周麗屏,郭嘉明,郭堯平,陳 糾,王 致

(廣州市第十二人民醫(yī)院 職業(yè)環(huán)境與健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510620)

受椰毒假單胞菌污染的椰子或玉米面制品在一定條件下可產(chǎn)生米酵菌酸，食用后可導(dǎo)致人或動(dòng)物中毒甚至死亡[1]。米酵菌酸無(wú)色、無(wú)味，受其污染的食物具有正常的外觀、氣味和口感[2]，因此米酵菌酸中毒事件時(shí)有發(fā)生，相關(guān)報(bào)道案例僅發(fā)生在印度尼西亞、非洲和中國(guó)3個(gè)國(guó)家[3-5]。1953年到1994年，我國(guó)16個(gè)省共發(fā)生椰毒假單胞菌酵米面亞種食物中毒事件545起，中毒人數(shù)3 352人，死亡1 401人，平均病死率41.80%[6]。1996年到2005年，僅廣西省就報(bào)告11起酵米面中毒事件，中毒人數(shù)77人，死亡人數(shù)50人，病死率高達(dá)64.94%[7]。

米酵菌酸中毒后，患者通常會(huì)出現(xiàn)頭痛、眩暈、意識(shí)喪失、抽搐、腹痛、惡心、嘔吐、腹瀉性心血管病、胸痛、心悸[4]、血尿、血便[8]、黃疸、肝腫大等多臟器損害癥狀[9]，大多數(shù)中毒事件與患者食用過(guò)玉米面[10]、發(fā)泡黑木耳[11]、變質(zhì)銀耳[12-14]、新鮮河粉等濕性制品[15]相關(guān)。新鮮河粉、粿條等濕米制品是廣東省傳統(tǒng)食品，米酵菌酸中毒事件發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)較高。結(jié)合我院過(guò)往的接診病例情況，大多數(shù)患者就診時(shí)并不能明確具體致病原因，醫(yī)生需根據(jù)患者臨床癥狀并結(jié)合實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)結(jié)果才能進(jìn)行最終確診，因此中毒患者生物檢材中毒物的快速定性、定量至關(guān)重要。

血液、尿液中米酵菌酸多采用液相色譜法[16-18]、液相色譜-質(zhì)譜法[19]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[20-21]測(cè)定，但定性、定量分析均依賴于標(biāo)準(zhǔn)品，而米酵菌酸標(biāo)準(zhǔn)品在使用過(guò)程中易轉(zhuǎn)化為異米酵菌酸，不利于米酵菌酸的準(zhǔn)確檢測(cè)。鑒于此，試驗(yàn)采用超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜法，在全離子采集一級(jí)質(zhì)譜(MS1-Allions)模式下即可實(shí)現(xiàn)米酵菌酸的快速定性和準(zhǔn)確定量。除此之外，還增設(shè)了10，40 V 碰撞電壓，使得在獲得米酵菌酸一級(jí)母離子的同時(shí)得到更豐富的二級(jí)碎片離子信息。MS1-Allions采集模式不僅考慮了一級(jí)母離子的精確質(zhì)量數(shù)，還考慮了二級(jí)碎片離子的質(zhì)量數(shù)、共流出保留時(shí)間以及同位素得分率，使無(wú)標(biāo)定性結(jié)果的準(zhǔn)確率大幅提高;結(jié)合提取離子流圖(EIC)提取的母離子或特征碎片離子的峰面積，還可進(jìn)行準(zhǔn)確定量。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

1290UPLC-6545QTOF型超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀;TG 20型臺(tái)式離心機(jī);SORVALL pico型高速離心機(jī);Multi Reax型振蕩器;Milli-Q Reference型超純水機(jī);1 mL可調(diào)微量移液器、100μL 可調(diào)微量移液器、20μL 可調(diào)微量移液器。

米酵菌酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液:取0.000 10 g米酵菌酸銨鹽標(biāo)準(zhǔn)品于小燒杯中，用甲醇溶解后，轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，用甲醇定容，配制成9.0 mg·L－1米酵菌酸(以米酵菌酸計(jì))標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，于－20 ℃密封冷凍保存。

米酵菌酸標(biāo)準(zhǔn)溶液系列:取適量米酵菌酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，用甲醇逐級(jí)稀釋，配制成0.45，0.90，1.80，2.70，3.60，4.50 mg·L－1的米酵菌酸標(biāo)準(zhǔn)溶液系列。

基質(zhì)匹配米酵菌酸標(biāo)準(zhǔn)溶液系列:取0.9 mL空白全血于6根1.5 mL 硅化微型離心管(EP 管)中，加入0.1 mL 米酵菌酸標(biāo)準(zhǔn)溶液系列，制得45，90，180，270，360，450μg·L－1的基質(zhì)匹配米酵菌酸標(biāo)準(zhǔn)溶液系列。

米酵菌酸銨鹽標(biāo)準(zhǔn)品純度不小于98%;甲醇、乙腈、甲酸均為液相色譜-質(zhì)譜純;氨水(質(zhì)量分?jǐn)?shù)28%)純度不小于99.99%;10 mol·L－1甲酸銨溶液(市售);試驗(yàn)用水為超純水。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜條件

Infinity Lab Poroshell 120 EC-C18色譜柱(150 mm×3.0 mm，2.7μm);柱溫40 ℃;流量0.40 mL·min－1;流動(dòng)相A 為含10 mmol·L－1甲酸銨的0.1%(體積分?jǐn)?shù)，下同)甲酸溶液，B為乙腈;進(jìn)樣量10.0μL。梯度洗脫程序:0～1.5 min時(shí)，B為5%;1.5～15.0 min 時(shí)，B 由5%升 至55%;15.0～25.0 min 時(shí)，B 由55% 升至95%，保持5.0 min;30.0～30.1 min時(shí)，B 由95%跳轉(zhuǎn)至5%，保持4.99 min。

1.2.2 質(zhì)譜條件

雙噴射流電噴霧離子(AJS ESI)源，負(fù)離子模式;在擴(kuò)展動(dòng)態(tài)范圍(2 GHz)和離子切分器高分辨模式下進(jìn)行調(diào)諧;干燥氣溫度350 ℃，干燥氣流量8 L·min－1;鞘氣溫度350 ℃，鞘氣流量12 L·min－1;霧化氣壓力275.8 k Pa;毛細(xì)管 噴霧電 壓3 500 V，噴嘴電壓500 V，毛細(xì)管出口電壓140 V，截取錐電壓65 V，射頻電壓750 V;MS1-Allions采集模式，碰撞能量分別設(shè)置為0，10，40 V;掃描范圍質(zhì)荷比(m/z)50～1 100;定量離子m/z441.265 1;圖譜采集速率3張·s－1。

1.3 試驗(yàn)方法

用碘伏給患者取血區(qū)皮膚消毒后，用肝素鈉抗凝管采集疑似中毒患者靜脈血3.0 mL，置于冷藏盒中避光保存。振蕩混勻后，取200 μL 全血于1.5 mL硅化EP管中，加入預(yù)先在－20 ℃冷凍的甲醇800μL，振蕩5 min，以12 000 r·min－1轉(zhuǎn)速離心5 min，上清液按照優(yōu)化的儀器工作條件測(cè)定。隨同進(jìn)行空白全血試驗(yàn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理?xiàng)l件的選擇

米酵菌酸的前處理方法主要有固相萃取法[20-21]、液液萃取法[16]和蛋白沉淀法[19]。液液萃取法雖然準(zhǔn)確度較高，但是耗時(shí)較長(zhǎng)，且容易引入污染物;考慮到中毒患者對(duì)結(jié)果時(shí)效性要求很高，因此試驗(yàn)選擇采用蛋白沉淀法進(jìn)行前處理。以450μg·L－1基質(zhì)匹配米酵菌酸標(biāo)準(zhǔn)溶液為待測(cè)對(duì)象，比較了蛋白沉淀劑分別為乙腈、甲醇、體積比1∶1乙腈-甲醇混合溶液時(shí)的提取效果。結(jié)果顯示:以乙腈為蛋白沉淀劑時(shí)，米酵菌酸的回收率僅為5.70%;以體積比1∶1乙腈-甲醇混合溶液為蛋白沉淀劑時(shí)，米酵菌酸的回收率為73.5%;以甲醇為蛋白沉淀劑時(shí)，米酵菌酸的回收率可達(dá)90.0%。推測(cè):以乙腈為蛋白沉淀劑時(shí)，全血中的蛋白會(huì)沉淀成團(tuán)，這些成團(tuán)的蛋白無(wú)法被振蕩分散;以甲醇為蛋白沉淀劑時(shí)，全血中的蛋白會(huì)沉淀成疏松小顆粒，可被振蕩分散。因此，試驗(yàn)選擇的蛋白沉淀劑為甲醇。

2.2 色譜條件的選擇

以90μg·L－1米酵菌酸標(biāo)準(zhǔn)溶液為待測(cè)對(duì)象，比較了固定相分別為Infinity Lab Poroshell 120 EC-C18色譜柱(150 mm×3.0 mm，2.7μm)和Zorbax Hilic Plus色譜柱(100 mm×3.0 mm，1.8μm)，流動(dòng)相A 分別為水、0.1%，0.2%(均為體積分?jǐn)?shù)，下同)氨水溶液和0.1%，0.2%(均為體積分?jǐn)?shù)，下同)甲酸溶液時(shí)的分離效果。結(jié)果顯示:當(dāng)使用Zorbax Hilic Plus色譜柱作固定相，以甲酸溶液作流動(dòng)相A時(shí)，米酵菌酸響應(yīng)值較高，但是色譜峰拖尾嚴(yán)重，且酸度越大拖尾越嚴(yán)重;以水作流動(dòng)相A 時(shí)，米酵菌酸幾乎無(wú)響應(yīng);以氨水溶液作流動(dòng)相A 時(shí)，米酵菌酸響應(yīng)值隨酸度降低而增加，且氨水溶液體積分?jǐn)?shù)為0.2%時(shí)的色譜峰峰形尖銳、對(duì)稱，但是米酵菌酸保留時(shí)間重現(xiàn)性差，且Zorbax Hilic Plus色譜柱對(duì)堿性稍高的流動(dòng)相不耐受，會(huì)產(chǎn)生柱效降低、柱壓升高甚至柱子損壞等問(wèn)題。當(dāng)使用Infinity Lab Poroshell 120 EC-C18色譜柱作固定相，以氨水溶液和水作流動(dòng)相A 時(shí)，米酵菌酸的響應(yīng)值隨著酸度的降低而逐漸升高，但是響應(yīng)值均較低;以甲酸溶液作流動(dòng)相A 時(shí)，米酵菌酸響應(yīng)值增加，甲酸溶液體積分?jǐn)?shù)為0.1%時(shí)的響應(yīng)值較高，色譜峰峰形尖銳、對(duì)稱，且無(wú)明顯拖尾，甲酸溶液體積分?jǐn)?shù)為0.2%時(shí)響應(yīng)值出現(xiàn)明顯下降，推測(cè)流動(dòng)相A 酸度過(guò)大會(huì)導(dǎo)致米酵菌酸的離子化受到抑制。進(jìn)一步試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在甲酸溶液中加入一定量的甲酸銨，可提高米酵菌酸的響應(yīng)值，這是由于甲酸與甲酸銨形成了緩沖體系，有利于米酵菌酸的離子化。當(dāng)甲酸溶液體積分?jǐn)?shù)為0.1%，甲酸銨濃度為10 mmol·L－1時(shí)，響應(yīng)值較高，甲酸溶液體積分?jǐn)?shù)和甲酸銨濃度繼續(xù)增加，米酵菌酸響應(yīng)值未見明顯升高。綜合考慮，試驗(yàn)選擇的固定相為Infinity Lab Poroshell 120 EC-C18色譜柱，流動(dòng)相A 為含10 mmol·L－1甲酸銨的0.1%甲酸溶液。

2.3 質(zhì)譜條件的選擇

與AJS ESI正離子模式相比，以AJS ESI負(fù)離子模式檢測(cè)時(shí)的基質(zhì)干擾更小、響應(yīng)值更高，這是由于米酵菌酸結(jié)構(gòu)中含有三個(gè)羧基，易丟失質(zhì)子，在負(fù)離子模式下靈敏度更高。因此，試驗(yàn)選擇在AJS ESI負(fù)離子模式下檢測(cè)。

試驗(yàn)繼續(xù)優(yōu)化干燥氣溫度、干燥氣流量、毛細(xì)管噴霧電壓、噴嘴電壓和毛細(xì)管出口電壓等關(guān)鍵參數(shù)。由于米酵菌酸是三元羧酸，干燥氣溫度過(guò)高容易引起源內(nèi)脫羧，得不到較強(qiáng)的[M－H]－峰，應(yīng)適當(dāng)通過(guò)降低干燥氣溫度和提高干燥氣流量來(lái)進(jìn)行熱補(bǔ)償，以提高米酵菌酸的離子化效率。在AJS ESI負(fù)離子模式下，若毛細(xì)管噴霧電壓過(guò)高，容易產(chǎn)生尖端放電，使樣品裂解、響應(yīng)值降低。對(duì)于弱極性不易電離的米酵菌酸，當(dāng)噴嘴電壓高于1 500 V 時(shí)，米酵菌酸幾乎無(wú)響應(yīng)。毛細(xì)管出口電壓對(duì)母離子的傳輸效率影響較大，過(guò)大容易引起源內(nèi)裂解，過(guò)小則傳輸效率較低、檢測(cè)靈敏度下降。綜合考慮上述因素，試驗(yàn)選擇的干燥氣溫度為350 ℃、干燥氣流量為8 L·min－1、毛細(xì)管噴霧電壓為3 500 V、噴嘴電壓為500 V、毛細(xì)管出口電壓為140 V。

在優(yōu)化的儀器工作條件下，米酵菌酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖見圖1。

圖1 米酵菌酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖Fig.1 Chromatogram of the bongkrekic acid standard solution

2.4 質(zhì)譜定性分析

MS1-Allions模式下采集的準(zhǔn)分子離子[MH]－同位素豐度由高到底依次為m/z485.254 0，486.257 5，487.260 0，488.263 1，m/z與理論 值誤差分別 為－0.000 48，－0.000 38，－0.000 68，－0.000 31，各同位素豐度與理論值相對(duì)誤差分別為0，－12%，20%，－16%;共流出豐度由高到低的二級(jí)碎片離子依次為m/z441.265 1，397.274 8，153.055 7，321.258 8，109.065 9，173.133 6，365.248 1;共流出 保留時(shí) 間極差小于0.017 min。對(duì)二級(jí)碎片離子進(jìn)行歸屬分析，結(jié)果見圖2。

圖2 米酵菌酸二級(jí)碎片離子的歸屬分析Fig.2 Attribution analysis on secondary fragment ions of bongkrekic acid

2.5 基質(zhì)效應(yīng)

按照試驗(yàn)方法處理空白全血樣品，離心后，分取3份450μL 上清液于3 個(gè)樣品小瓶中，分別加入225，450，900μg·L－1米酵菌酸標(biāo)準(zhǔn)溶液50μL，配制成22.5，45，90μg·L－1基質(zhì)匹配米酵菌酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，同時(shí)用甲醇配制22.5，45，90μg·L－1米酵菌酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照儀器工作條件測(cè)定。以基質(zhì)匹配后、前米酵菌酸峰面積的比值計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)值，所得結(jié)果分別為88.28%，94.67%，94.46%，說(shuō)明血液基質(zhì)對(duì)米酵菌酸的測(cè)定具有一定抑制作用。因此，試驗(yàn)選擇以基質(zhì)匹配法制作工作曲線。

2.6 工作曲線、檢出限和測(cè)定下限

按照試驗(yàn)方法測(cè)定基質(zhì)匹配米酵菌酸標(biāo)準(zhǔn)溶液系列，以米酵菌酸的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，其對(duì)應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)繪制工作曲線。結(jié)果顯示，米酵菌酸工作曲線的線性范圍為45～450μg·L－1，線性回歸方程為y＝1 585x－4 023，相關(guān)系數(shù)為0.998 2。

以3倍信噪比(S/N)計(jì)算得檢出限(3S/N)，結(jié)果為3.2μg·L－1;以10 倍信噪比計(jì)算測(cè)定下限(10S/N)，結(jié)果為10.5μg·L－1。

2.7 精密度和回收試驗(yàn)

取3根25 mL比色管，各加入約9 mL 空白全血樣品，再分別加入50，200，500μL 米酵菌酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，用空白全血樣品稀釋至10 mL，振蕩混勻，制得質(zhì)量濃度分別為45，180，450μg·L－1的低、中、高濃度水平的加標(biāo)空白全血樣品。每個(gè)濃度水平制備6個(gè)樣品，按照試驗(yàn)方法測(cè)定，計(jì)算回收率和測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。結(jié)果顯示，米酵菌酸的回收率為82.6%～90.1%，測(cè)定值的RSD 為4.5%～5.6%。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

以450μg·L－1米酵菌酸標(biāo)準(zhǔn)溶液為待測(cè)對(duì)象，新配制和常溫密封放置48 h的該溶液中的異米酵菌酸響應(yīng)值分別為米酵菌酸響應(yīng)值的3.2%和121%，這是由于米酵菌酸在光照等條件下可轉(zhuǎn)化成無(wú)毒的異米酵菌酸[20]。因此，在保存含米酵菌酸相關(guān)樣品過(guò)程中，須特別注意環(huán)境避光，并應(yīng)盡快測(cè)定，以防止米酵菌酸轉(zhuǎn)化為異米酵菌酸，影響米酵菌酸的準(zhǔn)確定量。

2.9 樣品分析

按照試驗(yàn)方法分析一起食用鮮河粉后出現(xiàn)不適癥狀的疑似米酵菌酸中毒患者的全血樣品。結(jié)果顯示，該患者全血樣品中米酵菌酸的檢出量為2 225μg·L－1。

在米酵菌酸實(shí)際檢測(cè)工作中，中毒患者全血中毒物含量相對(duì)較高，且需快速定性診斷，而本工作提出的超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜法簡(jiǎn)單、高效、定性可靠、定量準(zhǔn)確，適用于急性中毒患者全血中米酵菌酸的快速定性、定量分析，具有一定應(yīng)用推廣價(jià)值。