吳瓊 崔利 張大偉 馬斌斌

(1.大連醫(yī)科大學附屬大連市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,遼寧 大連 116000；2.大連醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院神經(jīng)外科， 遼寧 大連 116000)

糖尿病性腦病(Diabetic encephalopathy,DE)現(xiàn)在被認為是糖尿病的并發(fā)癥,由于全球糖尿病的發(fā)病率增加，并且在越來越年輕的患者中發(fā)生，糖尿病腦病可能會增加。現(xiàn)有縱向研究表明，隨著時間的推移，糖尿病患者的認知功能會加速下降[1-2]。主要受影響的認知領(lǐng)域包括注意力、記憶力以及處理速度[3]。糖尿病與認知功能障礙之間的關(guān)系早在1922年的中就已提出[4]，發(fā)病原因與胰島素缺乏，對神經(jīng)營養(yǎng)因子、神經(jīng)遞質(zhì)、氧化和凋亡應(yīng)激源的表達產(chǎn)生有關(guān)，對其下游的影響進而導(dǎo)致神經(jīng)元的完整性、連通性缺陷和丟失，這也通常發(fā)生在仍在發(fā)育的大腦中[5]。金絲桃苷(hyperoside,Hyp)是一種植物來源的類黃酮，主要存在于水果、果汁(主要是黃烷醇、黃酮和花青素)和中藥中，具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎、保護心腦血管等作用[6-8]，臨床上已廣泛應(yīng)用于減輕炎癥、改善心血管功能等方面。然而，金絲桃苷能否通過激活A(yù)kt/GSK-3β通路保護高糖損傷下所致的HT22海馬神經(jīng)元氧化應(yīng)激及凋亡未見報道，因此本研究擬采用高糖誘導(dǎo)海馬HT22細胞損傷，探索金絲桃苷是否通過調(diào)控Akt/GSK-3β通路發(fā)揮抗氧化、抗細胞凋亡作用，為其臨床保護神經(jīng)細胞，防治腦尿病腦病相關(guān)疾病提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1試驗藥物 金絲桃苷為成都曼思特生物科技有限公司產(chǎn)品，純度≥98%。采用二甲基亞砜(DMSO)溶解后配成10 mmol/L金絲桃苷母液，在超凈臺內(nèi)采用0.22 μmol/L微孔濾器過濾除菌，實驗用藥時取少量母液稀釋成相應(yīng)濃度使用，其它放置-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2細胞 HT22細胞復(fù)蘇后接種于含有1%雙抗(青霉素-鏈霉素)、10%FBS、90%低糖DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基葡萄糖濃度正常(17 mmol/L)，置于37℃，體積分數(shù)5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當細胞融合率至70%～80%時，傳代培養(yǎng)，選取對數(shù)生長期的細胞進行實驗。

1.3試劑 金絲桃苷購于成都曼思特生物科技有限公司；TCBN(triciribine，Akt inhibition)、p-Akt、p-Gsk3β、Caspase-3購于abcam公司；GAPDH抗體、二抗購于proteintect公司；低糖DMEM培養(yǎng)基購于Sigma公司；CCK8試劑購于Beyotime試劑公司；雙抗、胎牛血清購于hyclone公司；活性氧檢測試劑盒、BCA法蛋白檢測試劑盒、ECL顯影劑、Hoechst染色試劑盒、線粒體膜電位檢測試劑盒、凋亡檢測試劑盒購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.4儀器 細胞微孔板成像系統(tǒng)cytation5(美國Biotek公司)；倒置相差顯微鏡(日本奧林巴斯公司)；電泳儀、垂直電泳槽、化學發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)(美國伯樂公司)；二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo公司)；低溫高速離心機(德國sigma公司)。

1.5方法

1.5.1分組與給藥 HT22細胞分為對照組、高糖處理組、金絲桃苷組和TCBN組。對照組:正常培養(yǎng)HT22細胞；高糖處理組:培養(yǎng)基中加入50 mmol/L高糖培養(yǎng)作用48 h;金絲桃苷組:培養(yǎng)基中分別加入100 μmol/L金絲桃苷預(yù)處理2 h后加入50 mmol/L高糖培養(yǎng)48 h;TCBN抑制劑組:培養(yǎng)基中加入金絲桃苷100 μmol/L+1 μmol/L TCBN預(yù)處理2 h，然后加入50 mmol/L高糖培養(yǎng)48 h。

1.5.2增強型CCK-8檢測HT22細胞活力 取對數(shù)生長期的HT22細胞，經(jīng)胰蛋白酶消化后，分別以每孔1×105個接種于96孔板中，每孔100 μL，細胞培養(yǎng)24 h后加入藥物。使金絲桃苷終濃度為(0、25、50、100、200 μmol/L)的培養(yǎng)基培養(yǎng)或按照1.5.1的分組及給藥方式培養(yǎng)48 h,每個濃度設(shè)置3個復(fù)孔。每孔加入10 μL增強型CCK-8試劑，放入培養(yǎng)箱孵育1～4 h，于490 nm處測定OD值。

1.5.3DCFH-DA熒光探針檢測ROS水平 用無血清培養(yǎng)液按1∶1 000稀釋DCFH-DA，使終濃度為10 mmol/L。按照1.5.1分組及給藥方式培養(yǎng)后，吸去培養(yǎng)液，加入適量的DCFH-DA，充分蓋住細胞，37℃培養(yǎng)箱孵育20 min，用無血清培養(yǎng)基洗滌3次，于488 nm激發(fā)波長和525 nm發(fā)射波長，采用Cytation5觀察細胞內(nèi)ROS表達，放大倍數(shù)4倍。同一實驗平行重復(fù)3次。最后采用Image-Pro Plus 6.0軟件對結(jié)果進行熒光定量分析。

1.5.4免疫熒光染色測定JC-1 按照1.5.1分組及給藥方式培養(yǎng)48 h后,棄去培養(yǎng)基,PBS沖洗3次,加入1 mL JC-1染色工作液，于5% CO2培養(yǎng)箱中避光染色20 min，取出后用JC-1染色緩沖液沖洗2遍，置于Cytation5觀察JC-1表達。

1.5.5Hoechst 33342染色 按照1.5.1分組及給藥方式培養(yǎng)48 h后,室溫條件下，將HT22細胞在4%多聚甲醛中固定15 min，Triton-X 100透化20 min，將細胞用Hoechst 33342染色液在37°C下染色10 min，用PBS洗滌兩次。置于Cytation5下觀察Hoechst 33342染色。

1.5.6流式細胞儀測定各組HT22細胞凋亡率 按照1.5.1分組及給藥方式培養(yǎng)48 h后,分別收集各組細胞，取1×105個細胞，按說明處理細胞PBS洗滌細胞2次；加入500 μL Binding Buffer重懸細胞；分別加入5 μL Annexin V-FITC和PI室溫避光染色10 min，進行流式細胞儀檢測，分析細胞凋亡率，同一實驗平行重復(fù)3次。

1.5.7Western Blot測定蛋白表達 各組HT22細胞經(jīng)藥物處理作用48 h后，進行p-Akt、p-GSK-3β、Caspase-3蛋白測定。經(jīng)BCA法測定蛋白質(zhì)含量，進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，PAGE凝膠中蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，封閉。放入一抗中(1∶1 000)4℃雜交過夜。將PVDF膜經(jīng)TBST沖洗3次后放入二抗(1∶5000)孵育1～2 h。取出PVDF膜，TBST沖洗后，吸去多余液體，鋪于玻璃板上。將ECL試劑盒內(nèi)的detection reagent 1與detection reagent 2等體積混合后，均勻滴在PVDF膜上，反應(yīng)1～2 min。放置到化學發(fā)光凝膠系統(tǒng)分析儀中進行Ecl化學發(fā)光，成像，分析。

2 結(jié) 果

2.1金絲桃苷對高糖誘導(dǎo)HT22細胞活力的影響 為了證明金絲桃苷對HT22細胞的生物安全性，將不同劑量金絲桃苷加入到DME/F12培養(yǎng)基中以17 mmol/L葡萄糖作為正常葡萄糖條件作用48 h以確定金絲桃苷對HT22細胞活力的影響。CCK8檢測結(jié)果表明，金絲桃苷25、50、100 μmol/L濃度范圍內(nèi)對細胞活力沒有不利影響(P>0.05)，而200 μmol/L金絲桃苷降低細胞活力(P<0.01)見圖1A。與對照組相比，50 mmol/L高糖組HT22細胞活力明顯降低(P<0.01)，25 μmol/L金絲桃苷組對細胞活力沒有影響；50、100 μmol/L金絲桃苷組HT22細胞活力顯著上升，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見圖1B。以上結(jié)果提示100 μmol/L金絲桃苷對細胞活力沒有任何損傷，且對高糖損傷后細胞活力有明顯升高作用，表明100 μmol/L金絲桃苷可能是保護HT22免受損傷的最佳濃度，所以我們選擇100 μmol/L金絲桃苷用于后續(xù)實驗研究。

圖1 不同濃度金絲桃苷處理HT22細胞增殖活力的影響

2.2金絲桃苷對高糖誘導(dǎo)HT22細胞活性氧水平的影響 Cytation5結(jié)果顯示，與正常對照組相比，高糖損傷后細胞內(nèi)產(chǎn)生大量ROS,表現(xiàn)為強綠色熒光；金絲桃苷組ROS明顯被抑制，表現(xiàn)熒光強度降低；TCBN組細胞內(nèi)ROS增多，提示金絲桃苷保護作用被TCBN阻斷，以上結(jié)果提示金絲桃苷能夠減少或抑制高糖損傷后HT22細胞產(chǎn)生ROS，但這種保護作用能夠被TCBN阻斷，見圖2。

2.3金絲桃苷對高糖誘導(dǎo)HT22細胞JC-1水平的影響 Cytation5結(jié)果顯示,正常組細胞JC-1呈高紅低綠表達；與正常對照組相比，高糖損傷組JC-1呈高綠低紅表達；與高糖損傷組比較，金絲桃苷組能增加HT22細胞JC-1表達，紅色熒光增多，熒光增強，綠色熒光減少，熒光強度降低；與金絲桃苷組相比較，TCBN組JC-1表達紅色熒光減少，熒光強度降低，綠色熒光增多，熒光強度增加，總體呈高綠低紅熒光，見圖3。以上結(jié)果提示金絲桃苷能保護高糖損傷后HT22細胞線粒體損傷，保護HT22細胞發(fā)生早期凋亡,但這種保護作用能夠被TCBN所阻斷。

2.4金絲桃苷對高糖誘導(dǎo)HT22細胞Hoechst 33342染色的影響 Cytation5結(jié)果顯示,與對照組相比，高糖組明顯可見凋亡細胞增多；與高糖組相比，金絲桃苷組凋亡細胞數(shù)減少；與金絲桃苷組相比較，TCBN組凋亡細胞增多，以上結(jié)果提示金絲桃苷對高糖損傷HT22細胞凋亡具有保護作用，而這種作用能夠被TCBN所阻斷。見圖4。

2.5金絲桃苷對高糖誘導(dǎo)HT22細胞凋亡的影響 流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，與正常對照組相比，高糖組HT22細胞凋亡比例為38.21%，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01);與高糖組相比，金絲桃苷組作用HT22細胞48 h后，細胞凋亡比例數(shù)減少，下降至15.74%，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與金絲桃苷組相比，TCBN組HT22細胞凋亡明顯增多，從金絲桃苷組15.74增至25.71%，兩組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。以上結(jié)果表明金絲桃苷能保護高糖損傷HT22所導(dǎo)致的細胞凋亡，但這種保護作用被TCBN所阻斷。見圖5。

2.6金絲桃苷對高糖誘導(dǎo)HT22細胞p-Akt、p-GSK3β、Caspase-3水平的影響 Western blot分析顯示，與正常對照組相比，高糖組p-Akt、p-GSK3β蛋白表達明顯減少(P<0.01),Caspase-3蛋白表達增加(P<0.01)；與高糖組相比，金絲桃苷組p-Akt、p-GSK3β蛋白表達水平升增加(P<0.01)，Caspase-3蛋白表達下降(P<0.01)；而TCBN組p-Akt、p-GSK3β、Caspase-3蛋白表達與高糖組相似，和金絲桃苷組結(jié)果相反。以上結(jié)果提示金絲桃苷可能通過激活A(yù)kt/GSK3β信號通路增加高糖損傷后HT22細胞p-Akt、p-GSK3β蛋白表達、降低Caspase-3蛋白表達，而TCBN能阻斷金絲桃苷這種作用。見圖6。

3 討 論

DE主要表現(xiàn)在認知功能、學習能力、智力發(fā)展和記憶恢復(fù)等方面，導(dǎo)致學業(yè)和專業(yè)表現(xiàn)受損，其機制主要與葡萄糖代謝紊亂、血管變化引發(fā)的腦內(nèi)多種結(jié)構(gòu)變化有關(guān)[9-10]。HT22海馬神經(jīng)元是參與認知、學習記憶的重要神經(jīng)元細胞，在不同因素(例如谷氨酸、高糖)刺激的情況下可發(fā)生神經(jīng)元凋亡[11-12]。高糖刺激后糖基化終產(chǎn)物、自由基等物質(zhì)堆積產(chǎn)生大量ROS,ROS促進細胞色素C(Cyt C)的釋放，進而導(dǎo)致體內(nèi)細胞損傷,線粒體膜下位下降，發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)。有研究表明細胞受損后首先表現(xiàn)在線粒體膜電位的改變，早于形態(tài)學的變化，是細胞凋亡的早期表現(xiàn)[13]。ROS、JC-1、細胞凋亡率檢測是反應(yīng)細胞氧化應(yīng)激和凋亡的主要指標。本次研究結(jié)果表明，HG作用后明顯增加ROS表達，JC-1表達下降，HT22細胞凋亡數(shù)明顯增加，而Hyp作用后能明顯抑制ROS產(chǎn)生，抑制JC-1下降，增加JC-1表達，減少HT22細胞凋亡，表明Hyp具有明顯的抗氧化應(yīng)激、抗凋亡作用，而Akt抑制劑TCBN能明顯阻斷Hyp的這種作用，但其體機制有待于進一步探討。

AKT(蛋白激酶B)/GSK-3β(糖原合成酶激酶-3)通路已被證明在神經(jīng)保護中發(fā)揮關(guān)鍵作用，通過刺激細胞增殖和抑制細胞凋亡來增強細胞生存。據(jù)文獻報道，萊菔硫烷通過激活A(yù)kt/GSK-3β信號通路改善糖尿病大鼠認知功能[14]。牛膝多肽可能通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt/GSK-3β通路發(fā)揮對神經(jīng)元凋亡的保護作用[15]。Akt是細胞存活和凋亡的重要調(diào)控因子,文獻報道[16]阿爾茨海默癥(Alzheimer’sDisease AD)患者大腦中的PI3K/Akt信號減弱。一般來說，在Akt激活的過程中，完全激活需要Ser473，因此Ser473磷酸化水平代表了Akt磷酸化的程度。激活的Akt磷酸化參與細胞生存、細胞周期、血管生成和代謝的靶蛋白，從而起到神經(jīng)保護作用[17]。選擇性下調(diào)Akt同時上調(diào)GSK-3β活性可能與腦功能失調(diào)的發(fā)病機制有關(guān)[18]。已有研究[19]表明，Akt活化可能在神經(jīng)退行性疾病中發(fā)揮治療作用。GSK-3β廣泛活躍，是PI3K/Akt細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵效應(yīng)因子。因此，GSK-3β依賴于細胞代謝、細胞死亡和存活等細胞過程[20]。本研究結(jié)果顯示，HG能減少p-Akt、p-GSK-3β蛋白表達，增加Caspase-3蛋白表達，與文獻報道一致[14-15]。而Hyp能明顯增加p-Akt、p-GSK-3β蛋白表達，降低Caspase-3蛋白表達，但加入Akt阻斷劑TCBN組結(jié)果與HG組相似，與Hyp組結(jié)果相反，以上結(jié)果提示，Hyp可能通過激活A(yù)kt/GSK-3β信號通路保護HT22細胞氧化應(yīng)激及凋亡。

綜上所述，本研究只是初步探討了體外實驗中Hyp的抗氧化應(yīng)激及抗凋亡作用與抑制ROS表達，保護線粒體膜電位，減少細胞凋亡有關(guān)，可能是通過激活A(yù)kt/GSK-3β信號通路來實現(xiàn)的，但其更深入的機制還需要在體內(nèi)動物模型中進一步驗證。