蘇敬紅 武 彬

(山東職業(yè)學(xué)院生物工程學(xué)院，山東 濟(jì)南 250104)

發(fā)酵食品一直是人類飲食的重要組成部分，發(fā)酵工藝對(duì)食物成分的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了重要影響[1]。發(fā)酵產(chǎn)品種類的多樣性反映了在驅(qū)動(dòng)發(fā)酵過程中微生物的多樣性[2]。酸菜因富含維生素、有機(jī)酸和氨基酸等營(yíng)養(yǎng)成分而深受大眾喜愛，發(fā)酵酸菜成分的動(dòng)態(tài)變化高度依賴于發(fā)酵過程中的微生物菌群[3]。乳酸菌能夠代謝蔬菜的化學(xué)成分，這些微生物產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物的組合形成了最終產(chǎn)品的獨(dú)特風(fēng)味[4]。

植物乳桿菌是發(fā)酵益生菌菌屬中最常見的一種，在乳桿菌屬中因其高度靈活的基因組而具有非常好的生態(tài)位適應(yīng)能力[5-7]，對(duì)發(fā)酵產(chǎn)品的風(fēng)味和質(zhì)地有顯著影響。Miriam等[8]利用植物乳桿菌降解橄欖苦苷，消除了其所造成的特征苦味，改善了食用橄欖的風(fēng)味。在植物乳桿菌NCU116發(fā)酵苦瓜汁過程中，減少了果汁中的醛類和酮類，增加了醇類和酸類，改善了果汁的香氣，賦予了更理想的風(fēng)味[9]。除了改善風(fēng)味外，Beatriz等[10]通過研究發(fā)現(xiàn)橙汁牛奶飲料經(jīng)短乳桿菌POM與植物乳桿菌TR-71、TR-14的輔助發(fā)酵后，與未發(fā)酵組相比，具有更高的抗氧化性能。

嗜酸乳桿菌是用于發(fā)酵食品的具有高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的益生菌菌株，屬于同型發(fā)酵乳酸菌。Kwaw等[11]發(fā)現(xiàn)接種植物乳桿菌、副干酪乳桿菌和嗜酸乳桿菌發(fā)酵桑葚汁后顏色更加鮮艷。嗜酸乳桿菌CH-2可以產(chǎn)生具有強(qiáng)抗氧化活性的代謝物，利用其發(fā)酵顯著改善了梨汁的褐變程度[12]。接種嗜酸乳桿菌和發(fā)酵乳桿菌發(fā)酵桃汁后顯著增加了其超氧陰離子自由基清除活性和鐵還原能力等，提高了果汁的生物活性潛力和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[13]。

由于乳酸菌對(duì)人體健康的積極影響，近年來被廣泛用作食品工業(yè)中的食品發(fā)酵劑。植物乳桿菌和嗜酸乳桿菌被定義為食品工業(yè)中最廣泛使用的益生菌。添加鹽分可以抑制發(fā)酵制品中有害菌的生長(zhǎng)、改善色澤質(zhì)地、降低水分活度和保證風(fēng)味，但高鹽不僅會(huì)引發(fā)某些疾病，還會(huì)抑制乳酸菌的生長(zhǎng)，延長(zhǎng)發(fā)酵周期。

研究擬利用從東北酸菜中篩選出的優(yōu)良植物乳桿菌，同發(fā)酵性能優(yōu)良的嗜酸乳桿菌復(fù)配發(fā)酵，尋找一種在無鹽環(huán)境下也能保證產(chǎn)品質(zhì)量的最優(yōu)發(fā)酵條件，避免高鹽對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)的抑制，降低高鹽對(duì)健康的風(fēng)險(xiǎn)，以期為開發(fā)無鹽酸菜提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

白菜(BrassicapekinensisRupr)：市售；

硫酸鎂、檸檬酸氫二鉀：分析純，天津市東麗區(qū)天大化學(xué)試劑廠；

牛肉膏：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；

吐溫-80：天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；

氫氧化鈉：分析純，天津市天力化學(xué)試劑有限公司；

植物乳桿菌(suan1、suan3、suan5、suan9、suan12、suan14、suan15、suan16、suan17)、大腸桿菌ATCC25922、嗜酸乳桿菌(KLDS1.0901、KLDS1.0902)：哈爾濱維科生物技術(shù)有限公司。

1.2 試驗(yàn)設(shè)備

紫外可見分光光度計(jì)：UV-5100型，上海元析儀器有限公司；

恒溫加熱磁力攪拌器：85-2型，杭州儀表電機(jī)有限公司；

電熱恒溫培養(yǎng)箱：DHP9160型，上海佳勝實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；

生化培養(yǎng)箱：SPX-150B型，上海佳勝實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；

立式壓力高壓滅菌鍋：HVE-50型，上海申安醫(yī)療器械廠；

數(shù)顯攪拌水浴鍋：HH-420-034型，常州賽普實(shí)驗(yàn)儀器廠；

電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：HPG-9245型，北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；

電子天平：PL2002型，梅特勒—托利多儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌的篩選

(1) 不同溫度下植物乳桿菌和嗜酸乳桿菌生長(zhǎng)性能的測(cè)定：將植物乳桿菌(suan1、suan3、suan5、suan9、suan12、suan14、suan15、suan16、suan17)、嗜酸乳桿菌(KLDS1.0901、KLDS1.0902)菌株于MRS培養(yǎng)基中活化兩代，使菌體濃度達(dá)到6×109CFU/mL，以2%的接種量接至MRS液體培養(yǎng)基中，分別在22，26，30，34，38 ℃培養(yǎng)24 h，分別于0，4，8，12，16，20，24 h測(cè)其OD600 nm及培養(yǎng)液pH值，重復(fù)3次取平均值，并繪制菌株生長(zhǎng)曲線。

(2) 不同溫度下植物乳桿菌和嗜酸乳桿菌產(chǎn)酸量的測(cè)定：取發(fā)酵液1 mL置于150 mL錐形瓶中，以50 mL蒸餾水稀釋，以酚酞為指示劑，用0.1 mol/L NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至溶液呈微紅色，重復(fù)3次取平均值，并按式(1) 計(jì)算產(chǎn)酸率。

(1)

式中：

R1——植物乳桿菌和嗜酸乳桿菌產(chǎn)酸率，%；

C——NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，mol/L；

V0——空白組消耗NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液體積，mL；

V1——消耗NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液體積，mL；

V2——樣品溶液體積，mL。

(3) 不同植物乳桿菌抑菌性能的測(cè)定：采用牛津杯定量擴(kuò)散法。先將含1%水的瓊脂倒入平板中，冷卻后將牛津杯均勻插入。將含1%瓊脂的LB培養(yǎng)基趁熱迅速倒入，且不超過牛津杯頂部，4 ℃冷卻1.5 h，取出牛津杯，在孔洞處加發(fā)酵上清液150 μL，并用蒸餾水做空白對(duì)照。處理后的平板于4 ℃冷卻2 h，再于37 ℃放置24 h，用游標(biāo)卡尺測(cè)量讀數(shù)。

1.3.2 無鹽酸菜發(fā)酵工藝 將市售白菜去根和老葉、清洗、沸水熱燙3～5 s后瀝干切絲，每次稱取250 g白菜絲裝入聚乙烯薄膜袋中，將篩選得到的植物乳桿菌與嗜酸乳桿菌按一定比例接入到白菜絲上，并與一定量玉米汁培養(yǎng)基充分混合，用真空保鮮機(jī)密封，選擇合適的溫度進(jìn)行發(fā)酵。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

(1) 乳酸菌復(fù)配比例優(yōu)化：將活菌數(shù)為6×109CFU/mL的植物乳桿菌suan-15和嗜酸乳桿菌KLDS1.0901在MRS液體培養(yǎng)基中活化兩代，用生理鹽水將菌液稀釋10倍，將450 μL植物乳桿菌suan-15和嗜酸乳桿菌KLDS1.0901分別按m植物乳桿菌∶m嗜酸乳桿菌為3∶1，2∶1，1∶1，1∶2，1∶3置于EP管中，8 000 r/min離心3 min，除去上清液，用生理鹽水洗滌菌泥兩次，加入由7.5 g玉米汁和相同質(zhì)量蒸餾水組成的15.0 g無菌發(fā)酵培養(yǎng)液中，一起接種至白菜絲中，混合發(fā)酵，以感官評(píng)分為指標(biāo)確定最佳復(fù)配比例。

(2) 菌種接種量?jī)?yōu)化：將活菌數(shù)為6×109CFU/mL的植物乳桿菌suan-15和嗜酸乳桿菌KLDS1.0901在MRS液體培養(yǎng)基中活化兩代，用生理鹽水將菌液稀釋10倍，分別取150，300，450，600，750 μL的植物乳桿菌suan-15和嗜酸乳桿菌KLDS1.0901按m植物乳桿菌∶m嗜酸乳桿菌為1∶1 置于EP管中，8 000 r/min離心3 min，除去上清液，用生理鹽水洗滌菌泥兩次，加入由7.5 g玉米汁和相同質(zhì)量蒸餾水組成的15.0 g無菌發(fā)酵培養(yǎng)液中，一起接種至白菜絲中，混合發(fā)酵，以感官評(píng)分為指標(biāo)確定最佳復(fù)配比例。

(3) 玉米汁添加量?jī)?yōu)化：將活菌數(shù)為6×109CFU/mL的植物乳桿菌suan-15和嗜酸乳桿菌KLDS1.0901在MRS液體培養(yǎng)基中活化兩代，用生理鹽水將菌液稀釋10倍，取450 μL植物乳桿菌suan-15和嗜酸乳桿菌KLDS1.0901按m植物乳桿菌∶m嗜酸乳桿菌為1∶1置于EP管中，8 000 r/min 離心3 min，除去上清液，用生理鹽水洗滌菌泥兩次，加入由2.5，5.0，7.5，10.0，12.5 g玉米汁和蒸餾水配置的15.0 g無菌發(fā)酵培養(yǎng)液中，一起接種至白菜絲中，混合發(fā)酵，以感官評(píng)分為指標(biāo)確定最佳復(fù)配比例。

(4) 發(fā)酵工藝參數(shù)優(yōu)化：根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，通過Design-Expert 13.0軟件采用Box-Benhnken進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，選取感官評(píng)分為響應(yīng)值，以乳酸菌復(fù)配比例(m植物乳桿菌∶m嗜酸乳桿菌)、菌種接種量和玉米汁添加量3個(gè)因素為自變量對(duì)發(fā)酵工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。

1.3.4 pH值測(cè)定 采用pH計(jì)測(cè)定。

1.3.5 總酸含量測(cè)定 按GB 12456—2021執(zhí)行。

1.3.6 亞硝酸鹽含量測(cè)定 按GB 5009.33—2016執(zhí)行。

1.3.7 感官評(píng)價(jià) 選取10名人員，以蔬菜顏色、漬液顏色、軟硬度、包裝和氣味為評(píng)價(jià)項(xiàng)目，按表1對(duì)酸菜成品進(jìn)行感官評(píng)價(jià)。

表1 無鹽酸菜成品感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

1.3.8 數(shù)據(jù)分析 所有試驗(yàn)平行3次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用Origin Pro 8.5軟件作圖，使用Statistix 8.1軟件進(jìn)行顯著性分析(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵菌株的篩選

2.1.1 不同溫度下植物乳桿菌的生長(zhǎng)活性 由圖1、圖2可知，9株植物乳桿菌在0～4 h處于生長(zhǎng)遲緩期，為了適應(yīng)新的接種環(huán)境，該階段菌株生長(zhǎng)緩慢[14]，OD600 nm值緩慢增加，發(fā)酵液pH值緩慢下降。隨著菌株生長(zhǎng)進(jìn)入對(duì)數(shù)期，菌株生長(zhǎng)旺盛，OD600 nm值快速增加，pH值下降速率最快，持續(xù)時(shí)間為4～20 h。之后，菌株生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定階段，菌株增殖速度減慢，OD600 nm值保持相對(duì)穩(wěn)定，發(fā)酵液的pH值穩(wěn)定在3.65～4.10。綜合來看，9株植物乳桿菌在22～38 ℃ 范圍內(nèi)均可以良好生長(zhǎng)。其中，30 ℃時(shí)，植物乳桿菌suan-15表現(xiàn)出較好的生長(zhǎng)活性，且高于其他培養(yǎng)溫度，發(fā)酵液pH值下降最快，其值從5.83±0.02下降至3.70±0.01，反映了該菌株良好的生長(zhǎng)特性和產(chǎn)酸能力。

圖1 不同溫度下9株植物乳桿菌的生長(zhǎng)曲線Figure 1 Growth curves of 9 Lactobacillus plantarum strains at different temperatures

圖2 不同溫度下9株植物乳桿菌發(fā)酵液pH值Figure 2 pH of fermentation broth of 9 Lactobacillus plantarum strains at different temperatures

2.1.2 不同溫度下植物乳桿菌的產(chǎn)酸能力 由圖3可知，發(fā)酵液pH值和菌體產(chǎn)酸量呈負(fù)相關(guān)，9株植物乳桿菌在0～4 h內(nèi)產(chǎn)酸量均緩慢增加，在菌體對(duì)數(shù)生長(zhǎng)階段快速增加，隨后(20～24 h)趨勢(shì)平緩。26 ℃下，不同植物乳桿菌產(chǎn)酸量差異較大，但產(chǎn)酸量均低于較高溫度。30 ℃時(shí)，植物乳桿菌suan-15的產(chǎn)酸量在24 h內(nèi)增加最多，最終產(chǎn)酸量可達(dá)(1.821±0.02)%，與菌株生長(zhǎng)活性的研究結(jié)果相一致。因此，選取發(fā)酵性能最好的植物乳桿菌suan-15為后續(xù)發(fā)酵菌種，選取其最適培養(yǎng)溫度30 ℃為發(fā)酵溫度。

圖3 不同溫度下9株植物乳桿菌的產(chǎn)酸量Figure 3 Acid production of 9 Lactobacillus plantarum strains at different temperatures

2.1.3 不同植物乳桿菌對(duì)大腸桿菌的抑制能力 致病性大腸桿菌是常見的食源性病原體，傳統(tǒng)的發(fā)酵酸菜很容易受到致病菌和腐敗菌特別是大腸桿菌的污染，從而影響產(chǎn)品質(zhì)量，危害人體健康。由圖4可知，抑菌能力較強(qiáng)的是植物乳桿菌suan-15和植物乳桿菌suan-9，2株植物乳桿菌的抑菌活性無顯著性差異。抑菌圈直徑范圍為10～17 mm，特別是植物乳桿菌suan-15表現(xiàn)出最強(qiáng)的抗菌活性，抑菌圈直徑達(dá)(16.40±0.30) mm。利用該菌株較強(qiáng)的抑菌特性可以確保發(fā)酵酸菜的安全性。

圖4 不同植物乳桿菌對(duì)大腸桿菌ATCC25922的抑菌效果

2.1.4 嗜酸乳桿菌在30 ℃下的發(fā)酵性能 由圖5可知，2株嗜酸乳桿菌在0～4 h時(shí)生長(zhǎng)遲緩，OD600 nm和菌株產(chǎn)酸量緩慢增加，發(fā)酵液pH值緩慢下降，且無明顯差異。在菌株生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)期階段，與嗜酸乳桿菌KLDS1.0902相比，嗜酸乳桿菌KLDS1.0901生長(zhǎng)更旺盛，增殖更快，產(chǎn)酸量更大。其24 h后產(chǎn)酸量可達(dá)1.27%。30 ℃下，嗜酸乳桿菌KLDS1.0901具有更優(yōu)良的發(fā)酵特性。因此，選取嗜酸乳桿菌KLDS1.0901作為后續(xù)復(fù)配發(fā)酵劑的發(fā)酵菌株。

圖5 30 ℃下嗜酸乳桿菌KLDS1.0901和嗜酸乳桿菌KLDS1.0902的發(fā)酵特性Figure 5 Fermentation characteristics of Lactobacillus acidophilus KLDS1.0901 and Lactobacillus acidophilus KLDS1.0902 at 30 ℃

2.2 發(fā)酵工藝參數(shù)優(yōu)化

2.2.1 乳酸菌復(fù)配比例

(1) pH值和總酸含量:由圖6可知，乳酸菌復(fù)配比例對(duì)無鹽酸菜發(fā)酵過程中的pH值和總酸含量有顯著影響。樣品的初始pH值為6.0～6.2，在發(fā)酵過程中，所有樣品組的pH值在第1天急劇下降，然后逐漸下降，最后趨于穩(wěn)定，總酸含量從快速增加到緩慢增加直至發(fā)酵成熟。接種的乳酸菌更好地適應(yīng)了厭氧環(huán)境，可有效利用能源物質(zhì)代謝產(chǎn)酸，大量增殖。所有樣品組的pH值和總酸含量在發(fā)酵5 d后趨于穩(wěn)定，菌群代謝造成的酸性環(huán)境對(duì)乳酸菌的生長(zhǎng)產(chǎn)生了一定的抑制作用[15]。此時(shí)，樣品組pH值均低于3.4，總酸含量為0.53～0.65 g/100 g，可認(rèn)為發(fā)酵成熟[16]。

圖6 不同比例乳酸菌發(fā)酵無鹽酸菜中pH值和總酸含量變化Figure 6 Changes of pH value and total acid content in sauerkraut fermented by different proportions of lactic acid bacteria without salt

發(fā)酵成熟時(shí)，m植物乳桿菌∶m嗜酸乳桿菌為2∶1，1∶1的混合發(fā)酵組pH值顯著低于其他組；相應(yīng)的總酸積累最多，達(dá)0.61～0.64 g/100 g，且兩組間無顯著差異(P>0.05)。m植物乳桿菌∶m嗜酸乳桿菌為1∶3的混合發(fā)酵組pH值最高，為3.35±0.01；總酸含量顯著低于其他組(P<0.05)，為(0.54±0.03) g/100 g。

(2) 亞硝酸鹽含量：由圖7可知，所有樣品組中亞硝酸鹽含量在發(fā)酵過程中整體呈持續(xù)降低趨勢(shì)，未出現(xiàn)亞硝酸鹽峰，且始終低于最高限值20 mg/kg，在發(fā)酵5 d后降低至最低水平。發(fā)酵初期(0～1 d)，m植物乳桿菌∶m嗜酸乳桿菌為1∶2樣品組和m植物乳桿菌∶m嗜酸乳桿菌為1∶3樣品組的亞硝酸鹽含量下降趨勢(shì)相接近，m植物乳桿菌∶m嗜酸乳桿菌為3∶1，2∶1，1∶1樣品組的下降趨勢(shì)接近。

圖7 不同比例乳酸菌發(fā)酵無鹽酸菜中亞硝酸鹽含量變化

當(dāng)m植物乳桿菌∶m嗜酸乳桿菌為2∶1時(shí)，亞硝酸鹽含量在發(fā)酵成熟時(shí)達(dá)同組最低水平(0.23±0.10) mg/kg。m植物乳桿菌∶m嗜酸乳桿菌為1∶3時(shí)，亞硝酸鹽含量達(dá)同組最高水平(1.31±0.10) mg/kg，說明接種這兩株乳酸菌混合發(fā)酵能夠有效控制發(fā)酵酸菜的亞硝酸鹽濃度。

(3) 感官評(píng)價(jià)：由圖8可知，m植物乳桿菌∶m嗜酸乳桿菌為2∶1樣品組，除組織形態(tài)外，各方面感官指標(biāo)均優(yōu)于其他組，綜合評(píng)分為42.36±0.10。整體來看，所有樣品組均未出現(xiàn)脹袋現(xiàn)象，綜合評(píng)分情況為m植物乳桿菌∶m嗜酸乳桿菌為2∶1>m植物乳桿菌∶m嗜酸乳桿菌為1∶1>m植物乳桿菌∶m嗜酸乳桿菌為3∶1>m植物乳桿菌∶m嗜酸乳桿菌為1∶3>m植物乳桿菌∶m嗜酸乳桿菌為1∶2，其中，m植物乳桿菌∶m嗜酸乳桿菌為3∶1，1∶3，1∶2樣品組的評(píng)分無顯著差異(P>0.05)。有關(guān)組織形態(tài)，當(dāng)m植物乳桿菌∶m嗜酸乳桿菌為2∶1時(shí)，感官評(píng)分最低，可能與其較低的pH值有重要關(guān)系。綜合各項(xiàng)指標(biāo)，m植物乳桿菌∶m嗜酸乳桿菌為2∶1時(shí)酸菜產(chǎn)品的感官評(píng)分最高，視為最適合發(fā)酵的復(fù)配比例。

圖8 不同比例乳酸菌發(fā)酵無鹽酸菜的感官評(píng)分

2.2.2 乳酸菌接種量?jī)?yōu)化

(1) pH值和總酸含量：由圖9可知，發(fā)酵第1天，所有酸菜樣品的pH值從初始值6.0迅速下降，然后緩慢下降至3.2～3.3；總酸含量變化與pH值呈負(fù)相關(guān)，在所有樣品中均隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，并于發(fā)酵第5天穩(wěn)定在0.54～0.62 g/100 g，此時(shí)已達(dá)到DBS 22/025—2014《地方標(biāo)準(zhǔn)酸菜》中酸菜成熟的標(biāo)準(zhǔn)。發(fā)酵前期(0～3 d)，pH值隨乳酸菌接種量增加而降低，總酸含量隨乳酸菌接種量增加而增加；隨后，乳酸菌接種量為450 μL樣品組與600,750 μL樣品組的指標(biāo)變化無顯著差異。

圖9 不同乳酸菌接種量下發(fā)酵無鹽酸菜的pH值和總酸含量變化Figure 9 Changes of pH value and total acid content in sauerkraut fermented by different doses of lactic acid bacteria inoculation without salt

當(dāng)乳酸菌接種量為450 μL時(shí)，發(fā)酵成熟時(shí)的pH值最低為3.24±0.01，發(fā)酵5 d后積累的總酸含量最高達(dá)(0.61±0.01) g/100 g。與pH值相對(duì)應(yīng)，混菌接種量在750 μL時(shí)表現(xiàn)出更顯著的酸化速度。發(fā)酵早期pH值迅速下降至4.0以下，同時(shí)伴隨著總酸含量的快速增加，表明添加的混菌數(shù)量能夠保證其迅速成為優(yōu)勢(shì)菌，顯著加速發(fā)酵進(jìn)程，加快酸菜的生產(chǎn)。

(2) 亞硝酸鹽含量：由圖10可知，所有酸菜樣品的亞硝酸鹽含量在發(fā)酵過程中持續(xù)降低，并在發(fā)酵第5天降低至最低水平。發(fā)酵前期(0～3 d)，亞硝酸鹽含量隨乳酸菌接種量的增加而降低，乳酸菌接種量為450 μL樣品組與600，750 μL樣品組無顯著差異。當(dāng)乳酸菌接種量為450～750 μL時(shí)，亞硝酸鹽含量始終低于其他組，發(fā)酵第5天最低亞硝酸鹽含量為(0.65±0.21) mg/kg。當(dāng)乳酸菌接種量為150 μL時(shí)，表現(xiàn)出最高的亞硝酸鹽含量為(1.31±0.10) mg/kg。此外，所有發(fā)酵成熟的樣品中亞硝酸鹽含量均低于初始含量，說明無鹽酸菜中的亞硝酸鹽含量得到了有效控制。

圖10 不同乳酸菌接種量下發(fā)酵無鹽酸菜中亞硝酸鹽含量變化

(3) 感官評(píng)價(jià)：由圖11可知，乳酸菌接菌量為450 μL的樣品組，在漬液顏色、組織形態(tài)和氣味方面的感官指標(biāo)均優(yōu)于其他組，綜合評(píng)分為42.2±0.12。整體來看，所有樣品組均未出現(xiàn)脹袋現(xiàn)象，綜合評(píng)分情況為乳酸菌接菌量為450 μL樣品組>600 μL樣品組>300 μL樣品組>150 μL樣品組>750 μL樣品組。綜合各項(xiàng)指標(biāo)，乳酸菌接菌量為450 μL的酸菜產(chǎn)品感官評(píng)分最高，視為最適合發(fā)酵的乳酸菌接菌量。

2.2.3 玉米汁添加量?jī)?yōu)化

(1) pH值和總酸含量：由圖12可知，發(fā)酵1 d后，乳酸菌在發(fā)酵體系中迅速增殖，代謝積累的酸使pH值迅速降低至3.5左右，隨后，過低的酸性環(huán)境抑制了乳酸菌的生長(zhǎng)[17]，導(dǎo)致樣品組pH值降低減緩，總酸含量緩慢增加直至穩(wěn)定。發(fā)酵前期(0～2 d)，pH值隨玉米汁添加量的增加而下降，總酸含量隨玉米汁添加量的增加而增加；當(dāng)玉米汁添加量為2.5～7.5 g時(shí)，隨著添加量的增加，pH值越低，總酸含量越高；當(dāng)添加量為7.5～12.5 g時(shí)，隨添加量的增加，pH值和總酸含量差異不顯著。因此，添加量為7.5～12.5 g的樣品組酸水平最為顯著，成熟樣品最低pH值為3.24±0.01，相應(yīng)的總酸含量最高達(dá)(0.62±0.01) g/100 g。

圖12 不同玉米汁添加量下發(fā)酵無鹽酸菜pH值和總酸含量變化Figure 12 Changes of pH value and total acid content in sauerkraut fermented under different amount of corn juice without salt

(2) 亞硝酸鹽含量：由圖13可知，所有樣品組亞硝酸鹽含量均表現(xiàn)出持續(xù)降低的趨勢(shì)，且始終低于初始含量。發(fā)酵過程中，當(dāng)玉米汁添加量為7.5～12.5 g時(shí)，樣品組的亞硝酸鹽含量始終低于其他組，發(fā)酵第5天，表現(xiàn)出最低的亞硝酸鹽含量為(0.65±0.21) mg/kg，此時(shí)，玉米汁添加量為7.5～12.5 g樣品組的亞硝酸鹽含量差異不顯著。當(dāng)玉米汁添加量為2.5 g時(shí)，表現(xiàn)出最高的亞硝酸鹽含量為(1.55±0.10) mg/kg，且亞硝酸鹽含量下降速率顯著低于7.5～12.5 g樣品組(P<0.05)。

圖13 不同玉米汁添加量下發(fā)酵無鹽酸菜中亞硝酸鹽含量變化

(3) 感官評(píng)價(jià)：由圖14可知，綜合蔬菜顏色、漬液顏色、組織形態(tài)、包裝和氣味5項(xiàng)指標(biāo)，樣品組之間存在顯著差異(P<0.05)。當(dāng)玉米汁添加量為7.5 g時(shí)，表現(xiàn)出最好的蔬菜顏色和氣味，與樣品組具有最高的總酸含量相對(duì)應(yīng)，可能是由于高酸度對(duì)酸菜品質(zhì)有改善作用[18]。綜合各方面感官評(píng)分，當(dāng)玉米汁添加量為7.5 g時(shí)發(fā)酵的無鹽酸菜總評(píng)分高于其他組，故將其視為發(fā)酵的最適玉米汁添加量。

圖14 不同玉米汁添加量下發(fā)酵無鹽酸菜的感官得分

2.2.4 最佳發(fā)酵參數(shù)優(yōu)化 以感官評(píng)分為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，試驗(yàn)因素與水平見表2，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表3。

表2 Box-Benhnken中心試驗(yàn)因素水平編碼

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表4 回歸模型方差分析?

根據(jù)回歸模型方差分析，得到感官評(píng)分對(duì)自變量乳酸菌復(fù)配比例、菌種接種量和玉米汁添加量的二次多項(xiàng)回歸方程為：

Y=45.63+0.72A+1.92B+1.74C-2.17AB+1.48AC+0.68BC-1.71A2-4.68B2-3.93C2。

(2)

由圖15可知，發(fā)酵無鹽酸菜感官評(píng)分受菌種添加量影響較大，相關(guān)響應(yīng)曲面較彎曲；乳酸菌接種量和乳酸菌復(fù)配比例兩者間交互作用更顯著，等高線呈橢圓形，圖形顏色變化更快。當(dāng)乳酸菌接種量一定時(shí)，乳酸菌復(fù)配比例和玉米汁添加量的交互作用對(duì)感官評(píng)分影響較小，響應(yīng)曲面較為平緩，圖形顏色變化較為緩慢，與方差分析結(jié)果一致。

根據(jù)模擬方程得到感官評(píng)分的最大預(yù)測(cè)值為46.11，此時(shí)乳酸菌接種量為476.13 μL，m植物乳桿菌∶m嗜酸乳桿菌為2.22∶1，玉米汁添加量為8.19 g。結(jié)合實(shí)際情況，將發(fā)酵無鹽酸菜的最佳條件調(diào)整為乳酸菌接種量450 μL，m植物乳桿菌∶m嗜酸乳桿菌為2∶1，玉米汁添加量為7.5 g，此條件下無鹽酸菜感官評(píng)分為46.81，無脹袋現(xiàn)象，顏色自然，口感脆嫩，無異味。

圖15 響應(yīng)面試驗(yàn)交互作用Figure 15 Interaction results of surface response

3 結(jié)論

以2株嗜酸乳桿菌和從傳統(tǒng)東北酸菜中分離出的9株植物乳桿菌為研究對(duì)象，篩選出了發(fā)酵性能優(yōu)良的植物乳桿菌和嗜酸乳桿菌作為復(fù)配乳酸菌。結(jié)果表明：針對(duì)不同溫度下9株植物乳桿菌的發(fā)酵特性，綜合考量其對(duì)大腸桿菌的抑制能力，其中，植物乳桿菌suan-15抑菌能力最強(qiáng)，在最適生長(zhǎng)溫度30 ℃時(shí)產(chǎn)酸性能最好，篩選出該菌株為發(fā)酵菌株，30 ℃為發(fā)酵溫度；嗜酸乳桿菌KLDS1.0901在30 ℃下生長(zhǎng)活性最好、產(chǎn)酸能力最佳，作為混合發(fā)酵的乳酸菌。以蔬菜顏色、漬液顏色、包裝、氣味和組織狀態(tài)為感官評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)分，確定出發(fā)酵無鹽酸菜的最佳工藝條件。最適發(fā)酵條件為m植物乳桿菌∶m嗜酸乳桿菌為2∶1，250 g白菜添加乳酸菌450 μL，添加玉米汁7.5 g，此時(shí)酸菜感官評(píng)分為46.81。后續(xù)將進(jìn)一步研究發(fā)酵機(jī)理對(duì)無鹽酸菜風(fēng)味的影響。