余鵬，王咪，沈錦濤，劉洪飛，程韶，李慧英

1.河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 450046； 2.上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海 201203； 3.河南省中醫(yī)院/河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450002； 4.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450000

膝骨性關(guān)節(jié)炎(knee osteoarthritis，KOA)作為常見的慢性骨關(guān)節(jié)疾病，使無數(shù)患者深受病痛折磨。隨著對KOA研究的深入，研究人員對其復(fù)雜的發(fā)病機(jī)制也有了新認(rèn)識。由于關(guān)節(jié)軟骨自我修復(fù)與損傷的動態(tài)平衡被打破，軟骨細(xì)胞合成與分解失衡，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)破壞，其基本病理變化為異常的軟骨細(xì)胞分化或肥大、衰老及死亡[1]。關(guān)節(jié)軟骨由致密的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmatrix，ECM)構(gòu)成，僅包含一種細(xì)胞類型——軟骨細(xì)胞，因缺乏神經(jīng)、血管及淋巴管的穿行，關(guān)節(jié)軟骨的自我修復(fù)與內(nèi)在愈合能力有限。

鐵死亡作為鐵依賴性的新型細(xì)胞程序性死亡方式，主要包括鐵離子累積與脂質(zhì)過氧化兩個生物過程[2]。鐵離子過載會加速軟骨細(xì)胞分解代謝相關(guān)因子基質(zhì)金屬蛋白酶-13(matrix metalloproteinases-13，MMP-13)等的表達(dá)上調(diào)，降低軟骨細(xì)胞合成代謝因子聚集蛋白聚糖的表達(dá)[3]，并抑制Ⅱ型膠原蛋白的表達(dá)[4]。白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化物及其降解產(chǎn)物的積累，從而誘導(dǎo)鐵死亡，促使軟骨細(xì)胞的死亡[5]。缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia inducible factor-1，HIF-1)是軟骨分化過程中重要的調(diào)節(jié)因子，可以誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化，而鐵離子可以導(dǎo)致HIF-1失活，降低軟骨細(xì)胞的分化[6]。軟骨細(xì)胞的異常肥大是KOA病變的開始，基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)表明過量的鐵離子可以導(dǎo)致軟骨細(xì)胞優(yōu)先向肥大表型分化，從而加速軟骨退變[3]。因此，鐵死亡可以加速軟骨細(xì)胞的死亡，對KOA的發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生了重要影響。

目前，治療早中期KOA，外用或口服非甾體類消炎藥是首選[7]，但長期服用后可能會引起胃腸道及心血管疾病等不良事件的發(fā)生。目前治療KOA的中藥在臨床中雖然暫時沒有權(quán)威的循證醫(yī)學(xué)證據(jù)支持，但根據(jù)中醫(yī)辨證論治與遣方用藥，可以快速緩解癥狀，改善病情，且不良反應(yīng)小，顯示出獨(dú)特的優(yōu)勢[8]。研究表明，鐵過載誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞的退變，黃芪提取物刺芒柄花素可以降低軟骨細(xì)胞內(nèi)鐵濃度，通過靶向Nrf2/GPX4信號通路防止脂質(zhì)過氧化，調(diào)節(jié)鐵穩(wěn)態(tài)，延緩KOA的進(jìn)展[9]。淫羊藿苷通過激活Xc-/GPX4軸抑制鐵死亡，保護(hù)脂多糖誘導(dǎo)的滑膜細(xì)胞免于死亡[10]。目前關(guān)于中藥調(diào)節(jié)KOA患者軟骨細(xì)胞鐵死亡的研究較少，需要進(jìn)一步探索其治療機(jī)制。本研究基于鐵死亡對軟骨細(xì)胞的重要影響，運(yùn)用生物信息學(xué)與數(shù)據(jù)挖掘，探索在KOA中調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞鐵死亡的中藥靶點(diǎn)、化合物及用藥規(guī)律，為今后臨床及實(shí)驗(yàn)研究KOA鐵死亡的用藥提供一定幫助。

1 資料與方法

1.1 差異靶點(diǎn)收集及富集分析從GEO數(shù)據(jù)庫(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/)中下載關(guān)于膝骨性關(guān)節(jié)炎的轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)。搜索標(biāo)準(zhǔn)：①膝骨性關(guān)節(jié)炎；②人類；③軟骨細(xì)胞[11]。獲得轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)GSE114007。GSE114007數(shù)據(jù)包含18個正常軟骨組織，20個KOA軟骨組織。運(yùn)用軟件fastQC對數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控，Hisat2+featurecounts進(jìn)行數(shù)據(jù)比對與計(jì)數(shù)，DESeq2進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，篩選軟骨細(xì)胞差異基因的標(biāo)準(zhǔn)為|log2FC|>1，p-adj<0.05，獲得軟骨細(xì)胞差異基因。從FerrDb數(shù)據(jù)庫(http：//www.zhounan.org/ferrdb/)下載鐵死亡相關(guān)靶點(diǎn)。通過R語言將獲取的軟骨細(xì)胞差異基因與鐵死亡相關(guān)靶點(diǎn)取交集，得到軟骨細(xì)胞鐵死亡表達(dá)差異基因靶點(diǎn)，通過蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫UniProt(http：//www.uniprot.org)，將得到的差異基因靶點(diǎn)進(jìn)行映射，獲得相應(yīng)的基因靶點(diǎn)全稱，將沒有映射到的基因靶點(diǎn)剔除，余下的為潛在基因靶點(diǎn)。運(yùn)用R語言中“clusterProfiler”包進(jìn)行基因本體(gene ontology，GO)富集分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)信號通路分析。

1.2 構(gòu)建靶點(diǎn)-化合物網(wǎng)絡(luò)運(yùn)用TCMSP數(shù)據(jù)庫(http：//tcmsp-e.com)檢索潛在基因靶點(diǎn)所對應(yīng)的化合物，根據(jù)ADME參數(shù)常用指標(biāo)：口服利用度(OB)≥30%，類藥性(OL)≥0.18和Lipinski三規(guī)則[12]：相對分子質(zhì)量(MW)<500、脂水分配系數(shù)(AlogP)<5、氫鍵給體數(shù)目(Hdon)<5，篩選出候選化合物。利用cytoscape 3.9.1軟件構(gòu)建潛在靶點(diǎn)-候選化合物網(wǎng)絡(luò)，對該網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)進(jìn)行拓?fù)浞治?，得出干預(yù)軟骨細(xì)胞鐵死亡的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.3 構(gòu)建靶點(diǎn)-化合物-中藥網(wǎng)絡(luò)根據(jù)候選化合物，通過TCMSP數(shù)據(jù)庫，檢索相應(yīng)的中藥，運(yùn)用cytoscape 3.9.1軟件構(gòu)建潛在靶點(diǎn)-候選化合物-中藥網(wǎng)絡(luò)，通過網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析得出調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞鐵死亡的主要中藥及中藥調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞鐵死亡核心化合物。

1.4 統(tǒng)計(jì)中藥性味歸經(jīng)和用藥規(guī)律將收集到的中藥，與《中華人民共和國藥典》《中國臨床藥物大辭典》《中藥學(xué)》進(jìn)行匹配，獲取每味中藥的性味歸經(jīng)及治療作用，利用Excl統(tǒng)計(jì)納入中藥的性味歸經(jīng)及藥物作用類別。

1.5 分子對接驗(yàn)證通過PubChem數(shù)據(jù)庫(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)獲取1.3項(xiàng)下得到的核心化合物的3D分子結(jié)構(gòu)作為配體。將1.2項(xiàng)下獲取的關(guān)鍵靶點(diǎn)通過RCSB PDB數(shù)據(jù)庫(https：//www.rcsb.org/)篩選后得到與之相對應(yīng)的PDB ID號，作為蛋白受體，利用PyMOL軟件與 ADFR 軟件對蛋白受體進(jìn)行去水、加氫預(yù)處理。將預(yù)處理后的蛋白受體與化合物配體利用SailVina final軟件轉(zhuǎn)化為pdbqt格式文件，通過AutoDock Vina進(jìn)行分子對接。在PyMOL軟件中將分子對接的文件進(jìn)行可視化展示，利用R包pheatmap對分子對接的結(jié)果進(jìn)行可視化處理，并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析驗(yàn)證。

2 結(jié)果

2.1 軟骨細(xì)胞與鐵死亡差異靶點(diǎn)通過軟件DESeq2分析得到軟骨細(xì)胞差異靶點(diǎn)4 004個，從FerrDb數(shù)據(jù)庫獲取鐵死亡相關(guān)靶點(diǎn)487個，取二者交集之后得到63個靶點(diǎn)，通過UniProt數(shù)據(jù)庫匹配后，刪除未匹配到的3個靶點(diǎn)，最終獲得60個軟骨細(xì)胞鐵死亡差異靶點(diǎn)。運(yùn)用R包對差異靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析，結(jié)果顯示生物過程(biological Process，BP)有783條目，主要涉及細(xì)胞對營養(yǎng)水平、外界刺激、化學(xué)應(yīng)激及氧化應(yīng)激的反應(yīng)；細(xì)胞組分(cellularComponent，CC)有51條目，主要涉及分子細(xì)胞膜(過氧化物酶體膜、細(xì)胞基膜等)及因子復(fù)合物(轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復(fù)合物、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶復(fù)合物等)；細(xì)胞功能有96條目，主要涉及鐵離子結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子活性與結(jié)合等，詳見圖1A。對差異靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG信號通路分析，結(jié)果顯示共有45個信號通路，主要涉及鐵死亡、HIF-1信號通路、破骨細(xì)胞分化、IL-17信號通路等，詳見圖1B。

注：A：GO分析；B：KEGG分析圖1 軟骨細(xì)胞鐵死亡差異靶點(diǎn)分析

2.2 潛在靶點(diǎn)-候選化合物網(wǎng)絡(luò)將60個差異靶點(diǎn)通過TCMSP數(shù)據(jù)庫進(jìn)行匹配，有16個差異靶點(diǎn)可以匹配到相應(yīng)化合物，根據(jù)ADME參數(shù)和Lipinski三規(guī)則，最終符合納入標(biāo)準(zhǔn)的有993個化合物，將其作為候選化合物，對應(yīng)9個軟骨細(xì)胞鐵死亡相關(guān)靶點(diǎn)，將其作為潛在靶點(diǎn)，潛在靶點(diǎn)信息詳見表1。構(gòu)建潛在靶點(diǎn)-候選化合物網(wǎng)絡(luò)，通過網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析發(fā)現(xiàn)，關(guān)聯(lián)靶點(diǎn)最多的化合物為漢黃芩素、漆黃素、川陳皮素、尼泊爾鳶尾異黃酮、異鼠李素，分別對應(yīng)的靶點(diǎn)為5、5、4、4、4，關(guān)聯(lián)化合物的潛在核心靶點(diǎn)為PTGS2、DPP4、PPARG、CDKN1A、RELA、NQO1。選取度值>1的潛在靶點(diǎn)及其候選化合物構(gòu)建潛在靶點(diǎn)-候選化合物網(wǎng)絡(luò)，詳見圖2。

2.3 潛在靶點(diǎn)-候選化合物-中藥網(wǎng)絡(luò)在TCMSP數(shù)據(jù)庫中，根據(jù)候選化合物匹配篩選中藥，統(tǒng)計(jì)中藥386味，將中藥與潛在靶點(diǎn)和候選化合物構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析。分析結(jié)果顯示關(guān)聯(lián)化合物度值排名前7位的中藥為甘草、丹參、延胡索、降香、鉤藤、黃芩、苦地丁，度值依次為80、48、46、27、26、25、21，詳見圖3A。關(guān)聯(lián)中藥的化合物，根據(jù)度值中位數(shù)及經(jīng)驗(yàn)判斷，選取候選化合物度值>10的為核心候選化合物，總共有17個化合物，前5位化合物分別為山柰酚、木樨草素、異鼠李素、刺槐素、芒柄花黃素，詳見表2。通過候選化合物的橋接作用，統(tǒng)計(jì)得到作用于5個靶點(diǎn)的中藥有骨碎補(bǔ)、半枝蓮、枳實(shí)、麻黃、女貞子，詳見圖3B，因此推測這5味中藥可能對軟骨細(xì)胞鐵死亡干預(yù)效果較好，可嘗試將其作為研究治療KOA的作用藥物。以中藥及候選化合物度值>4為標(biāo)準(zhǔn)，構(gòu)建潛在靶點(diǎn)-候選化合物-中藥網(wǎng)絡(luò)，詳見圖4。

表1 軟骨細(xì)胞鐵死亡潛在靶點(diǎn)

圖2 潛在靶點(diǎn)-候選化合物網(wǎng)絡(luò)圖

圖3 調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞鐵死亡的中藥

表2 中藥調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞鐵死亡核心化合物(度值>10)

圖4 潛在靶點(diǎn)-候選化合物-中藥網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 中藥性味歸經(jīng)及用藥規(guī)律將2.3項(xiàng)下統(tǒng)計(jì)到的386味中藥，根據(jù)《中華人民共和國藥典》《中藥學(xué)》及《中國臨床藥物大辭典》進(jìn)行性味歸經(jīng)及治療作用統(tǒng)計(jì)，剔除未收錄的中藥38味，最終統(tǒng)計(jì)348味中藥。結(jié)果表明納入的中藥性味以寒溫并重，苦、辛、甘味藥為主，歸肝、肺、脾胃經(jīng)的中藥為主，詳見表3。以清熱類中藥最多(70味)，其次是補(bǔ)虛類和活血化瘀類中藥，詳見圖5。

表3 中藥性味歸經(jīng)頻數(shù)統(tǒng)計(jì)表 (次)

圖5 調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞鐵死亡的中藥作用類別頻數(shù)分布

2.5 分子對接驗(yàn)證結(jié)果6個潛在關(guān)鍵靶點(diǎn)經(jīng)RCSB PDB數(shù)據(jù)庫篩選后，CDKN1A未匹配到相應(yīng)的PDB ID號，將其刪除，其余5個關(guān)鍵靶點(diǎn)的PDB ID號分別為PTGS2(PDB ID：5IKQ)，DPP4(PDB ID：5T4B)，PPARG(PDB ID：3V9V)，RELA(PDB ID：6NV2)，NQO1(PDB ID：1KBQ)，隨后將5個關(guān)鍵靶點(diǎn)與17個核心化合物進(jìn)行分子對接。分子對接的Affinity值<-4.25 kcal·mol-1表示配體與受體之間有結(jié)合活性，Affinity值<-5.00 kcal·mol-1表示二者之間的結(jié)合活性較佳，Affinity值<-7.00 kcal·mol-1表示二者之間有很強(qiáng)的結(jié)合活性[13]。對接結(jié)果顯示，最小值為-9.22 kcal·mol-1，最大值為-5.96 kcal·mol-1，所有對接的Affinity值均<-5.00 kcal·mol-1，說明關(guān)鍵靶點(diǎn)與核心化合物之間均有較好的結(jié)合活性，也從一定程度上證明篩選干預(yù)軟骨細(xì)胞鐵死亡的中藥作用靶點(diǎn)與化合物的可靠性。其中靶點(diǎn)DPP4、PPARG與所有核心化合物的結(jié)合能均<-7 kcal·mol-1，表明這些化合物與關(guān)鍵靶點(diǎn)有更佳的結(jié)合能力，可能在中藥干預(yù)軟骨細(xì)胞鐵死亡中有著關(guān)鍵作用，詳見圖6。根據(jù)Affinity值、潛在關(guān)鍵靶點(diǎn)與核心化合物，選取5對受體與配體分子對接后的結(jié)果進(jìn)行可視化展示，分別為PTGS2-liteolin(木樨草素)、DPP4-isorham-netin(異鼠李素)、PPARG-kaempferol(山柰酚)、RELA-formononetin(芒柄花黃素)、NQO1-acacetin(刺槐素)，詳見圖7。

圖6 關(guān)鍵靶點(diǎn)與核心化合物分子對接的結(jié)果熱圖

注：A：PTGS2-liteolin(木樨草素)；B：DPP4-isorhamnetin(異鼠李素)；C：PPARG-kaempferol(山柰酚)；D：RELA-formononetin(芒柄花黃素)；E：NQO1-acacetin(刺槐素)圖7 關(guān)鍵靶點(diǎn)與核心化合物分子對接示意圖

3 討論

研究表明鐵死亡屬于免疫性細(xì)胞死亡，其許多產(chǎn)物被證明是炎癥介質(zhì)[14]。KOA的病理過程是一個慢性炎癥反應(yīng)的過程，鐵死亡對于KOA的發(fā)病與治療均有較大影響，可以作為治療與預(yù)防KOA新的研究方向。中藥在干預(yù)鐵死亡方面擁有巨大的潛力，當(dāng)前，關(guān)于中藥干預(yù)軟骨細(xì)胞鐵死亡的研究較少。本研究以鐵死亡相關(guān)靶點(diǎn)為切入點(diǎn)，構(gòu)建靶點(diǎn)、化合物及中藥網(wǎng)絡(luò)，探索三者之間的關(guān)聯(lián)，探尋調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞鐵死亡的中藥及用藥規(guī)律。

通過GO功能富集分析及KEGG信號通路分析發(fā)現(xiàn)，60個軟骨細(xì)胞鐵死亡差異靶點(diǎn)主要集中在鐵死亡信號通路、HIF-1信號通路及白細(xì)胞介素-1β信號通路中，這與鐵死亡干預(yù)KOA的發(fā)病過程是相吻合的，也證明了差異靶點(diǎn)的可靠性。HIF-1α是人體生長發(fā)育過程中關(guān)節(jié)軟骨形成的核心，可以促進(jìn)軟骨祖母細(xì)胞的分化，并能抑制軟骨細(xì)胞的異常肥大，鐵離子可以降低HIF-1α活性，抑制HIF-1信號通路，從而加速軟骨退變[6]。在 IL-1β誘導(dǎo)的炎癥環(huán)境中，軟骨細(xì)胞會發(fā)生鐵死亡相關(guān)蛋白表達(dá)的變化，促進(jìn)MMP13表達(dá)，抑制Ⅱ型膠原蛋白表達(dá)，從而加速KOA的進(jìn)展[5]。

構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)后關(guān)聯(lián)化合物的潛在核心靶點(diǎn)為PTGS2、DPP4、PPARG、CDKN1A、RELA、NQO1。其中PTGS2又稱為環(huán)氧化酶-2，可以編碼其產(chǎn)物前列腺素E2，加速KOA進(jìn)程[15]，同時高表達(dá)的PTGS2也是細(xì)胞發(fā)生鐵死亡過程中脂質(zhì)過氧化的生物標(biāo)記物[16]。研究表明，DPP4介導(dǎo)細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化，誘導(dǎo)腫瘤壞死因子的產(chǎn)生，導(dǎo)致鐵死亡的發(fā)生，加速軟骨細(xì)胞的衰老與死亡[17-18]。PPARG有較強(qiáng)的細(xì)胞抗氧化功能，提高PPARG表達(dá)水平，可以增強(qiáng)細(xì)胞的抗鐵死亡能力，積極參與哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號通路的調(diào)控，降低炎癥介質(zhì)水平[19-20]。CDKN1A誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞生長因子2的表達(dá)，抑制軟骨細(xì)胞的增殖與表達(dá)，p53介導(dǎo) CDKN1A 的表達(dá)，可以抑制鐵死亡的出現(xiàn)[18，21]。RELA是核轉(zhuǎn)錄因子-κB信號通路中的關(guān)鍵分子，廣泛參與炎癥與免疫反應(yīng)，該通路激活后，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)增加，產(chǎn)生大量炎癥因子，誘導(dǎo)鐵死亡的發(fā)生。細(xì)胞內(nèi)活性氧的增加，會誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化的出現(xiàn)，從而提高NQO1的水平，可以增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化能力，激活抗氧化信號通路，抑制鐵死亡[22-23]。

篩選得到的中藥關(guān)聯(lián)的核心化合物中，根據(jù)動物實(shí)驗(yàn)研究表明，山柰酚、木樨草素、異鼠李素、刺槐素、芒柄花黃素等化合物均可以降低相關(guān)炎癥因子的表達(dá)，抑制軟骨細(xì)胞的炎癥損傷，延緩KOA的發(fā)展[24-28]。其中山柰酚可以激活核因子紅細(xì)胞系2相關(guān)因子2/谷胱甘肽過氧化物酶4信號通路，增強(qiáng)了細(xì)胞的抗氧化能力，抑制細(xì)胞脂質(zhì)過氧化的積累，延緩鐵死亡的發(fā)生[29]。木樨草素因其較強(qiáng)的抗氧化及抗炎能力，可以抑制脂質(zhì)過氧化與鐵離子的累積，已成為靶向治療鐵死亡的新興天然化合物[30]。根據(jù)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析可知，關(guān)聯(lián)靶點(diǎn)最多的中藥為骨碎補(bǔ)、半枝蓮、枳實(shí)、麻黃、女貞子等，提示這幾味中藥可能是干預(yù)軟骨細(xì)胞鐵死亡關(guān)鍵中藥，可以為研究中藥治療KOA的作用機(jī)制及用藥思路提供一定方向。其中骨碎補(bǔ)的質(zhì)量標(biāo)志物柚皮苷可以防止軟骨基質(zhì)的降解，抑制 NF-κB 信號通路的激活，降低炎癥反應(yīng)，保護(hù)軟骨細(xì)胞[31]，同時柚皮苷調(diào)節(jié)鐵死亡參與的Nrf2/GPX4信號通路，下調(diào)活性氧水平，抑制鐵死亡[32]。半枝蓮的主要化合物燈盞花乙素通過調(diào)節(jié)核轉(zhuǎn)錄因子-κB及Nrf2信號通路，逆轉(zhuǎn)KOA中聚集蛋白聚糖及Ⅱ型膠原蛋白的低表達(dá)，降低軟骨細(xì)胞中的炎癥表達(dá)[33]。分子對接結(jié)果表明，所篩選的關(guān)節(jié)靶點(diǎn)與核心化合物是合理與可靠的，推測在中藥干預(yù)軟骨細(xì)胞鐵死亡中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。

干預(yù)軟骨細(xì)胞鐵死亡的中藥藥性為寒溫并重，臨床中膝骨性關(guān)節(jié)炎的證候是復(fù)雜多變的，單純寒證或單純熱證并不多見，多數(shù)為寒熱錯雜的病證，用藥也需要寒性藥與溫性藥并用。中藥藥味以苦、辛、甘為主，苦味能泄，能燥，即清熱瀉火燥濕；辛味能行，即行氣行血，活血化瘀；甘味能補(bǔ)，能緩，即補(bǔ)虛扶正，緩急止痛。這與膝骨性關(guān)節(jié)炎中醫(yī)證候類型的用藥是相吻合的。篩選的中藥主要?dú)w肝、肺及脾胃經(jīng)，肝主筋，筋附于骨而聚于關(guān)節(jié)，且肝藏血，是鐵離子主要儲存場所，肝主疏泄，肺主治節(jié)，肝升肺降，一升一降，升降協(xié)調(diào)，共同調(diào)節(jié)人體氣機(jī)及氣血運(yùn)行，對人體的生理功能有著重要的調(diào)節(jié)作用。脾胃為后天之本，脾主運(yùn)化，胃主受納，外源性鐵元素的攝入主要通過食物，納運(yùn)協(xié)調(diào)，可以促進(jìn)鐵離子的正常吸收與代謝。根據(jù)用藥規(guī)律分析，干預(yù)軟骨細(xì)胞鐵死亡的中藥主要為清熱類、補(bǔ)虛類及活血化瘀類，這與所篩選出的中藥藥性相匹配，治療細(xì)胞鐵死亡時需要清熱消炎，行氣活血，補(bǔ)虛扶正。

本研究基于網(wǎng)絡(luò)信息學(xué)與數(shù)據(jù)挖掘，以軟骨細(xì)胞與鐵死亡為切入點(diǎn)，探究鐵死亡在KOA中的作用機(jī)制，分析中藥干預(yù)軟骨細(xì)胞鐵死亡關(guān)鍵靶點(diǎn)、核心化合物及用藥規(guī)律，為研究中醫(yī)藥治療KOA的作用機(jī)制提供新的思路與方法。本研究進(jìn)行了中藥的定性分析，可為后續(xù)進(jìn)行藥物定量驗(yàn)證研究提供依據(jù)。