胞重新獲得對化療藥物的敏感性。此外，也有研究報道c-myc原癌基因可能通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的代謝參與化療耐藥[25]。目前，關(guān)于FoxM1和c-myc直接調(diào)控關(guān)系的研究報道較少，Pan等[26]應(yīng)用定量CHIP技術(shù)在前列腺癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)c-myc與FoxM1的啟動子結(jié)合位點(diǎn)特異性結(jié)合。另有研究發(fā)現(xiàn)，c-myc抑制劑MYCi975也能夠抑制FoxM1表達(dá)[27]。然而，在骨肉瘤中FoxM1和c-myc是否有直接調(diào)控關(guān)系，還需要行CHIP等實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，F(xiàn)oxM1和c-myc高表達(dá)與骨肉瘤化療耐藥相關(guān)，且FoxM1上調(diào)c-myc表達(dá)促進(jìn)化療耐藥，聯(lián)合FoxM1抑制劑增加耐藥細(xì)胞對順鉑的敏感性。本實(shí)驗(yàn)有助于理解骨肉瘤化療耐藥的分子機(jī)制，為臨床逆轉(zhuǎn)骨肉瘤化療耐藥治療開發(fā)新的靶點(diǎn)和制定新的策略提供理論基礎(chǔ)。