劉英琦，施 喆，孫樹剛#，周麗媛，楊 勇，王曉輝(.河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院普外科，河北 邯鄲056000； .河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院婦科，河北 邯鄲 056000)

原發(fā)性肝癌是全球最常見的惡性腫瘤之一，主要包括肝細胞肝癌、膽管癌、肝母細胞瘤以及其他罕見類型的肝癌，其中肝細胞肝癌是原發(fā)性肝癌最常見的類型，據(jù)統(tǒng)計，肝癌在全球腫瘤相關(guān)性死亡中居第2位[1]。澳洲茄堿提取自中藥龍葵，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，澳洲茄堿具有廣泛抗腫瘤作用，如膀胱癌、膽管癌以及肺癌等[2-4]。Liu等[5]的研究結(jié)果表明，澳洲茄堿可在肝癌中發(fā)揮抗腫瘤作用。絲裂原激活的蛋白激酶(MAPK)/胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)信號通路主要參與調(diào)控細胞分化和凋亡，已有研究結(jié)果表明，該信號通路在肝癌中活化，ERK特異性抑制劑可減弱肝癌細胞增殖、侵襲和遷移能力[6]。因此，本研究以肝癌HepG2細胞為研究對象，探討澳洲茄堿是否能通過調(diào)節(jié)MAPK/ERK信號通路抑制肝癌細胞的惡性生物行為學(xué)。

1 材料與方法

1.1 細胞系

人肝癌細胞株HepG2購自美國ATCC公司。

1.2 儀器

SpectraMax iD5型多功能酶標(biāo)儀(美國MD公司)；DYY-6C型電泳儀(北京六一儀器廠)；CKX53型倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；OPTIMA XPN型低溫超速離心機(美國Beckman Coulter公司)；311型二氧化碳培養(yǎng)箱(美國Thermo Fisher公司)。

1.3 試劑

澳洲茄堿(純度≥98%，成都曼思特生物科技有限公司，批號：A0620)；四甲基偶氮唑鹽(MTT)試劑盒(美國Sigma公司，批號：M2003-1G)；超敏型BCA法蛋白定量試劑盒(上海碧云天生物科技有限公司，批號：P0012S)；胎牛血清和DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司，批號：6140079和12634010)；Matrigel基質(zhì)膠(美國BD公司，批號：356234)；MAPK/ERK信號通路激活劑異丙腎上腺素(ISO，美國MCE公司，批號：HY-12028)；兔抗人磷酸化絲裂原激活的蛋白激酶激酶(p-MEK)、絲裂原激活的蛋白激酶激酶(MEK)、磷酸化ERK(p-ERK)和ERK抗體(美國Abcam公司，批號：ab278716、ab195037、ab192591和ab32537)。

1.4 細胞培養(yǎng)

HepG2細胞常規(guī)培養(yǎng)，每日在顯微鏡下觀察，待細胞密度>80%時，胰蛋白酶消化傳代，第4代對數(shù)生長期細胞用于實驗。

1.5 MTT法測定澳洲茄堿對細胞存活率的影響

對數(shù)生長期細胞用DMEM培養(yǎng)基制成單細胞懸液，以每孔5×103個細胞的密度接種于96孔板，細胞貼壁生長后，采用不同濃度澳洲茄堿處理(0、10、20、30、40和50 μmol/L)，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，取出培養(yǎng)板，加MTT溶液20 μL，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，加二甲基亞砜100 μL，振蕩15 min，測定490 nm波長處的吸光度(A)值，計算細胞存活率(%)=藥物處理組A值/對照組A值×100%。取濃度為50 μmol/L的澳洲茄堿用于后續(xù)實驗。

1.6 MTT法測定各藥物對細胞存活率的影響

對數(shù)生長期細胞用DMEM培養(yǎng)基制成單細胞懸液，以每孔5×103個細胞的密度接種于96孔板，細胞貼壁生長后，隨機分為對照組、澳洲茄堿組、激動劑組以及激動劑+澳洲茄堿組，每組設(shè)置3個復(fù)孔，澳洲茄堿組細胞用50 μmol/L澳洲茄堿處理24 h，激動劑組細胞用ISO處理24 h，激動劑+澳洲茄堿組細胞用激動劑處理24 h后，50 μmol/L澳洲茄堿處理24 h。參照“1.5”項下方法測定細胞存活率。

1.7 劃痕實驗檢測細胞遷移能力

按照“1.6”項下方法進行實驗分組，各藥物處理24 h后，將細胞制成5×103的細胞懸液，接種于6孔板，待細胞貼壁生長后，使用100 μL無菌槍頭垂直培養(yǎng)板底部均勻劃線，以磷酸鹽緩沖液(PBS)將細胞碎片清洗掉，加入新的培養(yǎng)基置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后顯微鏡下拍照，計算劃痕愈合率，劃痕愈合率(%)=(0 h細胞劃痕距離-24 h細胞劃痕距離)/0 h細胞劃痕距離。

1.8 Transwell實驗檢測細胞侵襲能力

按照“1.6”項下方法進行實驗分組，各藥物處理24 h后，將細胞制成5×103的細胞懸液。將150 μL細胞懸液接種于鋪有Matrigel基質(zhì)膠的上室中，下室則加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基600 μL，將小室置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，濕棉簽將未侵襲細胞擦去，多聚甲醛固定小室20 min，結(jié)晶紫染色15 min，顯微鏡下觀察并計數(shù)穿膜細胞數(shù)，隨機取3～5個視野拍照。

1.9 蛋白質(zhì)印跡法檢測細胞中各蛋白表達

按照“1.6”項下方法進行實驗分組，各藥物處理24 h后，預(yù)冷PBS清洗3次，加入RIPA裂解，離心取上清液，采用蛋白定量試劑盒(BCA法)測定蛋白濃度，煮沸使蛋白質(zhì)變性。進行凝膠電泳，濃縮膠每孔加入蛋白樣品20 μL，設(shè)置電泳儀參數(shù)為120 V、2 h。電泳結(jié)束后，0.3 A恒流濕轉(zhuǎn)2 h，將蛋白濕轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜上。Tris鹽緩沖液(TBS)加入Tween-20制成的等滲緩沖鹽溶液(TBST)洗膜，室溫(25 ℃)封閉1 h，p-ERK、p-MEK、ERK、MEK和GAPDH抗體(1∶ 1 000)4 ℃孵育過夜，辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶ 5 000)室溫孵育2 h，TBST洗膜3次，超敏化學(xué)發(fā)光液顯色，Image J分析條帶灰度值，目的蛋白相對表達量=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參灰度值。

1.10 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 不同濃度澳洲茄堿對細胞存活率的影響

與0 μmol/L澳洲茄堿比較，10、20、30、40及50 μmol/L澳洲茄堿均可降低細胞存活率，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且具濃度依賴性，見圖1。

與0 μmol/L澳洲茄堿組相比，aP<0.05；與10 μmol/L澳洲茄堿組相比，bP<0.05；與20 μmol/L澳洲茄堿組相比，cP<0.05；與30 μmol/L澳洲茄堿組相比，dP<0.05；與40 μmol/L澳洲茄堿組相比，eP<0.05vs. 0 μmol/L solanine group, aP<0.05; vs. 10 μmol/L solanine group, bP<0.05; vs. 20 μmol/L solanine group, cP<0.05; vs. 30 μmol/L solanine group, dP<0.05; vs. 40 μmol/L solanine group, eP<0.05圖1 不同濃度澳洲茄堿對細胞存活率的影響Fig 1 Effects of different concentrations of solanine

2.2 不同藥物對細胞存活率的影響

四組細胞存活率比較，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與對照組比較，澳洲茄堿組細胞存活率降低(P<0.05)；與澳洲茄堿組比較，激活劑+澳洲茄堿組細胞存活率升高(P<0.05)；與激活劑組比較，激活劑+澳洲茄堿組細胞存活率降低(P<0.05)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。對照組與激活劑組細胞存活率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖2。

與對照組相比，aP<0.05；與澳洲茄堿組相比，bP<0.05；與激活劑組相比，cP<0.05Note: vs. the control group, aP<0.05; vs. the solanine group, bP<0.05; vs. the activator group, cP<0.05圖2 不同藥物對細胞存活率的影響Fig 2 Effects of different drugs on cell viability

2.3 不同藥物對細胞劃痕愈合率的影響

四組劃痕愈合率比較，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與對照組比較，澳洲茄堿組劃痕愈合率降低，激活劑組劃痕愈合率升高(P<0.05)；與澳洲茄堿組比較，激活劑+澳洲茄堿組劃痕愈合率升高(P<0.05)；與激活劑組比較，激活劑+澳洲茄堿組劃痕愈合率降低(P<0.05)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，見圖3。

與對照組相比，aP<0.05；與澳洲茄堿組相比，bP<0.05；與激活劑組相比，cP<0.05vs. the control group, aP<0.05; vs. the solanine group, bP<0.05; vs. the activator group, cP<0.05圖3 劃痕實驗檢測細胞遷移能力Fig 3 Migration ability of cells detected by scratch test n=3)

2.4 不同藥物對細胞侵襲能力的影響

四組侵襲細胞數(shù)比較，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與對照組比較，澳洲茄堿組侵襲細胞數(shù)減少，激活劑組侵襲細胞數(shù)增多(P<0.05)；與澳洲茄堿組比較，激活劑+澳洲茄堿組侵襲細胞數(shù)增多(P<0.05)；與激活劑組比較，激活劑+澳洲茄堿組侵襲細胞數(shù)減少(P<0.05)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，見圖4。

與對照組相比，aP<0.05；與澳洲茄堿組相比，bP<0.05；與激活劑組相比，cP<0.05vs. the control group, aP<0.05; vs. the solanine group, bP<0.05; vs. the activator group, cP<0.05圖4 結(jié)晶紫染色檢測細胞侵襲能力Fig 4 Cell invasion ability detected by crystal violet staining (×200, n=3)

2.5 不同藥物對細胞中各蛋白表達的影響

四組p-ERK和p-MEK蛋白相對表達量比較，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與對照組比較，澳洲茄堿組p-ERK和p-MEK蛋白相對表達量降低，激活劑組p-ERK和p-MEK蛋白相對表達量升高(P<0.05)；與澳洲茄堿組比較，激活劑+澳洲茄堿組p-ERK和p-MEK蛋白相對表達量升高(P<0.05)；與激活劑組比較，激活劑+澳洲茄堿組p-ERK和p-MEK蛋白相對表達量降低(P<0.05)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。ERK和MEK蛋白相對表達量各組間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖5。

與對照組相比，aP<0.05；與澳洲茄堿組相比，bP<0.05；與激活劑組相比，cP<0.05vs. the control group, aP<0.05; vs. the solanine group, bP<0.05; vs. the activator group, cP<0.05圖5 蛋白質(zhì)印跡法檢測細胞中p-ERK、ERK、p-MEK和MEK蛋白表達情況Fig 5 Protein expressions of p-ERK, ERK, p-MEK and MEK in cells detected by Western blotting n=3)

3 討論

肝癌早期不易發(fā)現(xiàn)，且診斷困難，肝癌細胞對放化療不敏感，臨床上常采用手術(shù)治療，但術(shù)后極易復(fù)發(fā)，且5年生存率僅約10%，因此，探索肝癌發(fā)生機制以及尋找有效的治療藥物對臨床治療肝癌具有重大而深遠的意義[7]。澳洲茄堿是糖苷生物堿。Zhang等[8]的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，澳洲茄堿可通過上調(diào)微小RNA(miR)-486-5p表達，抑制胃癌細胞生長，誘導(dǎo)胃癌細胞凋亡，增強胃癌細胞對化療藥的敏感性。Wang等[9]的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，澳洲茄堿通過抑制炎癥信號通路，可抑制膠質(zhì)瘤生長。已有研究結(jié)果表明，澳洲茄堿可誘導(dǎo)HepG2和Hep3b肝癌細胞凋亡[10]。但其具體機制尚不清楚。此外，Jin等[11]的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，澳洲茄堿通過谷胱甘肽過氧化物酶4誘導(dǎo)的谷胱甘肽氧化還原系統(tǒng)的破壞，促進肝癌細胞鐵死亡，從而發(fā)揮抗肝癌作用。本研究旨在探討澳洲茄堿對肝癌細胞的抑制作用及其機制。

本研究采用不同濃度澳洲茄堿處理肝癌細胞，結(jié)果顯示，與0 μmol/L澳洲茄堿比較，不同濃度澳洲茄堿均可降低細胞存活率，表明澳洲茄堿具有抗肝癌作用。ERK/MAPK信號通路參與多種腫瘤細胞惡性增殖[12-13]。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-452-5p通過激活ERK/MAPK正反饋環(huán)路促進結(jié)腸癌進展[14]。肺癌A549細胞中ERK/MAPK信號通路活化，抑制p-ERK1/2表達可減弱A549細胞的侵襲遷移能力[15]。He等[16]的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，缺氧誘導(dǎo)的長鏈非編碼RNA NPSR1-AS1通過使ERK1/2發(fā)生磷酸化，促進肝癌細胞增殖、遷移和侵襲，NPSR1-AS1沉默則抑制MAPK/ERK信號通路，發(fā)揮抗肝癌作用。Wang等[17]的研究結(jié)果表明，長鏈非編碼RNA LINC01503通過激活MAPK/ERK信號通路促進肝癌細胞惡性生物行為學(xué)。本研究為了進一步探索澳洲茄堿是否通過ERK/MAPK信號通路發(fā)揮抗肝癌作用，采用ERK/MAPK信號通路激活劑ISO激活該信號通路后給予澳洲茄堿處理。結(jié)果顯示，與對照組比較，激活劑組劃痕愈合率升高，侵襲細胞數(shù)增多；與激活劑組比較，激活劑+澳洲茄堿組細胞存活率和劃痕愈合率均降低，侵襲細胞數(shù)減少；與澳洲茄堿組比較，激活劑+澳洲茄堿組細胞存活率和劃痕愈合率均升高，侵襲細胞數(shù)增多。表明ERK/MAPK信號通路激活增強肝癌細胞增殖活性、遷移和侵襲能力。

MAPK信號通路參與多種生理病理過程，包括細胞增殖、分化和凋亡[18]。ERK是MAPK三條主要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一，受上游特異性刺激分子MEK1/2雙磷酸化激活，活化后以二聚體形式存在，并從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)位至細胞核，通過調(diào)控一系列轉(zhuǎn)錄因子，引起細胞增殖分化[19]。Xie等[20]的研究結(jié)果表明，mascRNA激活ERK/MAPK信號通路，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)基因，促進肝癌細胞侵襲表型。本研究通過蛋白質(zhì)印跡法檢測ERK/MAPK信號通路中的關(guān)鍵蛋白ERK和MEK，結(jié)果顯示，與對照組比較，激活劑組p-ERK和p-MEK蛋白相對表達量升高；與激活劑組比較，激活劑+澳洲茄堿組p-ERK和p-MEK蛋白相對表達量降低；與澳洲茄堿組比較，激活劑+澳洲茄堿組p-ERK和p-MEK蛋白相對表達量升高。表明澳洲茄堿可抑制ERK/MAPK信號通路激活。

綜上所述，澳洲茄堿可抑制肝癌細胞增殖活性，降低惡性腫瘤細胞惡性生物學(xué)行為，其可能是通過調(diào)節(jié)ERK/MAPK信號通路發(fā)揮作用，可為臨床治療肝癌提供理論依據(jù)。