劉迎雪，陸信曜，宗紅，諸葛斌

(工業(yè)生物技術教育部重點實驗室(江南大學)，江南大學工業(yè)微生物研究中心，江蘇 無錫，214122)

植物活性成分因種類豐富、功能多樣、天然有機而廣受關注[1]。與化學方法相比，植物發(fā)酵技術能夠提高天然植物成分的活性，具有環(huán)境友好、條件溫和等優(yōu)點。大量研究證實，植物發(fā)酵提取物(plant fermentation extract，PFE)具有抗氧化[2]、抗菌[3]、抑制黑色素生成[4]等特性，已被廣泛應用于功效化妝品中，如葡萄發(fā)酵面膜、海藻發(fā)酵精華、蘭薔薇發(fā)酵卸妝油等。

微生物通過水解反應等釋放原料中的植物活性物[5]，并能進一步通過改造或修飾得到一些用化學方法難以制備的生物活性化合物[6]。多項研究表明，發(fā)酵可促進植物底物中有效成分轉(zhuǎn)化為高生物活性化合物，如發(fā)酵促進黃芩素轉(zhuǎn)化為抗炎活性更強的漢黃芩素[7]，發(fā)酵赤芍不僅提高了總酚類化合物含量而且生成新的化合物鄰苯三酚[8]，表明植物發(fā)酵技術是提高植物提取物活性物質(zhì)含量及其功能性的有效手段[9]。

不同植物中活性化合物種類和含量的差異會直接影響PFE功能性，葡萄籽多酚、枸杞多糖、銀杏葉黃酮、荷葉生物堿是備受關注的植物活性成分。本文制備上述植物材料水和乙醇提取物以篩選高抗氧化活性植物底物，并使用不同菌株與篩選得到的植物底物制備PFE，分析發(fā)酵對其活性物質(zhì)和功能性的影響，探討植物與菌株間的相互作用，以期找到適配的發(fā)酵菌株與植物底物組合，為制備葡萄籽/枸杞PFE提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及設備

葡萄糖、NaCl、乙醇、NaOH，國藥集團上?；瘜W試劑公司；蛋白胨、酵母提取物，英國Oxoid公司；蘆丁，北京伊諾凱科技有限公司；沒食子酸，上海泰坦科技股份有限公司；酪氨酸酶，Merck公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼，上海阿拉丁化學試劑有限公司；卡那霉素，生工生物工程(上海)股份有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

HYL-C組合式恒溫搖床，太倉市強樂實驗設備有限公司；TU-1810紫外分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；synergy H4多功能酶標儀，美國伯騰儀器有限公司；FreeZone 4.5L冷凍干燥機，美國Labconco公司；TSQ8000三重四級桿氣質(zhì)聯(lián)用儀，賽默飛世爾科技有限公司。

1.2 實驗材料及菌株

葡萄籽、荷葉，淘寶貴臣旗艦店；枸杞，京東桂小俠官方旗艦店；銀杏葉，淘寶奢然旗艦店；布拉氏酵母CNCM I-3856，從法國樂斯福酵母益生菌固體飲料分離；鼠李糖乳桿菌LRH113，從樂力益生菌活菌調(diào)理凍干粉分離；ATCC 25922大腸桿菌O157:H7、ATCC 25923金黃色葡萄球菌，本研究室保藏。

1.3 實驗方法

1.3.1 材料處理、培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

葡萄籽和枸杞于-40 ℃冷凍48 h后粉碎成渣，荷葉和銀杏葉粉碎成渣，4 ℃保存。

酵母浸出粉胨葡萄糖(yeast extract peptone dextrose medium, YPD)培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉10.0，蛋白胨20.0，葡萄糖20.0。MRS(de Man,Rogosa and Sharpe)培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10.0，牛肉膏10.0，酵母膏5.0，檸檬酸氫二銨2.0，葡萄糖20.0，乙酸鈉5.0，K2HPO42.0，MgSO40.5，MnSO40.3，吐溫80 1.0 mL。LB(Luria-Bertani)培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉5.0，蛋白胨10.0，NaCl 10.0。固體培養(yǎng)基加入瓊脂20.0 g/L；121 ℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：YPD培養(yǎng)基/MRS培養(yǎng)基50.0 mL中加入2.0 g葡萄籽渣/枸杞渣。

發(fā)酵方法：250 mL三角瓶中發(fā)酵培養(yǎng)基裝液量為50.0 mL，初始OD600為0.1。布拉氏酵母30 ℃，200 r/min培養(yǎng)60 h。鼠李糖乳桿菌37 ℃靜置培養(yǎng)60 h。

葡萄籽/枸杞未發(fā)酵對照：250 mL三角瓶中裝水50.0 mL，滅菌后不接種菌株，于30 ℃，200 r/min提取60 h。菌株對照：發(fā)酵培養(yǎng)基不添加植物底物，其余操作同“發(fā)酵方法”，所有實驗設置3個平行。

水提取物和乙醇(φ=60%)提取物：50.0 mL水/乙醇中加入2.0 g葡萄籽、枸杞、荷葉、銀杏葉渣，于37 ℃超聲中處理15 min，離心取上清液并定容至50.0 mL。

1.3.2 總酚(total phenolic content, TPC)、總黃酮(total flavonoid content, TFC)和多糖測定

參考ISLAM等[10]的方法測定總酚和總黃酮，結果以1 mL PFE中沒食子酸當量(mg GAE/mL PFE)和1 mL PFE中蘆丁當量(mg RE/ mL PFE)表示。以水為空白對照排除溶劑本底及實驗設備等可能對實驗造成的影響。參考國標QB/T 5176—2017《枸杞多糖》方法測定多糖。

1.3.3 抗氧化活性測定和酪氨酸酶抑制活性

參考謝東東等[11]的方法測定DPPH自由基清除率和羥自由基(·OH)清除率。參考KONDO等[12]的方法測定酪氨酸酶抑制活性。

1.3.4 菌株胞外酶活力測定

蛋白酶活性測定參考梅源等[13]的方法。脂肪酶活性測定參考鄭曉梅[14]的方法。β-葡萄糖苷酶活性測定參考曾鈺等[15]的方法。

1.3.5 抑菌活性

發(fā)酵液冷凍干燥后稀釋至200 g/L。參考LI等[16]的方法測定其對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌抑菌活性。以游標卡尺用十字交叉法測量抑菌圈直徑。用卡那霉素(0.03 g/L)作為陽性對照，以水為空白排除溶劑本底及環(huán)境等其他因素可能對實驗造成的影響。

1.3.6 其他測定方法

生物量利用分光光度計測定培養(yǎng)液在600 nm處吸光值。GC-MS參考付依依等[17]方法，使用Xcalibur工作站利用面積歸一化法計算各組分峰面積百分比(相對含量)。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

試驗所做平行次數(shù)均為3次，取平均值進行數(shù)據(jù)分析；采用Excel進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，Origin 2019繪圖，采用SPSS 26.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。

2 結果與分析

2.1 高抗氧化活性植物底物篩選及發(fā)酵

葡萄籽、枸杞、銀杏葉、荷葉的水提取物和60%乙醇提取物均具備清除自由基的能力，但差異較大。其中枸杞提取物對DPPH自由基和羥自由基的清除率分別為(51.4±0.2)%和(80.4±1.4)%，而葡萄籽提取物雖然·OH清除能力不突出，但DPPH自由基清除能力最優(yōu)(圖1)，所以選擇葡萄籽和枸杞制備PFE。

利用2種益生菌(布拉氏酵母和鼠李糖乳桿菌)研究發(fā)酵對葡萄籽和枸杞功能性的影響。制備PFE依賴于微生物代謝，但植物中部分物質(zhì)會影響微生物生長[18]。本文中葡萄籽和枸杞對鼠李糖乳桿菌影響較小，卻導致布拉氏酵母生長能力下降(圖1-c)。

2.2 植物底物對胞外酶活性的影響

微生物分泌的蛋白酶、脂肪酶能夠分解植物底物，促進產(chǎn)品的生物活性。發(fā)酵組蛋白酶活性較菌株對照均有顯著提高(P<0.05)，表明植物化學物質(zhì)對微生物分泌上述酶有誘導作用(圖2-a)。菌株對照中脂肪酶活性無差異，添加葡萄籽/枸杞后鼠李糖乳桿菌組脂肪酶活性提高了1.2～1.3倍，但布拉氏酵母僅在發(fā)酵葡萄籽時檢測到脂肪酶酶活力(圖2-b)。β-葡萄糖苷酶是釋放結合于碳水化合物、有機酸上活性成分的主要水解酶[5]，僅鼠李糖乳桿菌PFE中檢測到β-葡萄糖苷酶活性(圖2-c)。以上結果表明發(fā)酵過程中植物底物誘導菌株分泌上述酶表達，且不同植物底物的誘導能力存在差異。

a-DPPH自由基清除率;b-·OH清除率;c-植物基培養(yǎng)基中菌株生物量圖1 高抗氧化活性植物底物篩選及其對菌株生物量的影響Fig.1 Screening of plant substrates with high antioxidant activity and their effect on the biomass of fermentation strains注：圖中小寫字母不同表示有顯著性差異(P<0.05)(下同)

a-蛋白酶活力;b-脂肪酶活力;c-β-葡萄糖苷酶活力圖2 發(fā)酵體系中酶活性測定Fig.2 Determination of enzyme activity in fermentation systems

2.3 發(fā)酵提取物中活性成分分析

2.3.1 TPC、TFC和多糖含量

酚及黃酮類物質(zhì)含量是評價植物發(fā)酵提取物品質(zhì)的重要指標之一。未發(fā)酵對照中未檢出TPC和TFC。鼠李糖乳桿菌發(fā)酵后TPC和TFC含量顯著提高，葡萄籽中PFE分別為(4.3±0.2)mg GAE/mL PFE和(1.0±0.1)mg RE/mL PFE(表1)。研究發(fā)現(xiàn)，糖苷酶、蛋白酶等多種酶參與了乳酸菌生物轉(zhuǎn)化提高TPC和TFC含量的過程[19]。本研究PFE中TPC(r=0.915，P=0.01<0.05)和TFC(r=0.823，P=0.012<0.05)含量與蛋白酶活性呈正相關，表明分泌蛋白酶是TPC和TFC含量積累的重要原因。有研究稱酵母菌較乳酸菌提取酚及黃酮能力較弱[20]，本文中布拉氏酵母組僅葡萄籽發(fā)酵PFE中檢測到TPC和TFC含量，且TPC僅為鼠李糖乳桿菌發(fā)酵的47.5%，這與發(fā)酵體系中的酶活性結果一致。此外乳酸菌發(fā)酵形成低pH環(huán)境有利于活性成分的溶出并降低酚及黃酮類物質(zhì)的氧化損失[19]。此前研究中酵母及乳酸菌制備PFE中TPC和TFC含量僅0.5 mg GAE/mL PFE和0.1 mg RE/mL PFE，其蛋白酶活性和淀粉酶活性僅(1.10±0.07)和(0.17±0.02)U/mL[21]，本文中高TPC和TFC含量是布拉氏酵母和鼠李糖乳桿菌高酶活力的結果。

表1 植物發(fā)酵提取物中TPC,TFC和多糖含量Table 1 TPC, TFC and polysaccharide in PFE

與未發(fā)酵對照相比，發(fā)酵結束時葡萄籽中多糖下降了42.3%，枸杞多糖下降了35.2%～40.1%，微生物生長代謝會利用多糖化合物，但同時發(fā)生生物轉(zhuǎn)化修飾多糖并提高其抗氧化活性[22]。此外，TPC、TFC均具有抗氧化能力，因此多糖總量的下降可能不會導致產(chǎn)品抗氧化活性的降低。

2.3.2 PFE中揮發(fā)性化合物

發(fā)酵前后PFE中共檢測到73種揮發(fā)性化合物(volatile compounds, VOCs)，包括醇類20種、醛類6種、酮類7種、酯類14種、酸類14種、萜類5種、酚類3種、醚類4種?？偡迕娣e代表VOCs總量(排除少量硅氧烷雜質(zhì)峰)，發(fā)酵后VOCs總量均有提高，其中布拉氏酵母組PFE中醇類物質(zhì)占比大幅度提高，而鼠李糖乳桿菌主要提高了酸類化合物占比(圖3)。β-苯乙醇具有柔和的玫瑰香氣，布拉氏酵母發(fā)酵后葡萄籽PFE和枸杞PFE中β-苯乙醇相對含量提高至27.79%和53.76%。發(fā)酵促進天然抗氧化劑4-乙烯愈創(chuàng)木酚、2,4-二叔丁酚含量的提高[23-24]。橙花叔醇、橙花醇和2,3,5-三甲基吡嗪僅在PFE中檢出，據(jù)報道他們具有優(yōu)異的抑菌活性[25-26]?？啡┦?類致癌物質(zhì)，經(jīng)發(fā)酵糠醛被降解，表明微生物發(fā)酵能夠改變PFE物質(zhì)組成、分解抗營養(yǎng)化合物、增加活性化合物占比。

有機酸是PFE主要活性成分之一。由表2可知，鼠李糖乳桿菌發(fā)酵代謝合成多種有機酸，葡萄籽PFE和枸杞PFE中相對含量分別為67.3%和60.4%。發(fā)酵產(chǎn)生了6種新的有機酸：丁酸、異丁酸、2-甲基丁酸、己酸、月桂酸、苯甲酸，且乙酸、辛酸、壬酸、葡萄花酸相對含量提高，其中辛酸和壬酸是有效的抗菌劑[27]。

A-布拉氏酵母/葡萄籽；B-鼠李糖乳桿菌/葡萄籽；C-未發(fā)酵葡萄籽；D-布拉氏酵母/枸杞；E-鼠李糖乳桿菌/枸杞；F-未發(fā)酵枸杞 a-總峰面積;b-揮發(fā)性化合物數(shù)量;c-各類別揮發(fā)性化合物數(shù)量;d-各類別揮發(fā)性化合物相對百分含量圖3 發(fā)酵與未發(fā)酵體系中揮發(fā)性化合物Fig.3 Volatile compounds in fermented and unfermented systems

表2 植物發(fā)酵提取物中主要揮發(fā)性化合物Table 2 Major VOCs in PFE

續(xù)表2

續(xù)表2

2.4 PFE功效性分析

2.4.1 抗氧化活性

DPPH自由基清除率(以下簡稱RDPPH)和羥自由基清除率(以下簡稱ROH)是常見的抗氧化活性評價指標，多酚、黃酮、多糖和有機酸均具備抗氧化活性，因此對照組中雖未檢測出TPC和TFC但仍檢測到自由基捕捉能力。與未發(fā)酵葡萄籽/枸杞相比，PFE清除自由基能力明顯提高，且使用布拉氏酵母發(fā)酵葡萄籽RDPPH和鼠李糖乳桿菌發(fā)酵枸杞ROH提高效果較其他發(fā)酵組更為突出，分別為(75.2±3.0)%和(93.1±1.0)%(圖4-a和圖4-b)，表明菌株和植物特性會影響PFE抗氧化活性。

a-發(fā)酵結束時RDPPH;b-發(fā)酵結束時ROH;c-RDPPH隨PFE質(zhì)量濃度變化;d-ROH隨PFE質(zhì)量濃度變化圖4 植物發(fā)酵提取物自由基清除能力Fig.4 Free radical scavenging ability of PFE

為進一步分析發(fā)酵提取物的抗氧化特性，將發(fā)酵后的PFE冷凍干燥以考察其質(zhì)量濃度與RDPPH和ROH的關系(圖4-c和圖4-d)。RDPPH和ROH均隨PFE質(zhì)量濃度提高先快速增漲后趨于平緩，5.0 g/L時RDPPH和ROH可達(81.2±6.4)%(布拉氏酵母發(fā)酵葡萄籽)和(47.1±0.7)%(鼠李糖乳桿菌發(fā)酵葡萄籽)。進一步表明發(fā)酵能夠提高葡萄籽和枸杞的抗氧化活性。

2.4.2 酪氨酸酶抑制活性

酪氨酸酶的抑制活性是經(jīng)典美白能力評估指標。微生物促進活性成分釋放而提高PFE酪氨酸酶抑制率，發(fā)酵組在較低濃度下即有更好的表現(xiàn)。高質(zhì)量濃度下(20.0 g/L)，枸杞PFE分別為(65.0±2.9)%(布拉氏酵母)和(51.4±3.9)%(鼠李糖乳桿菌)，明顯高于對應葡萄籽組，與未發(fā)酵葡萄籽/枸杞結果一致(圖5-a)，表明植物底物特性會影響PFE酪氨酸酶抑制活性。然而枸杞發(fā)酵提取物的TPC和TFC含量并無優(yōu)勢，因此酚及黃酮物質(zhì)并非本文發(fā)酵產(chǎn)品中抑制酪氨酸酶活性的主要活性物質(zhì)。多糖和有機酸能夠通過與銅輔基結合抑制酪氨酸酶活性[28]。此外，抗氧化劑如4-乙烯基愈創(chuàng)木酚等能夠通過拮抗氧對酪氨酸酶的激活作用抑制酪氨酸酶活性[29]。因此，植物發(fā)酵提取物可以通過多因素協(xié)同作用抑制酪氨酸酶活性。

a-酪氨酸酶抑制活性;b-抑菌圈實驗照片圖[(1)-大腸桿菌; (2)-金黃色葡萄球菌]圖5 植物發(fā)酵提取物酪氨酸酶抑制活性及抑菌活性Fig.5 Tyrosinase inhibitory activity and bacteriostatic activity of PFE

2.4.3 抑菌活性

鼠李糖乳桿菌組抑菌活性整體優(yōu)于酵母組，對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑分別為(17.3±0.6)和(16.7±0.3)mm(鼠李糖乳桿菌發(fā)酵枸杞)(表3)。橙花叔醇、2,3,5-三甲基吡嗪、2,4-二叔丁酚、乙酸、丙二酸、正戊酸等通過發(fā)酵積累，是PFE中主要抑菌成分。此外，鼠李糖乳桿菌合成有機酸有助于提高PFE抑菌活性，發(fā)酵后葡萄籽和枸杞中有機酸相對含量由8.2%和4.5%提高到49.0%和54.7%。研究發(fā)現(xiàn)含有相同質(zhì)量濃度槲皮素的植物提取物對蠟狀芽孢桿菌抑制能力顯著優(yōu)于槲皮素純物質(zhì)，相同pH值的乙酸或乳酸卻沒有抑菌活性[30]。表明發(fā)酵提取物抑菌能力并非僅受單一因素影響，而是多種活性成分協(xié)同作用的結果。

表3 植物發(fā)酵提取物抑菌圈直徑Table 3 Diameter of antibacterial circle of PFE

3 結論與討論

本文篩選到2種高抗氧化活性植物材料并與布拉氏酵母、鼠李糖乳桿菌組合發(fā)酵。葡萄籽/枸杞誘導菌株分泌蛋白酶和/或脂肪酶和/或β-葡萄糖苷酶參與生物轉(zhuǎn)化作用，提高了PFE中活性物質(zhì)含量及其功能活性，改變了揮發(fā)性化合物組成及比例：4-乙烯愈創(chuàng)木酚、橙花醇、2,3,5-三甲基吡嗪、壬酸等揮發(fā)性活性化合物有所提高。不同PFE中活性物質(zhì)種類、含量及其功能活性有較大差異，其DPPH自由基清除率和·OH清除率最高可達(75.2±3.0)%(布拉氏酵母/葡萄籽PFE)和(93.1±1.0)%(鼠李糖乳桿菌/枸杞PFE)，酪氨酸酶抑制活性有顯著提高(P<0.05)，鼠李糖乳桿菌/枸杞PFE對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌抑菌圈直徑均在16.0 mm以上。綜上所述，本文中PFE可作為潛在的抗氧化、美白和抑菌成分。