郭 燕，徐 爽，王 亭,2

急性腎損傷(acute kidney injury, AKI)是指在各種藥物、毒素等病理因素下，腎小管上皮細胞(mouse proximal tubular epithelial cells, mPTC)發(fā)生變性、凋亡、壞死、脫落，導致腎功能急劇下降的一種疾病。腎小管上皮細胞線粒體豐富、代謝率高，對損傷刺激尤其敏感，是AKI發(fā)生的中心環(huán)節(jié)。深入探討AKI腎小管上皮細胞損傷的機制，有利于尋找有效的治療靶點。蛋白激酶D1(protein kinase D1, PKD1)是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，屬于Ca2+/鈣調(diào)素依賴激酶超家族[1]，研究顯示其廣泛表達于多種細胞，參與心臟病理、生理重構(gòu)、炎癥反應、致癌作用、肌動蛋白重塑、細胞增殖以及遷移等多種病理、生理過程[2-6]。目前，PKD1在腎臟中的作用尚無報道。本文著重探討AKI中PKD1的表達，分析其與臨床病理學特征的關(guān)系，為臨床治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2017年2月～2022年2月南京醫(yī)科大學附屬逸夫醫(yī)院經(jīng)腎活檢證實為AKI的6例石蠟標本。AKI使用KDIGO標準診斷[7]。另收集5例腎癌手術(shù)切除標本的癌旁正常腎組織作為對照，常規(guī)病理檢查均無腎損傷。本實驗經(jīng)南京醫(yī)科大學附屬逸夫醫(yī)院倫理委員會批準，患者均知情同意。

1.2 動物收集18只雄性C57BL/6小鼠(8周齡，體重22～25 g)，購自南京醫(yī)科大學動物實驗中心。小鼠被安置在溫度可控的房間，12 h光/暗循環(huán)，自由攝入食物和水，適應環(huán)境1周后進行實驗。18只雄性小鼠隨機分為2組：對照組(n=8)、順鉑(Cisplatin)組(n=10)。Cisplatin組小鼠一次性腹腔注射0.9%生理鹽水溶解的Cisplatin(20 mg/kg)，手術(shù)72 h后采用戊巴比妥鈉注射液(50 mg/kg)安樂死小鼠，收集血清和腎臟標本，在-80 ℃下保存，以便進一步分析。

1.3 免疫組化患者標本和小鼠腎組織均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，梯度乙醇脫水，常規(guī)石蠟包埋，3 μm厚切片，使用北京中杉金橋PV 8000兩步法進行免疫組化染色：切片脫蠟至水；檸檬酸鈉抗原修復液進行抗原修復；PBS沖洗3次；3%過氧化氫溶液阻止內(nèi)源性過氧化物酶的活性；PBS沖洗3次；血清封閉液室溫封閉1 h；加入PKD1抗體(1 ∶200)后4 ℃孵育過夜；PBS沖洗3次；二抗37 ℃孵育1 h；DAB顯色，經(jīng)復染、脫水、透明后，中性樹膠封固。在顯微鏡下觀察并進行圖像采集，用IPP圖像分析軟件對蛋白表達量進行分析。

1.4 細胞培養(yǎng)與處理小鼠腎小管上皮細胞(mouse proximal tubular epithelial cells, mPTC)是從美國模式培養(yǎng)物集存庫(American type culture collection，ATCC)購買的永生化細胞系，用含10%胎牛血清的DMEM/F-12培養(yǎng)基培養(yǎng)。細胞在37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中生長，并使用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA(Invitrogen公司)在80%融合度傳代培養(yǎng)。細胞處理前，無血清培養(yǎng)基饑餓24 h，經(jīng)10 μmol/L CID755673(CID, HY-12239，MCE)預處理，2 h后加入Cisplatin(5、10 μmol/L)，Cisplatin處理后24 h收集細胞提取蛋白及mRNA用于后續(xù)實驗。

1.5 RNA提取和qRT-PCR檢測使用TRIzol提取腎組織總RNA(表1)。qRT-PCR循環(huán)條件為95 ℃ 10 min、95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min，合計40個循環(huán)。將mRNA的相對量標準化為GAPDH，并使用delta-delta方法根據(jù)閾值循環(huán)數(shù)計算。

表1 qRT-PCR檢測基因引物序列

1.6 Western blot檢測細胞在RIPA裂解液中裂解，并加入蛋白酶抑制劑提取總蛋白。30 μg蛋白上樣通過12.5%SDS-PAGE電泳分離，并將分離后的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜。一抗兔多克隆抗體：PKD1抗體(1 ∶1 000)、剪切的Caspase-3(cleaved Caspase-3)抗體(1 ∶1 000)、BCL-2抗體(1 ∶1 000)、Bax抗體(1 ∶1 000)、β-actin抗體(1 ∶5 000)。過氧化物酶偶聯(lián)的山羊抗兔二抗，購自Santa Cruz公司。用Image J圖像分析軟件對蛋白表達量進行分析。

1.7 流式細胞術(shù)檢測

1.7.1Annexin V-FITC和PI染色 細胞處理后，預冷PBS清洗細胞3次。重新收集細胞，向細胞中加入1×Binding Buffer重懸細胞沉淀，加入2.5 μL FITC-Annexin V和2.5 μL PI工作液充分混勻后，室溫條件下避光孵育20 min后，立即用流式細胞儀檢測。

1.7.2JC-1染色檢測線粒體膜電位 細胞處理結(jié)束后，棄去培養(yǎng)基，PBS清洗細胞后，加入1 mL新鮮培養(yǎng)基，向細胞中加入JC-1染色工作液，37 ℃避光孵育30 min，棄去上清液，JC-1染色緩沖液清洗細胞2次，收集細胞，使用流式細胞儀檢測熒光強度，通過紅綠熒光的比例衡量線粒體膜電位變化。

1.7.3線粒體活性氧(mitoSOX)檢測 用mitoSOX(M36008，Invitrogen公司)對細胞進行染色，37 ℃避光孵育10 min，使用流式細胞儀檢測線粒體活性氧水平；所有流式細胞數(shù)據(jù)使用Flow J軟件進行定量分析。

2 結(jié)果

2.1 PKD1在AKI患者和Cisplatin誘導mPTC中的表達免疫組化檢測癌旁正常腎組織和AKI患者腎組織中PKD1表達水平及定位。結(jié)果顯示：在癌旁正常腎組織中，PKD1表達位于近曲小管/遠曲小管，并以胞質(zhì)為主，腎小球內(nèi)未見表達(1.001±0.073)；AKI患者PKD1多表達于腎小管節(jié)段，腎小球內(nèi)也有表達(4.07±0.994)，且胞質(zhì)和胞膜表達均高于對照組(P=0.021 1，圖1)。在小鼠正常腎組織中，PKD1多表達于腎小管節(jié)段(0.992±0.072)，Cisplatin處理后，表達顯著升高(2.457±0.316 73，P=0.002 5)，且主要分布于胞質(zhì)(圖2)。同時，通過體外實驗觀察不同濃度的Cisplatin對PKD1表達量的影響，用5 μmol/L和10 μmol/L Cisplatin處理mPTC細胞，經(jīng)Western blot和qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)PKD1表達高于對照組，且隨濃度增加而增加(P<0.05，圖3、4)。

2.2 CID755673對Cisplatin誘導的mPTC損傷的影響本組進一步利用PKD1抑制劑CID755673分析PKD1在AKI中的作用。CID755673對mPTC預處理2 h后，用Cisplatin(10 μmol/L)繼續(xù)刺激24 h。利用Annexin V-FITC和PI染色，流式細胞儀檢測細胞凋亡，可見早期凋亡細胞(Annexin V+/PI-)和晚期凋亡細胞(Annexin V+/PI+)百分比均明顯增加(21.77±2.378)，而CID755673預處理Cisplatin組早期和晚期細胞凋亡比例均明顯高于單獨使用Cisplatin組(43.01±2.796，P<0.000 1，圖5)。本組還檢測凋亡相關(guān)基因BCL-2和Bax的mRNA和蛋白表達水平及凋亡效應蛋白Caspase-3激活情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：Cisplatin處理顯著增加Bax mRNA(2.191±0.144)和蛋白(1.564±0.06)的表達水平及Caspase-3的活化水平(cleaved Caspase-3)(1.753±0.076)，降低BCL-2 mRNA(1.564±0.06)和蛋白(0.712±0.008)的表達水平；而經(jīng)CID755673預處理Cisplatin組明顯加劇了BCL-2 mRNA(1.994±0.067，P=0.026)和蛋白(0.423±0.015，P=0.049)的下調(diào)以及Bax mRNA(2.56±0.402，P=0.012 9)和蛋白(1.994±0.067，P=0.027)的上調(diào)(圖6～8)。同時，也明顯加重了Cisplatin誘導的Caspase-3裂解激活(2.332±0.114，P=0.026，圖9)。

①A①B②A②B

圖3 A.Western blot法檢測不同濃度Cisplatin(5、10 μmol/L)處理的mPTC中PKD1蛋白表達；B.蛋白表達定量分析

圖4 qRT-PCR檢測不同濃度Cisplatin(5、10 μmol/L)處理的mPTC中PKD1 mRNA表達

圖5 A.流式細胞術(shù)檢測不同處理組mPTC中細胞的凋亡水平；B.用Flow J軟件進行定量分析

圖6 qRT-PCR檢測不同處理組mPTC中BCL-2 mRNA表達

圖7 qRT-PCR檢測不同處理組mPTC中Bax mRNA表達

圖8 A.Western blot法檢測不同處理組mPTC中BCL-2和Bax的蛋白表達；B.蛋白表達定量分析

2.3 CID755673對Cisplatin誘導的腎小管上皮細胞線粒體功能障礙的影響為進一步探討PKD1在腎小管上皮細胞中的作用，本組應用流式細胞術(shù)檢測腎小管上皮細胞的線粒體功能，發(fā)現(xiàn)Cisplatin處理后線粒體活性氧產(chǎn)量顯著增加(1.562±0.023)，而CID755673預處理組活性氧水平顯著高于單獨使用Cisplatin組(1.957±0.088，P=0.002，圖10)。同樣，本組還發(fā)現(xiàn)在Cisplatin處理組JC-1明顯下降(0.725 7±0.163)，CID755673預處理組膜電位進一步降低(0.46±0.026，P=0.043 2，圖11)。

圖9 A.Western blot法檢測不同處理組mPTC中活化的Caspase-3蛋白表達；B.蛋白表達定量分析

圖10 A.流式細胞術(shù)檢測不同處理組mPTC中線粒體內(nèi)活性氧的水平；B.Flow J軟件進行定量分析

圖11 A.流式細胞術(shù)檢測不同處理組mPTC中線粒體膜電位的改變；B.Flow J軟件進行定量分析

3 討論

AKI是一種常見的臨床表現(xiàn)，與發(fā)生慢性腎病乃至終末期腎病的風險相關(guān)。目前，尚沒有治療AKI的特效藥物。研究證實，腎小管上皮細胞是AKI的主要受損細胞。因此，深入探討其損傷機制，有利于加深對AKI發(fā)生、發(fā)展的認識，為早期防治AKI提供新的有效手段。本組發(fā)現(xiàn)PKD1廣泛表達于正常腎小管各節(jié)段，在AKI患者和小鼠AKI模型腎組織中表達顯著上調(diào)。文獻報道在多種應激刺激下，PKD1被迅速激活[8-9]。因此，PKD1的升高可能是對AKI損傷的保護性反應。

凋亡通常被認為是Cisplatin誘導AKI的關(guān)鍵病理過程和細胞死亡形式。腎臟內(nèi)的炎癥浸潤誘導細胞凋亡，進而導致腎臟上皮細胞死亡，這是急性腎臟疾病的特征[10-11]。越來越多的證據(jù)表明，腎小管細胞凋亡的主要機制與Caspase-3和凋亡相關(guān)蛋白Bax的激活以及抗凋亡BCL-2的抑制有關(guān)。Caspase-3是凋亡的效應蛋白，cleaved Caspase-3是其活性形式；Bax被認為是促凋亡蛋白，介導Cytochrome C的釋放，誘發(fā)凋亡反應；抗凋亡蛋白BCL-2可與Bax形成二聚體，從而抑制凋亡的發(fā)生[12-14]。研究證明，PKD1通過一系列信號轉(zhuǎn)導途徑激活，可有效減少氧化應激誘導的小腸上皮細胞及神經(jīng)元細胞凋亡損傷[15]。另外，研究還發(fā)現(xiàn)，PKD1可充當線粒體氧化應激反應的中心整合器，通過磷酸化激活NF-κB調(diào)節(jié)MnSOD的表達，發(fā)揮解毒作用，從而促進細胞存活[16]。因此，本組還評估了PKD1對cleaved Caspase-3、BCL-2和Bax表達水平的影響。結(jié)果顯示：抑制PKD1可顯著增加Cisplatin誘導的AKI腎臟中Caspase-3活化、Bax和BCL-2分裂，提示抑制PKD1在Cisplatin誘導的AKI發(fā)病機制中具有促進腎小管上皮細胞凋亡的作用。目前，關(guān)于PKD1對細胞死亡的影響仍存在爭議，多數(shù)研究認為PKD1是促進細胞生存的蛋白，如在腸道RIE細胞系，PKD1有助于抵抗氧化應激誘導的凋亡[15]，保護神經(jīng)細胞的缺血再灌注損傷[17-18]。也有研究認為PKD1介導凋亡的發(fā)生，Yuan等[6]在胰腺炎模型中的研究發(fā)現(xiàn)，PKD1通過ATP耗竭、RIP1降解減少、組織蛋白酶依賴性胰蛋白酶原活化等機制促進胰腺壞死和細胞凋亡損傷。本組中PI+細胞包括晚期凋亡和壞死細胞，與Cisplatin單獨處理組相比，CID755673預處理組凋亡總比例顯著增加，支持PKD1減輕凋亡的作用；但對凋亡外的其他死亡形式仍需進一步分析。對比不同文獻報道的矛盾之處，除了模型不同、實驗條件不同以外，也說明PKD1作用的復雜性。如炎癥或氧化應激在組織損傷修復中的正面和反面作用一樣，不同程度的損傷，病程的不同時期，發(fā)揮不同的效果，這也是很多藥物止步于臨床應用的重要原因。

線粒體是細胞內(nèi)的能量工廠，細胞在受到損傷刺激后，線粒體活性氧過量產(chǎn)生并累積，造成氧化應激，攻擊線粒體內(nèi)的結(jié)構(gòu)蛋白、脂質(zhì)和線粒體DNA(mtDNA)，使其發(fā)生氧化損傷，導致線粒體功能障礙。有研究發(fā)現(xiàn)，PKD1是活性氧介導的線粒體去極化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[19]，PKD1根據(jù)上游信號傳導和結(jié)合伙伴，穿梭于各種細胞區(qū)室，促進高爾基體運輸過程，以及線粒體、胞質(zhì)和核信號傳導[20]，參與調(diào)節(jié)線粒體病理、生理功能。

腎小管上皮細胞內(nèi)含有豐富的線粒體，尤其是近端腎小管細胞，主要依賴有氧代謝，所以對線粒體功能障礙十分敏感。研究發(fā)現(xiàn)，在AKI早期腎小管上皮細胞中存在線粒體結(jié)構(gòu)和功能改變，線粒體的片段化能夠引起細胞凋亡，且線粒體功能障礙能夠加劇腎小管的病理損傷，表明線粒體功能障礙可能介導AKI[21-23]。為了進一步探討PKD1在腎小管上皮細胞損傷中的作用，本組還觀察了CID755673對Cisplatin誘導的AKI中線粒體功能障礙的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：Cisplatin處理后線粒體活性氧產(chǎn)量顯著增加，線粒體膜電位明顯下降，而CID755673預處理組均明顯加重。上述現(xiàn)象使線粒體功能障礙進一步加劇，表明PKD1抑制劑加重Cisplatin誘導的細胞損傷，可能是通過調(diào)節(jié)線粒體功能障礙來實現(xiàn)的，進一步加深了對PKD1在AKI中作用的認識。

綜上所述，抑制PKD1能夠通過適當調(diào)節(jié)腎臟線粒體功能損傷和凋亡，加重Cisplatin誘導的AKI。研究發(fā)現(xiàn)，在腎小管上皮中進一步過表達PKD1，可能是保護細胞損傷和預防AKI的潛在治療靶點之一。