梁詩惠，馮鈺敏，鄧華榮，劉巧瑜，白衛(wèi)東，吳俊師，陳海光*

1(仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院 輕工食品學(xué)院，廣東省嶺南特色食品科學(xué)與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部嶺南特色食品綠色加工與智能制造重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，現(xiàn)代農(nóng)業(yè)工程創(chuàng)新研究院， 廣東 廣州，510225)2(深圳市金谷園實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司，廣東 深圳，518000)

冷凍肉不僅作為國家調(diào)節(jié)肉類食品市場(chǎng)的重要產(chǎn)品，也是肉制品在國內(nèi)運(yùn)輸及進(jìn)出口貿(mào)易的主要形態(tài)[1]。但是肉品在冷凍解凍過程中會(huì)引起蛋白質(zhì)和脂質(zhì)氧化，最終影響食用品質(zhì)。肌原纖維蛋白氧化是指肉類肌肉中的主要結(jié)構(gòu)蛋白及功能性蛋白發(fā)生了由活性氧、活性氮直接誘導(dǎo)的，或氧化生成的次級(jí)產(chǎn)物間接誘導(dǎo)的一些共價(jià)修飾。這些共價(jià)修飾會(huì)使蛋白質(zhì)發(fā)生一些不可逆改變，如蛋白變性、結(jié)構(gòu)損傷等，最終影響食品的食用品質(zhì)[2]。

近年來，關(guān)于解凍方式對(duì)肉類蛋白質(zhì)氧化的研究很多。王琳琳等[3]主要研究5種不同解凍方式對(duì)牦牛肉蛋白氧化功能特性及新鮮度的影響，研究發(fā)現(xiàn)牦牛肉經(jīng)空氣解凍后，其肌原纖維蛋白氧化程度最大，具體表現(xiàn)為羰基含量、表面疏水性指數(shù)最高，巰基含量和Ca2+-ATPase活性最低。蔡璐昀等[4]研究不同超聲輔助解凍對(duì)海鱸魚肌原纖維蛋白理化性質(zhì)的影響，發(fā)現(xiàn)超聲微波解凍方式對(duì)海鱸魚蛋白質(zhì)的降解程度影響較小，該方式可以更好地維持海鱸魚蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。劉磊等[5]用不同解凍方式(低溫解凍、流水解凍和微波解凍)對(duì)鵝腿肉進(jìn)行解凍，以拉曼光譜的測(cè)定結(jié)果表征蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化，發(fā)現(xiàn)低溫解凍對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響較小，流水解凍的影響較大。

本文以冷凍雞腿肉為研究對(duì)象，在前期研究基礎(chǔ)上，探究室溫解凍、流水解凍、冷藏解凍、微波解凍4種解凍方式對(duì)蛋白質(zhì)氧化程度、蛋白質(zhì)聚集或降解情況、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)以及組織學(xué)特性方面進(jìn)行研究，探討不同解凍方式對(duì)冷凍雞腿肉肌原纖維蛋白的影響，以明確不同解凍方式對(duì)雞肉品質(zhì)影響的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

冷凍雞腿肉(厚度為1 cm的雞腿塊)，深圳市金谷園實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司；三氯乙酸、無水乙醇(均為分析純)，天津市百世化工有限公司；2,4-二硝基苯肼、鹽酸胍(均為分析純)，南京圣比奧生物科技公司；三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl 緩沖液)，上海麥克林生化科技有限公司；超微量Ca2+-ATPase試劑盒，南京建成生物工程研究所；雙縮脲試劑盒，上海源葉生物科技有限公司。

JY600C電泳儀，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；RT—6000酶標(biāo)分析儀，深圳雷社生命科學(xué)股份有限公司；XploRA PLUS共聚焦拉曼光譜儀，堀場(chǎng)(中國)貿(mào)易有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 解凍方式

(1)室溫解凍(A)。將冷凍雞腿肉樣品(20±0.5) ℃的室溫下解凍，用數(shù)字溫度計(jì)測(cè)得雞腿肉中心溫度為0 ℃即可。

(2)流水解凍(B)。將冷凍雞腿肉樣品置于流水下進(jìn)行解凍，保持流速恒定。用數(shù)字溫度計(jì)測(cè)得雞腿肉中心溫度為0 ℃即可。

(3)冷藏解凍(C)。將冷凍雞腿肉樣品放入冰箱中進(jìn)行4 ℃冷藏解凍，用數(shù)字溫度計(jì)測(cè)得雞腿肉中心溫度為0 ℃即可。

(4)微波解凍(D)。將冷凍雞腿肉樣品用保鮮袋裝好后放入微波爐中進(jìn)行解凍，用數(shù)字溫度計(jì)測(cè)得雞腿肉中心溫度為0 ℃即可。

1.2.2 肌原纖維蛋白(myofibrillar protein，MP)的提取

參考LIU等[6]的方法并稍作修改，從雞腿肉中分離提取MP。將雞腿肉和預(yù)冷的Tris-HCl緩沖液(0.1 mol/L KCl溶液和20 mmol/L Tris-HCl溶液，pH 7.0)按料液比1∶4(g∶mL)用高速勻漿機(jī)以10 000 r/min的速度勻漿3次。用20目篩網(wǎng)過濾后離心(5 000 r/min，4 ℃，離心15 min)。上清液倒出，將顆粒收集為粗MP。重復(fù)上述步驟4次，獲得高質(zhì)量的MP。整個(gè)過程均在4 ℃下進(jìn)行。

1.2.3 羰基含量的測(cè)定

測(cè)定羰基的方法按照LEVINE等[7]方法進(jìn)行修改，方法如下：準(zhǔn)確稱取質(zhì)量0.1 g雞肉糜加入0.9 mL的勻漿介質(zhì)進(jìn)行勻漿后離心(2 500 r/min，10 min)，使用雙縮脲法測(cè)定上清液的蛋白濃度。同時(shí)取0.45 mL蛋白溶液與0.05 mL的緩沖溶液混勻后離心(11 000 r/min，10 min)。取0.1 mL上清液，加入0.4 mL 2, 4-二硝基苯肼的鹽酸溶液(空白樣品反應(yīng)液中不含2, 4-二硝基苯肼)，37 ℃下避光反應(yīng)30 min，加入0.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%的三氯乙酸，振蕩后離心(12 000 r/min，10 min)。將蛋白沉淀用1 mL的V(乙醇)∶V(乙酸乙酯)=1∶1溶液洗滌4次，加1 mL鹽酸胍溶液(6 mol/L)，在37 ℃下水浴15 min溶解沉淀，離心(12 000 r/min，15 min)。取上清液于370 nm處測(cè)定吸光值，使用摩爾吸光系數(shù)計(jì)算。

1.2.4 巰基含量的測(cè)定

參考BEVERIDGE等[8]的Ellman試劑分析方法并稍加改動(dòng)測(cè)定MP總巰基，將提取好的MP用20 mmol/L pH 6的磷酸鹽緩沖液稀釋至質(zhì)量濃度為5 mg/mL的MP溶液。吸取10 μL肌原纖維蛋白溶液和150 μL Ellman試劑到酶標(biāo)板孔中，劇烈振蕩使其反應(yīng)完全，以不加2-硝基苯甲酸[5,5′-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid)，DTNB]組為對(duì)照，在405 nm處測(cè)定吸光值，計(jì)算蛋白總巰基含量。

1.2.5 表面疏水性的測(cè)定

參照CHELH等[9]的方法稍作修改，取5 mL MP溶液(5 mg/mL)與1 mL溴酚藍(lán)溶液(1 mg/mL)混合均勻后2 000 r/min離心15 min。以無MP的磷酸鹽緩沖液為空白對(duì)照，上清液稀釋10倍后在595 nm處測(cè)定吸光度。以溴酚藍(lán)結(jié)合量來計(jì)算，如公式(1)所示：

(1)

1.2.6 Ca2+-ATPase活性的測(cè)定

Ca2+-ATPase活性按試劑盒說明進(jìn)行測(cè)定。

1.2.7 SDS-PAGE分析

將提取好的MP用緩沖液稀釋至質(zhì)量濃度為40 mg/mL的MP溶液。采用MARINO等[10]的方法進(jìn)行試驗(yàn)，使用4%濃縮膠和12%分離膠來分析解凍后樣品的蛋白質(zhì)變化。

1.2.8 組織學(xué)特性

參考JIANG等[11]的方法并進(jìn)行修改：將樣品切成小塊后用4%多聚甲醛浸泡24 h，再用70%～95%乙醇溶液梯度脫水1 h，經(jīng)二甲苯透明處理后再包埋、染色。用CaseViewer軟件進(jìn)行分析。使用10×的物鏡倍數(shù)，截取片段，以及隨機(jī)選取5個(gè)點(diǎn)測(cè)量其肌纖維間隙，每點(diǎn)共測(cè)量10組肌纖維直徑的數(shù)據(jù)。

1.2.9 肌原纖維蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定

參考袁麗等[12]的方法稍作修改，將MP均勻涂抹在載玻片上，采用激發(fā)波長532 nm，曝光時(shí)間8 s，循環(huán)15次，衰減程度25%，波數(shù)為400～2 000 cm-1測(cè)定參數(shù)隨機(jī)選取的3個(gè)位置進(jìn)行測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

所有試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。用IBM SPSS Statistics 19軟件進(jìn)行顯著性分析，用Origin 2018制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同解凍方式對(duì)雞腿肉羰基含量的影響

羰基是肽鍵斷裂和氨基酸側(cè)鏈被自由基氧化生成的主要產(chǎn)物之一，是判斷肌原纖維蛋白氧化程度的重要指標(biāo)之一[13]。蛋白氧化會(huì)使包裹在蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的氨基酸暴露，使羰基化合物的生成量增多[14]。由圖1可知，室溫解凍雞腿肉中羰基含量最高(3.63 nmol/mg)，微波解凍次之(3.24 nmol/mg)，二者之間差異并不顯著(P>0.05)。這與侯曉榮等[15]的研究結(jié)果相似，其研究發(fā)現(xiàn)中國對(duì)蝦在微波解凍時(shí)因溫度較高從而導(dǎo)致羰基化合物的生成量偏大。冷藏解凍的羰基含量較低(2.04 nmol/mg)，也可能是因?yàn)榈蜏匾种屏说鞍酌富钚?。流水解凍方式下的羰基含量最?p<0.05)，為0.97 nmol/mg，說明流水解凍方式下生成的羰基化合物較少，氧化程度較輕。

圖1 不同解凍方式對(duì)雞腿肉羰基含量的影響Fig.1 Effect of different thawing methods on the carbonyl content of chicken thigh meat注：不同小寫字母代表顯著性差異(P<0.05)下同

2.2 不同解凍方式對(duì)雞腿肉巰基含量的影響

研究表明，冷凍解凍過程中，巰基容易發(fā)生氧化生成二硫鍵以及生成相應(yīng)的共價(jià)化合物，從而導(dǎo)致巰基含量降低[16]。由圖2可知，冷藏解凍的巰基含量(285.23 μmol/g)顯著高于其他3種解凍方式(P<0.05)，說明低溫解凍方式對(duì)雞腿肉的總巰基損失影響較小，這與崔燕等[17]提出的低溫高濕解凍可以有效降低鯧魚巰基的氧化速度的研究結(jié)果一致。流水解凍的疏基含量次之，為188.31 μmol/g,氧化程度相對(duì)較低。室溫解凍的巰基含量最低(110.55 μmol/g)，可能原因是解凍溫度較高且解凍時(shí)間較長，導(dǎo)致該組樣品的肌球蛋白頭部結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，巰基間的相互作用導(dǎo)致蛋白質(zhì)的聚集作用更加強(qiáng)烈[18]。就巰基含量這一指標(biāo)而言，冷藏解凍方式優(yōu)于其他3種解凍方式。

圖2 不同解凍方式對(duì)雞腿肉巰基含量的影響Fig.2 Effect of different thawing methods on the sulfhydryl content of chicken thigh meat

2.3 不同解凍方式對(duì)雞腿肉表面疏水性的影響

表面疏水性表征的是蛋白質(zhì)分子表面疏水性氨基酸的相對(duì)含量，是評(píng)估蛋白構(gòu)象穩(wěn)定性的重要指標(biāo)之一[19]。不同解凍方式對(duì)冷凍雞腿肉表面疏水性的影響如圖3所示，微波解凍的表面疏水性(16.43 μg)，顯著高于其他3種解凍方式(P<0.05)，這說明微波解凍會(huì)改變肌原纖維蛋白的構(gòu)象，使蛋白質(zhì)發(fā)生降解作用及變性作用，蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水基團(tuán)大量暴露，最終導(dǎo)致表面疏水性含量增高[20]。流水解凍的表面疏水性最低，為10.36 μg(P<0.05)，說明流水解凍方式下的雞腿肉的蛋白構(gòu)象變化較小。冷藏解凍由于解凍溫度低，能夠有效抑制微生物的生長，抑制蛋白的變性程度，因此其表面疏水性較低(12.86 μg)，這與陳勝[21]的研究結(jié)果相似。

圖3 不同解凍方式對(duì)雞腿肉表面疏水性的影響Fig.3 Effect of different thawing methods on the surface hydrophobicity of chicken thigh meat

2.4 不同解凍方式對(duì)雞腿肉Ca2+-ATPase活性的影響

Ca2+-ATPase活性主要源自肌球蛋白，Ca2+-ATPase活性的降低可能是因?yàn)榧∏虻鞍椎那驙铑^部結(jié)構(gòu)發(fā)生改變以及蛋白質(zhì)分子的聚集[22]。由圖4可知，室溫解凍對(duì)雞腿肉的Ca2+-ATPase活性影響程度最大，Ca2+-ATPase活性為0.72 U/mg，說明室溫解凍與其他3種解凍方式相比，酶活性損失較大，該種解凍方式對(duì)肌球蛋白的影響較大，肌球蛋白變性程度嚴(yán)重。有學(xué)者認(rèn)為，Ca2+-ATPase活性與巰基的變化有關(guān)，肌球蛋白頭部巰基的氧化會(huì)使Ca2+-ATPase活性下降[23]。研究發(fā)現(xiàn)室溫解凍的巰基含量最低，這可能是導(dǎo)致室溫解凍組Ca2+-ATPase活性較低的原因。

圖4 不同解凍方式對(duì)雞腿肉Ca2+-ATPase活性的影響Fig.4 Effect of different thawing methods on the Ca2+-ATPase activity of chicken thigh meat

2.5 不同解凍方式對(duì)雞腿肉SDS-PAGE的影響

SDS-PAGE分析可以反映蛋白是否發(fā)生氧化，其蛋白亞基是否發(fā)生降解或聚集反應(yīng)[24]。不同解凍方式對(duì)雞腿肉肌原纖維蛋白SDS-PAGE的影響如圖5所示。通過比對(duì)分子質(zhì)量可以辨別出圖中由上到下依次為肌球蛋白重鏈(myosin heavy chain，MHC)、副肌球蛋白(paramyosin)、肌動(dòng)蛋白(actin)、肌球蛋白輕鏈(myosin light chain，MLC)，其中MHC和actin是主要的蛋白質(zhì)條帶。在本研究中，4種解凍方式中MHC條帶邊緣模糊，蛋白有降解現(xiàn)象；actin條帶的變化差異并不明顯；MLC條帶則有明顯變化，有發(fā)生降解或聚集。MLC條帶中冷藏解凍條帶顏色變深，分子質(zhì)量增大，發(fā)生了聚集；室溫解凍條帶顏色最弱，說明該組的肌原纖維蛋白降解程度較大。

圖5 不同解凍方式下雞腿肉的SDS-PAGE圖譜Fig.5 SDS-PAGE profiles of chicken thigh meat with different thawing methods

2.6 不同解凍方式對(duì)雞腿肉組織結(jié)構(gòu)的影響

不同解凍方式對(duì)肌束膜的破壞有不同程度的影響，肌束膜一旦遭受破壞，其肌肉組織的完整性和致密結(jié)構(gòu)也會(huì)受到影響[22]，具體表現(xiàn)為肌纖維間隙變大，肌肉保水性下降，汁液損失嚴(yán)重等。不同解凍方式雞腿肉的縱切面如圖6所示。結(jié)合表1數(shù)據(jù)可知，室溫解凍的肌纖維間隙較明顯，可能是因?yàn)殡u腿肉暴露在空氣中的時(shí)間較長導(dǎo)致的蛋白變性，引起肌肉松弛，肌纖維間隙增大[22]。流水解凍后的雞腿肉的肌纖維間隙較小，肌束結(jié)合相對(duì)緊密，說明流水解凍方式的保水性較好。冷藏解凍的肌纖維間隙僅次于流水解凍，可能是低溫抑制了蛋白酶活性和肌纖維降解。微波解凍后的雞腿肉出現(xiàn)明顯的肌原纖維收縮斷裂的現(xiàn)象，這可能是因?yàn)槲⒉ń鈨鲞^程中樣品局部加熱導(dǎo)致部分肉熟化甚至過度脫水，從而導(dǎo)致其肌纖維間隙增大，組織結(jié)構(gòu)的緊密性下降，結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重[25]。

a-室溫解凍；b-流水解凍；c-冷藏解凍；d-微波解凍圖6 不同解凍方式對(duì)雞腿肉組織結(jié)構(gòu)的影響Fig.6 Effect of different thawing methods on the tissue structure of chicken thigh meat

表1 不同解凍方式對(duì)雞腿肉肌纖維間距的影響Table 1 Effect of different thawing methods on muscle fiber spacing of chicken thigh meat

2.7 不同解凍方式對(duì)肌原纖維蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

酰胺Ⅰ帶(1 600～1 700 cm-1)是反映蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的主要譜帶[26]。包括β-折疊(1 615～1 637 cm-1)、無規(guī)則卷曲(1 640～1 648 cm-1)、α-螺旋(1 650～1 664 cm-1)、β-轉(zhuǎn)角(1 673～1 686 cm-1)[27]。

利用軟件PeakFit v 4.12對(duì)拉曼圖譜進(jìn)行擬合分析得到圖7和圖8。如圖7所示，不同解凍方式對(duì)冷凍雞腿肉MP結(jié)構(gòu)有顯著影響。就拉曼峰的相對(duì)強(qiáng)度來看，流水解凍組樣品的拉曼強(qiáng)度要高于其他3種解凍方式，室溫解凍組的拉曼強(qiáng)度最低。說明室溫解凍破壞了肌原纖維蛋白原有的二級(jí)結(jié)構(gòu)，形成了新的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。由圖8可知，流水解凍組α-螺旋含量最高(58%)，表明蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)狀態(tài)良好，穩(wěn)定性強(qiáng)[12]，由此說明流水解凍對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響最小。而微波解凍組α-螺旋含量最少(29%)，β-折疊含量相對(duì)較高(18%)，這可能是因?yàn)榻鈨鲞^程中受熱不均，且局部熟化導(dǎo)致α-螺旋向其他結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化[20]，從而導(dǎo)致其蛋白質(zhì)穩(wěn)定性降低。雞腿肉經(jīng)室溫解凍后，β-轉(zhuǎn)角含量(26%)和無規(guī)則卷曲含量(31%)相對(duì)較高，無規(guī)則卷曲含量越多，則說明蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)紊亂，蛋白質(zhì)的變性程度大[12]，因此室溫解凍組的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性較差。

a-室溫解凍;b-流水解凍；c-冷藏解凍；d-微波解凍圖7 不同解凍方式對(duì)肌原纖維蛋白的拉曼光譜擬合曲線圖Fig.7 Raman spectrum fitting curve of myofibrillar protein by different thawing method

圖8 不同解凍方式對(duì)肌原纖維蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu) 分布比例的影響Fig.8 Effect of different thawing method on the distribution ratio of myofibrillar protein secondary structure

3 結(jié)論

試驗(yàn)結(jié)果表明，室溫解凍的羰基含量(3.63 nmol/mg)、巰基含量(110.55 μmol/g)和Ca2+-ATPase活性(0.72 U/mg)最低，蛋白氧化最為嚴(yán)重；肌球蛋白輕鏈條帶模糊，有輕微降解現(xiàn)象；拉曼強(qiáng)度最低，且β-折疊和無規(guī)則卷曲含量相對(duì)較高，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性較差。流水解凍的羰基含量(0.97 nmol/mg)和表面疏水性最低(10.36 μg)， Ca2+-ATPase活性最高(2.95 U/mg)，其蛋白氧化程度較輕，組織結(jié)構(gòu)緊密；拉曼強(qiáng)度和α-螺旋含量(58%)最高，蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)完整性較好。冷藏解凍的巰基含量最高(258.23 μmol/g)，巰基損失較?。患∏虻鞍纵p鏈條帶聚集；微波解凍的組織結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，有肌纖維斷裂和肌纖維間隙增大等現(xiàn)象；蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)較紊亂，α-螺旋結(jié)構(gòu)向其他無序結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化。綜上所述，流水解凍對(duì)冷凍雞腿肉的蛋白影響較小，是較為理想的解凍方式。