趙 茜,于佳萍,章聚寶,楚剛輝

(1.新疆特色藥食用植物資源化學重點實驗室，喀什 844099; 2.喀什大學 化學與環(huán)境科學學院，喀什 844099)

昆侖雪菊，學名兩色金雞菊(Coreopsis tinctoria)，與天山雪蓮齊名。昆侖雪菊無毒無害[1]，體外抗氧化效果很強，含有黃酮類、酚酸類、聚炔類、脂肪酸、揮發(fā)油、皂苷類、多糖、氨基酸等化合物。其中，黃酮類化合物在降血糖、抗氧化、抗炎癥中起著不容小覷的作用，極具研究價值[2]。

中藥譜效學是研究中藥藥效和指紋圖譜相互關系的學科。在對中藥進行譜效分析時，尚存在一些問題，如中藥組成復雜，在色譜分析時可能出現鬼峰和錯峰，導致標準品定性困難;所需標準品種類多，一些標準品難以購買、價格昂貴;難以對所有共有組分進行定量。為克服以上問題，避免前處理和色譜條件變化帶來的結果偏差，可選擇內標或者具有特定性質的共有組分作為參照，通過計算各共有組分的相對含量進行定量，但是針對昆侖雪菊的相關研究未見報道。

鑒于此，本工作在10批不同產地、不同時間采摘的昆侖雪菊樣品的高效液相色譜(HPLC)指紋圖譜中篩選出24個共有組分，以綠原酸作參照計算各共有組分含量，以相關性分析確認共有組分的代表性和質量穩(wěn)定性，以聚類分析、主成分分析進行樣品分類，以1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2，2-聯氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)自由基清除法測定昆侖雪菊的抗氧化活性，并以灰色關聯分析法建立共有組分峰數據與抗氧化活性的譜效關系，可為昆侖雪菊的開發(fā)利用提供技術支撐。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

LC-20A 型高效液相色譜儀，配SPD-M20A 型二極管陣列檢測器、DGU-20A5型在線脫氣機、LC-20AT 型高壓泵、LCsolution 型工作站;T6 新悅型可見分光光度計;KQ3200DE型超聲波清洗器;XA-1型多功能粉碎機。

對照品儲備溶液:取綠原酸對照品12.5 mg，用60%(體積分數，下同)甲醇溶液溶解并定容至50 mL容量瓶中，得到質量濃度為250 mg·L－1對照品儲備溶液，于4 ℃條件下密封保存。

抗壞血酸或丁基羥基茴香醚(BHA)儲備溶液:取適量抗壞血酸或BHA，用60%甲醇溶液溶解并稀釋成質量濃度為0.012 g·L－1的抗壞血酸或BHA 儲備溶液。

抗壞血酸或BHA 溶液系列:用60%甲醇溶液逐級稀釋抗壞血酸或BHA 儲備溶液，配制成質量濃度為0.5，1，2，3，4 mg·L－1的抗壞血酸或BHA溶液系列，于4 ℃條件下保存。

DPPH 溶液:取DPPH 4.0 mg，用甲醇溶解并稀釋，配制成0.04 g·L－1的DPPH 溶液，避光保存。

ABTS溶液:將適量0.07 mol·L－1ABTS 溶液溶于10 mL水中，得到7.00 mmol·L－1的ABTS儲備溶液;將適量0.03 mol·L－1過硫酸鉀溶液溶于10 mL水中，得到2.55 mmol·L－1的過硫酸鉀溶液。將上述兩種溶液等體積混合，于室溫、避光條件下反應12 h左右，用水稀釋成吸光度為0.700±0.020(檢測波長734 nm)的溶液，即為ABTS溶液。

綠原酸對照品的純度為98%;DPPH、ABTS的純度為98%;BHA 的純度為99%;過硫酸鉀的純度為99%;乙腈、甲醇為色譜純;抗壞血酸、乙酸為分析純;試驗用水為娃哈哈純凈水。

10批昆侖雪菊樣品均采摘于新疆地區(qū)，具體信息見表1。

表1 10批昆侖雪菊樣品信息Tab.1 Information of 10 batches of Coreopsis tinctoria samples

1.2 色譜條件

Agilent HC-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5μm);柱溫35 ℃;進樣量20 μL;檢測波長285 nm;流動相A為0.4%(體積分數，下同)乙酸溶液，B為乙腈;流量1.0 mL·min－1。梯度洗脫程序見表2。

表2 梯度洗脫程序Tab.2 Gradient elution procedure

1.3 試驗方法

1.3.1 HPLC檢測

10批昆侖雪菊樣品經干燥、粉碎后儲于樣品瓶中。分取0.2 g置于150 mL錐形瓶中，用60%甲醇溶液50 mL 溶解，搖勻后于室溫、超聲功率500 W條件下提取30 min。待溶液冷卻至室溫，過0.45μm 濾膜，所得供試品溶液(質量濃度為4 000 mg·L－1)按照色譜條件測定。

1.3.2 抗氧化活性檢測

1)DPPH 自由基清除法 用60%甲醇溶液逐級稀釋供試品溶液，配制成質量濃度為9.6，16，20，32，40 mg·L－1的供試品溶液系列。參考文獻[3-6]，在供試品溶液系列2 mL 中加入DPPH 溶液2 mL，振蕩混勻后，避光反應30 min，以空氣作參比，在517 nm 處測量上述溶液的吸光度(樣品組A)，每個質量濃度水平重復測定3次;在供試品溶液系列2 mL 中加入甲醇2 mL，按照上述方法處理，測量吸光度(對照組Aj);在60%甲醇溶液2 mL中加入DPPH 溶液2 mL，按照上述方法處理，測量吸光度(空白組A0)，以1－(A－Aj)/A0計算DPPH自由基清除率。同時以抗壞血酸溶液系列和BHA 溶液系列作為陽性對照，按照上述方法測定，計算DPPH 自由基清除率。

2)ABTS自由基清除法 參考文獻[3-6]，將樣品組和空白組中的DPPH 溶液替換為ABTS溶液，將對照組中的甲醇替換為水，選擇測量波長為734 nm，避光反應時間為6 min，其他試驗過程和自由基清除率計算方法同DPPH 自由基清除法。

2 結果與討論

2.1 指紋圖譜建立

將10批樣品的譜圖導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統，以S10 圖譜作為參照圖譜，生成的指紋圖譜、對照指紋圖譜見圖1(a)和圖1(b)。同時測定對照品儲備溶液，所得色譜圖見圖1(c)。

圖1 10批樣品指紋圖譜、對照指紋圖譜和對照品儲備溶液的色譜圖Fig.1 Ten batches of samples fingerprints，reference fingerprint and standard stock solution chromatogram

結果顯示，10批樣品的共有峰有24個，說明昆侖雪菊的共有組分有24個。與對照品儲備溶液保留時間、吸收曲線進行比對，確定共有組分2為綠原酸。鑒于綠原酸保留時間較短且價廉易得，以綠原酸作參照，計算指紋圖譜中其他共有組分峰面積與共有組分2的比值，作為其他共有組分的相對含量。

2.2 方法學考察結果

2.2.1 標準曲線和檢出限

用60%甲醇溶液逐級稀釋對照品儲備溶液，配制成質量 濃度分別為5，12.5，20，30，35，45，50 mg·L－1的對照品溶液系列，按照1.2節(jié)色譜條件測定。以峰面積為縱坐標，綠原酸質量濃度為橫坐標繪制標準曲線，所得標準曲線的線性范圍為5～50 mg·L－1，線性回歸方程為y＝3.788×104x－2.814×104，相關系數為0.999 5。

以3倍信噪比(S/N)計算綠原酸的檢出限(3S/N)，所得結果為0.15 mg·L－1。

2.2.2 精密度試驗

鑒于產自葉城縣的樣品中24個共有組分的相對含量較高，以該樣品作研究對象，重復測定6次，計算共有組分1，2，10，11，12，20的峰面積以及保留時間的相對標準偏差(RSD)，所得峰面積的RSD 分別為0.50%，0.20%，0.10%，0.40%，0.10%，1.30%，保留時間的RSD 分別為0.30%，0.40%，0.40%，0.50%，0.40%，0.10%，說明儀器精密度良好。

取產自葉城縣的樣品6份，分別按照1.3節(jié)方法制備供試品溶液，計算共有組分1，2，10，11，12，20相對含量的RSD，所得結果分別為1.6%，1.6%，2.0%，1.5%，2.1%，2.3%，說明該方法精密度良好。

2.2.3 穩(wěn)定性試驗

按照1.3節(jié)方法處理產自葉城縣的樣品，放置0，2，4，6，8，12，24 h后進樣，計算共有組分1，2，10，11，12，20峰面積的RSD，所得峰面積的RSD 分別為1.20%，0.20%，0.40%，0.80%，0.20%，1.40%，說明供試品溶液在24 h內具有良好穩(wěn)定性。

2.2.4 回收試驗

對產自葉城縣樣品進行3個濃度水平的加標回收試驗，計算綠原酸回收率，結果見表3。

表3 回收試驗結果Tab.3 Results of test for recovery

由表3 可知，綠原酸的回收率為95.6%～103%，滿足實際檢測需求。

2.2.5 樣品分析

按照1.3.1節(jié)方法分析10批樣品，測定其中綠原酸的含量，并根據相對含量計算其他共有組分的含量(即以綠原酸計的含量)，結果見表4。

表4 以綠原酸計的24個共有組分的測定結果Tab.4 Determination results of the 24 common components calculated by chlorogenic acid

表4 (續(xù))

2.3 抗氧化活性結果

半數清除濃度(IC50)可直觀展現活性物質的抗氧化能力，IC50越小，抗氧化能力越強[7-9]。采用SPSS 25.0軟件對DPPH 自由基清除法和ABTS自由基清除法所得清除率進行Logistic(邏輯)回歸分析，計算IC50，結果見表5。

由表5可知:對于DPPH 自由基清除法，10批樣品所得IC50大小排序依次為S6、S3、S9、S5、S1、S2、S7、S10、S4、S8，其中S8 樣品的抗氧化能力最強;對于ABTS自由基清除法，10批樣品所得IC50大小排序依次為S2、S6、S5、S10、S9、S1、S3、S4、S7、S8，其中S8樣品的抗氧化能力最強。

表5 10批樣品的抗氧化活性試驗結果Tab.5 Results of test for antioxidant activity of 10 batches of samples

2.4 相似度評價結果

采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統對10批樣品的指紋圖譜以及對照指紋圖譜進行相似度評價，結果見表6。

表6 指紋圖譜的相似度評價結果Tab.6 Evaluation results of fingerprint similarity

表6 (續(xù))

由表6可知，10批樣品的指紋圖譜及它們與對照指紋圖譜間的相似度結果均大于0.900，說明所選共有組分具有代表性，不同產地不同時間采摘的樣品質量穩(wěn)定性良好。

2.5 聚類分析結果

根據10批樣品24個共有組分峰面積，整理出10×24階原始數據矩陣，利用SPSS 25.0軟件中的功能描述對數據矩陣實行Z-score標準化處理，將處理后的數據作為變量，樣品編號作為個案標注依據，選擇組間聯接聚類法和平方歐氏距離進行聚類分析，所得結果見圖2。

圖2 10批樣品聚類分析譜系圖Fig.2 Hierarchical cluster analysis of 10 batches of samples

由圖2可知，當平方歐式距離為10時，可將10批樣品分為4類，即S4、S5、S6、S7、S10同屬一類，S1、S8、S9同屬一類，S2 一類，S3 一類。S1、S8、S9均為2018年5月采摘，S4、S5、S6、S7均為2021年1月采摘，說明采摘年份和季節(jié)可能影響聚類分析結果。S4、S5、S6、S10均采自喀什地區(qū)，S1、S9均采自和田地區(qū)，不同地區(qū)地勢海拔不一，說明地理位置也可能影響聚類分析結果。S2、S3 單獨歸屬于一類，可能是地理位置和采摘季節(jié)共同作用，導致產品質量產生較大差異。

2.6 主成分分析結果

將10批樣品的24個共有組分的峰面積匯總為數據矩陣后進行標準化處理，導入SPSS 25.0軟件中。將特征值設置為“＞1”，通過相關性矩陣進行主成分分析，自動得出5個主成分的特征值、方差貢獻率與成分載荷矩陣，特征值依次為10.803，4.805，2.564，2.120，1.815，方差貢獻率依次為45.012%，20.019%，10.682%，8.835%，7.564%，累積方差貢獻率為92.112%，說明這5個主成分能充分反映實際樣品的基本特征和主要信息[10]。其中，10批樣品組分的相似性可由主成分1所包含的各個組分反映出來[11]。主成分1得分來源于共有組分1，2，7，10，11，12，13，15，18，20的色譜峰，主成分2得分來源于共有組分3，4，5，6，21，23的色譜峰，主成分3得分來源于共有成分8，9，17的色譜峰，主成分4得分來源于共有成分14的色譜峰，主成分5得分來源于共有成分16，19，22，24的色譜峰。參考文獻[11]，由主成分1，2，3，4，5得分(Y1，Y2，Y3，Y4，Y5)計算10批樣品的綜合得分(Y)，公式為Y＝0.450 12Y1＋0.200 19Y2＋0.106 82Y3＋0.088 35Y4＋0.075 64Y5，10 批樣品 的綜合 得分分別為0.48，－2.95，3.12，－1.17，－0.52，0.24，0.08，0.85，0.58，－0.71，綜合得分大小排序依次為S3、S8、S9、S1、S6、S7、S5、S10、S4、S2，說明產自葉城縣的樣品(S3)質量最優(yōu)，其次為產自沙雅縣(S8)和皮山縣(S9)的樣品。

鑒于主成分1，2，3 的方差貢獻率較大，以這3個主成分得分建立三維坐標系，繪制得分散點圖，結果見圖3。

圖3 主成分分析得分散點圖Fig.3 Scatter chart of principal component analysis scores

由圖3可知，S4、S5、S6、S7、S10同屬一類，S1、S8、S9同屬一類，S3一類，S2一類，該分類結果與聚類分析的一致[12-13]。

2.7 灰色關聯分析結果

首先對原始數據進行標準化處理，然后將兩種自由基清除法得到的兩組IC50作為母序列，將24個共有組分峰面積數據作為子序列整合為數據矩陣，通過DPS數據處理系統進行灰色關聯分析，并計算關聯度[14-15]，關聯度越大，意味著該組分對抗氧化 活性的貢獻越大，反之則越小[16]。結果見表7。

表7 灰色關聯分析結果Tab.7 Gray correlation analysis results

由表7可知，24個共有組分與DPPH 自由基清除法或ABTS自由基清除法所得IC50的關聯度均大于0.600，說明昆侖雪菊樣品的強抗氧化活性是由多個組分協同作用產生的[15]。對于DPPH 自由基清除法，對樣品抗氧化活性貢獻較大(關聯度不小于0.800)的共有組分有5個，大小排序依次是20，1，7，21，24;對于ABTS自由基清除法，貢獻較大的共有組分也有5個，大小排序依次是14，24，23，1，11?？蓪⑸鲜?個共有組分作為后續(xù)開發(fā)利用昆侖雪菊的藥效控制點，建議重點關注對兩種方法抗氧化活性貢獻均較大的共有組分1，24。

本工作通過相關性分析，發(fā)現所選的24個共有組分具有代表性，且質量穩(wěn)定;通過聚類分析和主成分分析，將新疆不同產地不同采摘期的昆侖雪菊樣品分為4類;通過灰色關聯分析，探究了譜效關系，各提取出5個對抗氧化活性有較大貢獻的關鍵組分，可為昆侖雪菊產品的質量保證、關鍵組分提取以及藥理研究提供參考。