楊曉凈 鄧向群 肖婷 楊梅

骨質疏松癥(osteoporosis，OP)是較常見的代謝性骨疾病，以骨微結構破壞、骨量降低為特征，可增加骨脆性與骨折風險，影響患者健康并增加經(jīng)濟負擔[1]。繼發(fā)性OP常由代謝類疾病引起，糖尿病是導致OP的主要原因之一，隨著糖尿病進展，胰島素抵抗與內(nèi)環(huán)境紊亂均可引起骨代謝異常，增加OP風險[2]。糖尿病性OP治療包括生活方式干預、控糖，但收效甚微，因此急需發(fā)現(xiàn)安全有效的糖尿病性OP治療藥物。土貝母苷甲是五環(huán)三萜皂苷家族的成員，從中草藥土貝母中提取，傳統(tǒng)用于治療蛇毒與炎癥；且土貝母苷甲具有廣泛的抗癌特性[3]。此外，研究顯示土貝母苷甲可抑制NF-κB保護小鼠急性肺損傷[4]。而NF-κB通路對于破骨細胞的形成和分化是必不可少，NF-κB是RANKL誘導破骨細胞分化的重要下游信號[5]，然而土貝母苷甲對OP的直接影響筆者發(fā)現(xiàn)尚未被研究。因此，本研究筆者所見通過破骨細胞分化的常用通路RANKL/RANK/OPG探討土貝母苷甲對糖尿病性OP的影響，為糖尿病性OP的臨床治療提供理論參考。報道如下。

1 材料與方法

1.1 試驗動物 2個月齡Wistar大鼠60只(雄性)，許可證號：SCXK(湘)2019-0015，購自長沙市天勤生物技術有限公司。自然晝夜節(jié)律光照(12 h，12 h)，自由飲食飲水，環(huán)境濕度為40%～70%。

1.2 試劑 土貝母苷甲(S27647，純度≥95%，溶于二甲基亞砜中)；OPG(SRP3132)購自默克生命科學官網(wǎng)；SuperScriptTMIV第一鏈合成系統(tǒng)(18091050)、EXPRESS One Step SuperscriptTMqRT-PCR試劑盒(11781200)購自賽默飛世爾科技公司；兔抗RANK、RANKL、OPG、GAPDH一抗(GTX133795、GTX108515、GTX127948、GTX627408)購自GeneTex，山羊抗兔二抗(ab6702)購自美國Abcam公司；大鼠核心結合因子α1(CBF-α1)(GT04504B)ELISA檢測試劑盒購自上海晶風生物科技有限公司；Ⅰ型前膠原氨基端原肽(PINP)(ml038224)、骨鈣素(OC)(ml002883)ELISA檢測試劑盒購自上海酶聯(lián)；抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)(HR0561)購自北京百奧萊博科技有限公司；HE染色試劑(G1120)、BCA試劑盒(PC0020)均購自北京索萊寶。

1.3 實驗方法

1.3.1 模型制備：Wistar大鼠適應性喂養(yǎng)2周后，隨機抽取10只作為對照組，其他大鼠均構建糖尿病性OP模型[6]，即大鼠以高糖高脂飲食喂養(yǎng)(常規(guī)飼料+20%蔗糖+15%熟豬油、2.5%膽固醇)，禁食12 h后，腹腔注射鏈脲佐菌素(0.2%，25 mg/kg，以檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液作為稀釋液)，連續(xù)注射5 d。造模后第7天清晨尾靜脈取血測定血糖，血糖值>16.7 mmol/L為糖尿病大鼠造模成功。對照組常規(guī)飲食，以檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液代替。5周后通過全自動雙能X線骨密度測量儀檢測所有Wistar大鼠骨密度(BMD)，模型組以BMD<對照組平均BMD 2.5個標準差為糖尿病性OP大鼠造模成功。

1.3.2 分組：將符合條件的模型大鼠隨機分為模型組、土貝母苷甲低劑量組、土貝母苷甲高劑量組、OPG組、土貝母苷甲高劑量+OPG組，每組10只。土貝母苷甲低劑量組、土貝母苷甲高劑量組分別每日腹腔注射1 μmol/L、5 μmol/L土貝母苷甲[7]；OPG組尾靜脈注射3 mg/kg的OPG[8]；土貝母苷甲高劑量+OPG組腹腔注射5 μm土貝母苷甲，尾靜脈注射3 mg/kg的OPG；模型組以二甲基亞砜代替。

1.3.3 ELISA法檢測大鼠骨代謝指標(血清CBF-α1、PINP、OC)水平：末次給藥后，戊巴比妥鈉對大鼠實施麻醉，經(jīng)腹主動脈取血，分離得血清，ELISA法測定大鼠血清CBF-α1、PINP、OC水平，均嚴格參照ELISA試劑盒操作說明書。

1.3.4 Micro-CT測定骨密度及骨小梁微結構參數(shù)：隨機抽取5只大鼠，分離大鼠右側股骨，將股骨標本固定，使用Micro-CT對股骨遠端干骺端進行掃描，掃描完成后，對測量區(qū)域進行重組獲得3D圖像，利用ABA2.0對數(shù)據(jù)進行定量分析，得到BMD、骨體積分數(shù)(BV/TV，感興趣區(qū)內(nèi)骨組織體積除以總體積)、骨小梁數(shù)量(Tb.N)、骨小梁分離度(Tb.Sp)、骨小梁厚度(Tb.Th)，均由同一組熟練研究人員完成。

1.3.5 三點彎曲試驗檢測大鼠股骨機械強度：將大鼠中段股骨放置到OTS-15型分析儀上，對其進行三點彎曲試驗，記錄載荷-變形曲線，并計算最大載荷和斷裂撓度。

1.3.6 TRAP染色：剝離1.3.4中大鼠左側股骨，按照TRAP染色試劑盒說明制備染色溶液。將石蠟包埋的切片進行脫蠟并水化，將其浸泡在37℃的預熱的染料液浸染1 h，用蒸餾水洗滌，再次染色1 min。乙醇梯度脫水，二甲苯透明，封片。細胞核被染成藍色，TRAP的陽性表達表現(xiàn)為在細胞質中出現(xiàn)亮紅色或深紅色顆粒。具有≥3個核的TRAP陽性多核細胞被認為是破骨細胞，觀察并計算大鼠破骨細胞數(shù)量(N.Oc/BS)。

1.3.7 HE染色觀測大鼠骨組織病理學：分離剩余5只大鼠左側股骨，經(jīng)甲醛(10%)固定后，脫鈣、常規(guī)脫水、透蠟、包埋、切片，行HE染色，于光學顯微鏡下觀察。

1.3.8 qRT-PCR法檢測大鼠骨組織RANKL、RANK、OPG mRNA水平：取適量1.3.7中各組剩余5只大鼠右側股骨組織，利用Trizol抽提試劑盒抽提組織總RNA，反轉錄為cDNA，再以cDNA為模板進行擴增。反應條件：95℃預熱3 min，95℃ 變性10 s，60℃退火30 s，72℃延伸15 s，共35次循環(huán)，72℃ 5 min終止反應。RANKL/RANK/OPG以GAPDH為內(nèi)參基因[生工生物工程(上海)股份有限公司合成]。通過2-ΔΔCt法計算RANKL、RANK、OPG mRNA相對表達量。見表1。

表1 引物序列

1.3.9 Western Blot法檢測骨組織RANKL/RANK/OPG通路蛋白表達：取1.3.8中剩余右側股骨組織，勻漿后蛋白裂解液裂解，離心后取上清，BCA法檢測蛋白含量，按一定比例(4∶1)加入樣品緩沖液，95℃煮沸5 min，離心后取上清進行SDS-PAGE電泳。轉膜(PVDF膜)、封閉2 h。加入RANKL、RANK、OPG、GAPDH(內(nèi)參)一抗(稀釋比分別為1∶1 000、1∶5 000、1∶2 000、1∶5 000)，4℃孵育過夜，洗膜加入二抗37℃孵育2 h，洗膜。ECL顯影，測定各蛋白條帶的灰度值。

2 結果

2.1 6組大鼠血清骨代謝標志物的表達情況比較 與對照組相比，模型組大鼠血清CBF-α1、PINP、OC水平降低(P<0.05)；與模型組相比，土貝母苷甲低劑量組CBF-α1、PINP水平升高，土貝母苷甲高劑量組、OPG組血清CBF-α1、PINP、OC水平升高(P<0.05)；與土貝母苷甲高劑量組相比，土貝母苷甲高劑量+OPG組血清CBF-α1、PINP、OC水平升高(P<0.05)。見表2。

表2 6組大鼠血清骨代謝標志物的含量比較

2.2 6組大鼠股骨機械強度比較 與對照組相比，模型組大鼠股骨最大負荷、斷裂撓度降低(P<0.05)；與模型組相比，土貝母苷甲高劑量組、OPG組大鼠股骨最大負荷升高(P<0.05)；與土貝母苷甲高劑量組相比，土貝母苷甲高劑量+OPG組大鼠股骨最大負荷升高(P<0.05)。見表3。

表3 6組大鼠股骨最大負荷和斷裂撓度比較

2.3 6組大鼠骨密度及骨小梁微結構參數(shù)比較 與對照組相比，模型組大鼠BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th降低，Tb.Sp升高(P<0.05)；與模型組相比，土貝母苷甲低劑量組、土貝母苷甲高劑量組、OPG組大鼠BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th升高，Tb.Sp降低(P<0.05)；與土貝母苷甲高劑量組相比，土貝母苷甲高劑量+OPG組大鼠BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th升高，Tb.Sp降低(P<0.05)。見表4。

表4 6組大鼠骨密度及骨小梁微結構參數(shù)比較

2.4 6組大鼠骨組織形態(tài)的變化 對照組大鼠可見完整骨小梁形態(tài)，結構清晰，排列整齊且網(wǎng)狀；模型組大鼠骨小梁數(shù)量明顯減少且出現(xiàn)斷裂，排列疏松，孔隙變大；土貝母苷甲低、高劑量組、OPG組可見新生骨小梁，數(shù)量有所增多，形態(tài)相對完整；土貝母苷甲高劑量+OPG組骨小梁形態(tài)進一步恢復。見圖1。

對照組 模型組 土貝母苷甲低劑量組

2.5 6組大鼠骨組織RANKL/RANK/OPG通路相關蛋白的表達比較 與對照組相比，模型組大鼠骨組織OPG mRNA與蛋白表達降低，RANKL、RANKmRNA與蛋白表達升高(P<0.05)；與模型組相比，土貝母苷甲低劑量組、土貝母苷甲高劑量組、OPG組大鼠骨組織OPG mRNA與蛋白表達升高，RANKL、RANK mRNA與蛋白表達降低(P<0.05)；與土貝母苷甲高劑量組相比，土貝母苷甲高劑量+OPG組大鼠骨組織OPG mRNA與蛋白表達升高，RANKL、RANK mRNA與蛋白表達降低(P<0.05)。見圖2，表5。

表5 6組大鼠骨組織RANKL/RANK/OPG通路相關蛋白的表達

圖2 6組大鼠骨組織RANKL/RANK/OPG通路相關蛋白的表達;A 對照組；B 模型組；C 土貝母苷甲低劑量組；D 土貝母苷甲高劑量組；E OPG組；F 土貝母苷甲高劑量+OPG組

2.6 6組大鼠骨表面破骨細胞數(shù)量 與對照組相比，模型組大鼠破骨細胞/骨表面的平均數(shù)量(N.Oc/BS)增多(P<0.05)；與模型組相比，土貝母苷甲高劑量組、OPG組大鼠N.Oc/BS降低(P<0.05)；與土貝母苷甲高劑量組相比，土貝母苷甲高劑量+OPG組大鼠N.Oc/BS降低(P<0.05)。見圖3，表6。

對照組 模型組 土貝母苷甲低劑量組

表6 6組大鼠骨表面的破骨細胞數(shù)量比較

3 討論

骨骼內(nèi)穩(wěn)態(tài)是基于成骨細胞與破骨細胞的微妙平衡介導的，成骨/破骨細胞的失衡會破壞骨微結構，造成OP。OP是糖尿病的主要并發(fā)癥之一，可能是由胰島素抵抗造成的內(nèi)分泌失調導致，增加患者脆性骨折風險，這通常帶來發(fā)病率與危及生命的死亡率升高，并帶來沉重的經(jīng)濟負擔。對糖尿病性OP的治療方法以及發(fā)病機制進行研究有其臨床意義。

本研究通過高脂高糖飲食+腹腔注射鏈脲佐菌素復制糖尿病性OP模型，發(fā)現(xiàn)血糖值>16.7 mmol/L，BMD<對照組平均BMD 2.5個標準差，提示造模大鼠符合本研究試驗條件。

近年來，中藥在藥物開發(fā)方面做出了突出貢獻。諸多研究證實中藥復方或中藥提取物靶向破骨細胞是治療OP的重要方法，如當歸補血湯[9]、葛根芩連湯[10]、絞股藍總皂苷[11]等。土貝母苷甲是從中藥土貝母中提取的活性物質，被證明有抗腫瘤特性，如土貝母苷甲可通過誘導活性氧介導的自噬溶酶體累積受損增加結直腸癌細胞對化療敏感[12]。土貝母苷甲對破骨細胞有一定保護作用，Wang等[4]研究顯示，土貝母苷甲可通過抑制破骨細胞分化對去卵巢模型小鼠的OP有保護作用。何峰等[13]研究顯示，滌痰散結藥物在類風濕關節(jié)炎中有應用，土貝母是其中發(fā)揮藥效的藥物之一。

本研究發(fā)現(xiàn)，模型大鼠BMD明顯降低、骨小梁微結構受損嚴重。土貝母苷甲低高劑量組大鼠BMD升高，骨小梁微小結構部分恢復，血清CBF-α1、PINP、OC含量升高，三點彎曲結果顯示OP大鼠的最大負荷和斷裂撓度顯著升高。CBF-α1、PINP、OC是骨代謝中的關鍵標志物，CBF-α1是成骨細胞分化的關鍵轉錄因子，血清PINP含量可反應1型膠原合成速率與骨轉換情況；血清OC與骨組織OC正相關[14]。Micro-CT能夠很好的評價骨小梁微結構，TRAP染色可評估破骨細胞數(shù)目，本研究發(fā)現(xiàn)土貝母苷甲處理后大鼠骨小梁微結構參數(shù)BV/TV、Tb.N、Tb.Th明顯增加，Tb.Sp和N.Oc/BS明顯降低，提示土貝母苷甲可能通過抑制破骨細胞的生成，有效改善OP大鼠的骨代謝失衡和骨微結構。

RANKL/RANK/OPG通路在破骨細胞的發(fā)展中發(fā)揮關鍵作用，RANKL/RANK相結合可促進破骨細胞的活化以實現(xiàn)體內(nèi)平衡與宿主防御，OPG可與RANK競爭RANKL，進而抑制破骨細胞生成[15,16]。Li等[17]研究發(fā)現(xiàn)RANKL刺激后，激活ERK、p38和JNK、MAPK磷酸化促進破骨細胞成熟，抑制此通路可有效抑制破骨細胞成熟和骨吸收。

本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，模型大鼠骨組織RANKL、RANK mRNA水平與蛋白水平均升高，OPG mRNA水平與蛋白水平均降低，土貝母苷甲處理大鼠骨組織RANKL、RANK mRNA水平與蛋白水平較模型組降低，而OPG mRNA水平與蛋白水平較模型組升高，外源性OPG與土貝母苷甲處理發(fā)揮相同作用。在土貝母苷甲高劑量組基礎上添加OPG，大鼠骨組織RANKL、RANK mRNA水平與蛋白水平進一步升高，OPG mRNA水平與蛋白水平進一步降低，提示土貝母苷甲可能通過抑制RANKL/RANK/OPG通路發(fā)揮預防糖尿病性OP大鼠骨質流失作用。

綜上所述，土貝母苷甲可能通過抑制RANKL/RANK/OPG通路，減少糖尿病性OP大鼠破骨細胞形成，抑制骨流失，緩解OP。