李東昌，陳 可，汪正廣

胃癌是臨床常見的惡性腫瘤，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示：2020年胃癌的發(fā)病率和病死率均位居前五位，嚴(yán)重威脅人類的生命健康[1]。我國(guó)、日本、韓國(guó)等東亞國(guó)家是胃癌的高發(fā)國(guó)家[2]，胃腺癌是胃癌的最常見類型，占胃癌人群的90%[3]。盡管目前胃癌治療方法已取得較大進(jìn)展，但進(jìn)展期胃癌患者的預(yù)后仍較差，患者5年總生存率仍不足30%[4-5]。因此，選擇合適的分子靶點(diǎn)是當(dāng)前研究的重點(diǎn)。復(fù)制因子C(replication factor C, RFC)是一類結(jié)構(gòu)特異性蛋白復(fù)合物，由5個(gè)亞基(RFC1～5)組成，可以作為DNA聚合酶的引物識(shí)別因子，調(diào)控DNA的復(fù)制和修復(fù)[6]。RFC2是唯一能夠使增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)脫離并抑制DNA聚合酶活性的RFC亞基，多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與RFC2的關(guān)系密切，其在胃癌中的研究尚未見報(bào)道。本文采用免疫組化法和Western blot法檢測(cè)胃腺癌組織中RFC2的表達(dá)，探討其與胃腺癌臨床病理特征的關(guān)系及其臨床意義，為臨床治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2016年1月1日～12月31日我院普外科80例行胃癌根治術(shù)的胃癌標(biāo)本，術(shù)后病理結(jié)果均證實(shí)為胃腺癌。其中男性58例，女性22例；年齡39 ～77歲，平均(57.12 ± 19.77) 歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)術(shù)前病理結(jié)果證實(shí)為原發(fā)性胃腺癌且有手術(shù)指征；(2)術(shù)前未行放療、化療或介入等其他治療；(3)術(shù)前無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；(4)無(wú)多發(fā)病灶。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)其他部位惡性腫瘤轉(zhuǎn)移至胃部；(2)因腫瘤破裂出血、穿孔、梗阻等各種原因行急診手術(shù)者；(3)既往曾因胃良性或惡性腫瘤行手術(shù)治療者；(4)合并嚴(yán)重的心、肺、腎等其他臟器疾病者；(5)術(shù)后入院期間患者死亡。收集患者臨床病理資料包括患者年齡、性別、腫瘤最大徑、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度、腫瘤TNM分期和總生存期等臨床病理指標(biāo)。其中TNM分期依據(jù)AJCC分期手冊(cè)(第8版)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，總生存期是指患者從術(shù)后開始至死亡或失訪時(shí)間。所有患者通過(guò)電話或門診隨訪，截至日期2022年5月30日。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)我院倫理委員會(huì)審核，患者均知情同意。

1.2 方法

1.2.1免疫組化 標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，切片常規(guī)脫蠟水化，梯度乙醇脫水。免疫組化采用SP兩步法，一抗兔抗人RFC2(DF4735)多克隆抗體購(gòu)自Affinity公司。檸檬酸鈉抗原修復(fù)，3%H2O2室溫孵育25 min，一抗室溫孵育1 h(RFC2，1 ∶400)。加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記兔抗人IgG室溫孵育45 min，磷酸緩沖鹽溶液(PBS)漂洗3次，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，脫水透明，封固。

1.2.2Western blot法 將組織清洗后充分研碎，加入適量RIPA細(xì)胞裂解液和PMSF蛋白酶抑制劑，提取總蛋白的操作步驟嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。采用BCA法蛋白定量，高溫使蛋白變性。10%SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，將蛋白轉(zhuǎn)至聚乙烯二氟膜上，經(jīng)5%BSA于室溫封閉膜1 h，將膜置于一抗稀釋溶液中4 ℃孵育過(guò)夜。TBST洗膜10 min×3次后置于辣根酶標(biāo)記山羊抗兔二抗(1 ∶1 000)稀釋液中室溫孵育1 h，再次用TBST洗膜10 min×3次。最后用ECL化學(xué)發(fā)光法顯影后，采用凝膠分析軟件(Bandscan)分析所得條帶灰度值，用目的條帶與β-actin蛋白比值計(jì)算RFC2蛋白在組織中的表達(dá)。

1.3 結(jié)果判斷采用半定量評(píng)分法對(duì)樣本進(jìn)行評(píng)分，RFC2為細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)呈棕黃色顆粒為陽(yáng)性，需根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞染色強(qiáng)度與陽(yáng)性細(xì)胞百分比進(jìn)行判斷。(1)根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞染色強(qiáng)度計(jì)分：無(wú)著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；(2)根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞百分比計(jì)分：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。陽(yáng)性細(xì)胞染色強(qiáng)度與陽(yáng)性細(xì)胞百分比的乘積為染色指數(shù)，染色指數(shù)>2.43為高表達(dá)組，≤2.43為低表達(dá)組[7]。

2 結(jié)果

2.1 胃腺癌、癌旁和正常胃黏膜組織中RFC2的表達(dá)免疫組化染色結(jié)果顯示：RFC2主要在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，伴或不伴細(xì)胞核弱表達(dá)。RFC2在胃癌組織中的高表達(dá)率為70%(56例)，癌旁組織為47.5%(38例)，正常胃黏膜組織中無(wú)高表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖1)。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示：胃癌組織中RCF2蛋白的表達(dá)量明顯高于癌旁和正常胃黏膜組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖2)。

ABC圖1 A.RFC2在胃癌組織中高表達(dá);B.RFC2在癌旁組織中高表達(dá);C.RFC2在正常胃黏膜組織中不表達(dá);SP兩步法

2.2 胃癌組織中RFC2表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示：胃癌組織中RFC2表達(dá)與腫瘤分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移個(gè)數(shù)有關(guān)，低分化癌、Ⅲ期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移個(gè)數(shù)>3個(gè)者的RFC2表達(dá)明顯高于高、中分化癌(χ2=23.597，P<0.001，表1)、Ⅰ+Ⅱ期(χ2=9.545，P=0.002)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移個(gè)數(shù)≤3個(gè)者(χ2=2.014，P=0.046)。胃癌組織中RFC2表達(dá)與患者性別、年齡、腫瘤最大徑和CEA水平無(wú)關(guān)(P均>0.05，表1)。

圖2 Western blot法檢測(cè)RFC2蛋白表達(dá)水平：A.電泳圖；B.直方圖；*P<0.05；***P<0.001

表1 RFC2表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系

2.3 RFC2表達(dá)與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系RFC2高表達(dá)組胃腺癌患者總生存率明顯低于RFC2低表達(dá)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(39.46%vs79.13%，P=0.001 7) 。其中，RFC2高表達(dá)組中位總生存期為31個(gè)月，RFC2低表達(dá)組為69個(gè)月(圖3)。Cox單因素分析顯示：RFC2表達(dá)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、分化程度與胃癌患者預(yù)后有關(guān)(P均<0.05，表2)。Cox多因素分析顯示：TNM分期、腫瘤分化程度和RFC2 高表達(dá)是影響胃癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P均<0.05，表2)。

圖3 RFC2表達(dá)與胃腺癌患者預(yù)后的關(guān)系

3 討論

2020年全球國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)數(shù)據(jù)顯示，我國(guó)胃癌患者約占全球的41%，其發(fā)病率和病死率均較高，嚴(yán)重威脅著患者的生命健康[8]。胃癌的標(biāo)志物特異性和靈敏性均較差，尋找能夠預(yù)測(cè)早期胃癌發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移的生物學(xué)標(biāo)志物，對(duì)監(jiān)測(cè)胃癌病程的進(jìn)展、判斷預(yù)后具有重要的指導(dǎo)價(jià)值。

RFC是一種結(jié)構(gòu)特異性的DNA結(jié)合蛋白復(fù)合物，是DNA聚合酶的引物識(shí)別因子[6]。RFC在DNA復(fù)制和修復(fù)、細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞周期檢查點(diǎn)以及細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用。RFC2位于人類染色體7q11.23內(nèi)，編碼RFC復(fù)合物中相對(duì)分子質(zhì)量為4.0×104的亞基[9]。RFC2是唯一能獨(dú)立脫離PCNA并抑制DNA聚合酶活性的RFC亞基[7]。DNA準(zhǔn)確復(fù)制與癌癥的發(fā)展密切相關(guān)，DNA準(zhǔn)確復(fù)制可保證細(xì)胞的正常增殖和生長(zhǎng)。DNA損傷修復(fù)和DNA損傷檢查點(diǎn)功能的喪失，導(dǎo)致癌細(xì)胞的增殖失控。RFC2參與DNA損傷修復(fù)和DNA損傷檢查點(diǎn)的控制，已被證明是惡性腫瘤進(jìn)展的重要調(diào)節(jié)因子[10-11]。RFC2參與多種腫瘤細(xì)胞的增殖，如RFC2參與妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞疾病的發(fā)生，RFC2在絨毛膜癌組織中的表達(dá)高于正常絨毛組織，RFC2與PCNA的表達(dá)呈正相關(guān)[11]。鼻咽癌患者的RFC2表達(dá)上調(diào)，高于正常組織[10]。然而，RFC2在胃癌組織中尚未見相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。本組胃腺癌中RFC2高表達(dá)率和RFC2蛋白表達(dá)量均明顯高于癌旁組織及正常胃黏膜組織，RFC2蛋白高表達(dá)與患者性別、年齡、腫瘤最大徑、CEA水平均無(wú)關(guān)，而與腫瘤分化程度、TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)密切相關(guān)，腫瘤分化程度低、TNM分期高和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移個(gè)數(shù)多者，RFC2蛋白表達(dá)明顯升高，提示RFC2高表達(dá)可促進(jìn)胃癌細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移，是胃癌侵襲性生物學(xué)行為的標(biāo)志物。Cox多因素分析顯示，RFC2高表達(dá)是影響胃癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。Kaplan-Meier生存分析結(jié)果提示，RFC2高表達(dá)胃腺癌患者的生存期低于 RFC2低表達(dá)患者。一項(xiàng)關(guān)于肝癌的研究中結(jié)果顯示，RFC2轉(zhuǎn)錄和蛋白水平高表達(dá)，RFC2高表達(dá)的肝癌患者總生存期和無(wú)瘤生存期均顯著縮短，RFC2在肝癌中通過(guò)參與 DNA復(fù)制來(lái)調(diào)控細(xì)胞周期，而細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，敲除RFC2可降低肝癌細(xì)胞的增殖和遷移[12]。同時(shí)，有研究表明RFC2在尤因肉瘤中高表達(dá)，其總生存期縮短[13]。這與本組生存分析結(jié)果類似，提示RFC2高表達(dá)可能預(yù)示惡性腫瘤患者預(yù)后不良。

總之，胃腺癌組織中RFC2蛋白表達(dá)上調(diào)，是影響患者預(yù)后的重要因素，提示RFC2可能是胃腺癌患者預(yù)后的新指標(biāo)和治療新靶點(diǎn)。由于本實(shí)驗(yàn)收集的病例數(shù)較少且未涉及其分子機(jī)制的研究，尚有待積累更多病例進(jìn)一步分析。