陳 靜,段國霞,劉麗君,李翠枝*,呂志勇
(內(nèi)蒙古伊利實業(yè)集團股份有限公司,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110)
赤蘚紅,又名櫻桃紅,是一種人工合成著色劑,由熒光素碘化而成,其性質(zhì)穩(wěn)定、色彩鮮艷、成本低廉。目前,赤蘚紅的應用很廣泛[1-4],其作為常見的人工食品添加劑已成為人們?nèi)粘O钠返囊徊糠諿5],可單獨使用或與其他食用色素復配使用,經(jīng)常添加于食品、藥品、化妝品中,也可以作為反應劑[6]等應用于各類研究中。GB 2760—2014《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》[7]對其使用量有嚴格規(guī)定,并建立了相應的國標方法[8]進行檢測,但對于赤蘚紅的檢測方法為液-液萃取法,操作方法復雜,且方法適用基質(zhì)有限。根據(jù)現(xiàn)有文獻報道,赤蘚紅應用的基質(zhì)很廣,食品類包括:蛋糕[9]、酒類[10]、飲料[11-12]、冷凍飲品[13]、肉制品[14]、罐頭[15]、糯米類[16-17]、蜜餞[18]、辣椒粉[19]等;藥品包括:中藥類[20-21]、西藥類[22]、藥品包裝[23-24]等;其他類包括:煙草類[25-27]等。其檢測方法也有很多,如高效液相色譜法[28]、超高效液相色譜法[29]、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[30-31]、共振瑞利散射法等其他方法[32-33]。但對發(fā)酵乳中赤蘚紅的測定還少有報道。發(fā)酵乳中一般不添加赤蘚紅,對于含有果醬、果泥、果粒等的果品發(fā)酵乳會有一定的帶入風險,對產(chǎn)品質(zhì)量控制和風險控制產(chǎn)生潛在風險。
本研究擬建立發(fā)酵乳中赤蘚紅的反相高效液相色譜檢測方法。采用酶法水解蛋白,無水乙醇提取,堿性條件下固相萃取小柱凈化富集,經(jīng)反相C18柱分離,紫外可見檢測器檢測,保留時間定性,外標法定量。
發(fā)酵乳 市售。
甲醇(色譜純)(諾爾施) 成都市科隆化學品有限公司;無水乙醇(色譜純) 福晨(天津)化學試劑有限公司;氨水(優(yōu)級純) 天津市富宇精細化工有限公司;乙酸銨(優(yōu)級純) 天津市光復精細化工研究所;氫氧化鈉(分析純) 天津市風船化學試劑科技有限公司;實驗用水為Milli-Q超純水;赤蘚紅標準品(純度85.7%) 德國Dr.Ehrensorfer公司;木瓜蛋白酶(酶活力2 000 U/mg) 上海泰坦科技股份有限公司;HLB固相萃取小柱(3 cc,60 mg) 美國Waters公司。
1260高效液相色譜儀(配備紫外檢測器) 美國安捷倫公司;AL204分析天平、PE20K pH計 瑞士Mettler-Toledo公司;SHA-B水浴恒溫振蕩器 常州市凱航儀器有限公司;KQ-600DB數(shù)控超聲清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;3K30高速離心機 德國Sigma公司;TurboVap LV氮氣濃縮裝置 美國Biotage公司;0.45 μm微孔過濾器 上海安譜實驗科技股份有限公司。
1.3.1 流動相溶液配制
乙酸銨溶液(20 mmol/L,pH 6.5):稱取1.542 g乙酸銨于800 mL超純水中,用冰乙酸調(diào)節(jié)pH值至6.5,用超純水定容至1 000 mL。
體積分數(shù)5%氨化甲醇溶液:量取甲醇95 mL、氨水5 mL混勻。
氫氧化鈉溶液(20 g/L):稱取2 g氫氧化鈉,加水至100 mL,溶解混勻。
1.3.2 標準溶液配制及標準曲線的繪制
赤蘚紅標準儲備液(1.00 mg/mL):準確稱取按其純度折算為100%質(zhì)量的赤蘚紅標準品0.100 g,置于100 mL容量瓶中,用水定容至刻度。
赤蘚紅標準中間液(100 μg/mL):準確移取赤蘚紅標準儲備液1.0 mL于10 mL容量瓶中,用水定容至刻度。
赤蘚紅標準工作液:上述混合中間液用水分別稀釋成質(zhì)量濃度為0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、5.00、10.00、20.00 μg/mL的工作液?,F(xiàn)用現(xiàn)配。
標準曲線制作:將混合標準工作液進行色譜測定,記錄各組分的色譜峰面積,以質(zhì)量濃度為橫坐標(x),峰面積為縱坐標(y),繪制標準曲線。
1.3.3 樣品處理
準確稱取試樣1.0 g(精確至0.000 1 g)于10 mL容量瓶,加入0.04 U木瓜蛋白酶,加水至約3 mL,60 ℃水浴30 min[34]。酶解后的試樣自然冷卻至室溫,使用無水乙醇定容至10 mL,振蕩搖勻,超聲30 min,于4 ℃、8 000 r/min離心5 min。取上清液5 mL,使用20 g/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH 7.5~7.7。上述前處理溶液加入活化好的HLB小柱(分別使用5 mL甲醇、5 mL水活化),速率為1 滴/s,待液體全部留出,用水洗滌,然后用6 mL 5%氨化甲醇溶液洗脫,收集洗脫液,于氮吹濃縮儀上60 ℃吹干,加入1.0 mL水溶解,搖勻后上機。
1.3.4 色譜條件
色譜柱:月旭-AQ C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相:20 mmol/L乙酸銨緩沖鹽(pH 6.5)-甲醇體系,梯度洗脫程序如表1所示;檢測器波長520 nm;進樣量30 μL;柱溫40 ℃;流速1 mL/min。
表1 流動相梯度洗脫程序Table 1 Mobile phase gradient elution procedure
1.3.5 結果計算
將試樣溶液進行色譜測定,記錄各組分的色譜峰面積。按照下式計算樣品中赤蘚紅的含量。
式中:X為樣品中赤蘚紅含量/(mg/kg);ρ為由標準曲線計算得出的試樣中赤蘚紅質(zhì)量濃度/(μg/mL);V為定容體積/mL;n為稀釋倍數(shù);m為樣品質(zhì)量/g。
1.3.6 回收率和精密度測定
回收率測定:在空白發(fā)酵乳中分別添加不同量的赤蘚紅,進行加標回收實驗,分別平行測定6 次,并計算相對標準偏差(relative standard deviation,RSD)。
精密度測定:對發(fā)酵乳加標樣品分別進行6 次重復測定,并計算RSD。
使用Excel軟件進行處理及分析。
2.1.1 加酶量的選擇
一般合成著色劑與蛋白質(zhì)的相互作用力通常被認為是非共價鍵作用,包括氫鍵、范德華力、疏水及靜電作用等[35],使用木瓜蛋白酶對蛋白質(zhì)進行酶解,生成小分子的肽[36-37],破壞了蛋白質(zhì)的結構,減少了非共價鍵作用,從而可以使合成著色劑更易使用無水乙醇提取。發(fā)酵乳的pH值一般為4.6~5.2,均為酸性,蛋白質(zhì)處于緊密結合的狀態(tài),使用單一有機溶劑不能完全提取發(fā)酵乳中的赤蘚紅,需要分解蛋白質(zhì)后再進行提取。
分解樣品中蛋白質(zhì)所需木瓜蛋白酶量與樣品蛋白質(zhì)含量相關,即與樣品稱樣量相關。確定樣品稱樣量為1 g,使用赤蘚紅添加量為1.0 mg/kg的發(fā)酵乳試樣進行不同加酶量實驗。由圖1可知,當樣品稱樣量為1 g,加酶量大于0.03 U時,赤蘚紅回收率均大于90%,而加酶量為0.04 U時回收率大于95%。使用Minitab軟件對赤蘚紅回收率結果進行單因子方差分析,表明在95%置信度下,不同加酶量的回收率有顯著差異??悸实矫赋杀竞透呋厥章试瓌t等因素,確定加酶量為0.04 U作為后續(xù)實驗最佳條件。
圖1 不同加酶量與赤蘚紅回收率結果箱線圖(nn==33)Fig.1 Effect of papain dosage on the recovery of erythrosine (n = 3)
2.1.2 提取溶劑的選擇
一般合成著色劑的提取溶劑有氨水-無水乙醇體系等有機溶劑和水相溶劑。因氨水具有高揮發(fā)性和強刺激性,對人體有一定的危害。分別采用無水乙醇、甲醇、水作為提取溶劑,對赤蘚紅添加量為1.0 mg/kg的發(fā)酵乳試樣進行實驗,平行測定3 次。由圖2可知,在95%置信度下,不同提取溶劑的回收率結果有顯著差異。使用水作為提取溶劑,因受發(fā)酵乳溶液pH值的影響,赤蘚紅與蛋白質(zhì)的結合比較緊密,其提取回收率較低;使用有機溶劑提取時,同樣條件下無水乙醇的提取回收率比甲醇高。綜上所述,選擇無水乙醇作為提取溶劑。
圖2 不同提取溶劑與赤蘚紅回收率結果箱線圖(nn==33)Fig.2 Effect of extraction solvents on the recovery of erythrosine (nn = 3)
2.1.3 提取溶劑添加量的選擇
提取溶劑的提取能力是影響回收率結果的關鍵,一般情況下,有機溶劑與水相的比例會影響目標物的提取,即酶解水相與提取溶劑體積比會影響回收率。對赤蘚紅添加量為1.0 mg/kg的發(fā)酵乳試樣,采用酶解水相與無水乙醇體積比分別為2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4進行實驗。由圖3可知,在95%置信度下,不同體積比對回收率結果有顯著影響。體積比2∶8、3∶7、4∶6的回收率均在90%以上,符合GB/T 27404《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》關于回收率的要求。實驗使用體積比4∶6提取,樣液離心后,溶液仍不澄清,不利于過柱;體積比2∶8和3∶7條件下回收率較高,均大于95%。在95%置信度下,體積比2∶8和3∶7對回收率結果無顯著影響,但體積比2∶8條件下操作時,2 mL的水不易完全溶解樣品,尤其是黏稠的發(fā)酵乳樣品,影響樣品酶解及測定值的準確性,故確定酶解水相與無水乙醇體積比3∶7作為提取溶劑的最佳比例。
圖3 不同酶解水相與無水乙醇體積比與赤蘚紅回收率結果箱線圖(nn==33)Fig.3 Effect of volume ratio between enzymatic hydrolysate and anhydrous ethanol on the recovery of erythrosine (nn = 3)
2.1.4 超聲時間的選擇
分別使用超聲時間10、20、30、40 min進行實驗。由圖4可知,在95%置信度下,不同的超聲時間對回收率結果有影響。超聲時間10、20、30、40 min條件下的回收率均在90%以上,符合GB/T 27404關于回收率的要求。而超聲時間30、40 min的回收率均大于95%,考慮到高回收率和時間節(jié)約原則,選擇超聲時間為30 min。
圖4 不同超聲時間與赤蘚紅回收率結果箱線圖(nn==33)Fig.4 Effect of ultrasonic time on the recovery of erythrosine (nn = 3)
目前文獻方法中使用的固相萃取小柱有聚酰胺小柱、HLB小柱等。聚酰胺小柱的一般上柱方式是酸性上柱、淋洗,堿性洗脫,赤蘚紅色素耐酸堿性較差,故本研究選擇HLB固相萃取小柱進行凈化富集,并對樣液過柱pH值進行研究。分別調(diào)節(jié)樣液pH值為4.6、5.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5進行實驗。由圖5可知,pH值7.5時的回收率大于90%,且回收率穩(wěn)定,在95%置信度下,不同的過柱pH值對回收率結果有顯著影響。需要進一步選擇pH值范圍,細化pH值為7.4、7.5、7.6、7.7、7.8,由圖6可知,pH值7.4~7.7時的回收率均大于90%且穩(wěn)定,符合GB/T 27404關于回收率的要求,在95%置信度下,不同的過柱pH值對回收率有顯著影響,pH值為7.4和7.8時的回收率均小于95%,pH值為7.5、7.6、7.7時回收率均大于95%。由圖7可知,進一步分析發(fā)現(xiàn),pH值為7.5~7.7條件下,在95%置信度下,不同的過柱pH值對回收率無顯著影響??紤]高回收率原則,選擇過柱pH值為7.5~7.7。
圖5 不同上柱pH值(4.6、5.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5)與赤蘚紅回收率結果箱線圖(nn==33)Fig.5 Effect of sample pH (4.6, 5.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, and 8.5) on the recovery of erythrosine (nn = 3)
圖6 不同上柱pH值(7.4、7.5、7.6、7.7、7.8)與赤蘚紅回收率結果箱線圖(nn==33)Fig.6 Effect of sample pH (7.4, 7.5, 7.6, 7.7 and 7.8) on the recovery of erythrosine (nn = 3)
圖7 不同上柱pH值(7.5、7.6、7.7)與赤蘚紅回收率結果箱線圖(nn==33)Fig.7 Effect of sample pH (7.5, 7.6 and 7.7) on the recovery of erythrosine (nn = 3)
2.3.1 線性方程與相關系數(shù)
將不同質(zhì)量濃度的赤蘚紅系列標準工作液在不同時間、上述洗脫條件下經(jīng)高效液相色譜儀測定,并計算線性回歸方程。由表2可知,配制3 d的標準工作液得到的標準工作曲線的相關系數(shù)均大于0.999,表明目標物的線性關系良好。
表2 赤蘚紅的線性回歸方程及相關系數(shù)Table 2 Linear regression equations and correlation coefficients for erythrosine standard solution stored for different time periods
2.3.2 定量限與檢出限
對赤蘚紅添加量為2 mg/kg的發(fā)酵乳試樣進行測定,由圖8可知,色譜圖雜質(zhì)峰干擾小,分離度為2.56,符合《中國藥典》中關于分離度≥1.5的要求。
圖8 發(fā)酵乳加標樣品反相高效液相色譜圖Fig.8 Reversed-phase high performance liquid chromatogram of spiked fermented milk
由表3可知,按照信噪比(RS/N)均滿足≥3的要求,赤蘚紅的檢出限為0.1 mg/kg,按照RS/N均滿足≥10的要求,赤蘚紅的定量限為0.2 mg/kg。
表3 赤蘚紅的檢出限與定量限Table 3 LODs and LOQs of erythrosine
2.3.3 方法的回收率與精密度
測定發(fā)酵乳中添加定量限、2 倍定量限和10 倍定量限3 個不同添加量赤蘚紅的加標回收率。由表4可知,赤蘚紅的加標回收率為93.1%~105.6%,RSD為1.87%~2.21%,說明該方法測定發(fā)酵乳中赤蘚紅具有很好的準確度和精密度。
表4 赤蘚紅的加標回收率及精密度測定結果(nn==66)Table 4 Recoveries and precision (RSD) of erythrosine in spiked fermented milk (nn = 6)
根據(jù)本研究方法對市售7 款含果品發(fā)酵乳進行測定,由表5可知,目前市售添加果泥、果粒等原料的發(fā)酵乳未檢出赤蘚紅。
表5 樣品中赤蘚紅測定結果Table 5 Results of erythrosine detection in real samples
采用反相高效液相色譜法對發(fā)酵乳中赤蘚紅的含量進行測定時,樣品采用酶法水解蛋白、無水乙醇提取,堿性過柱凈化,采用C18色譜柱分離,應用甲醇-乙酸銨緩沖溶液作為流動相進行梯度洗脫。結果表明,本方法準確度滿足定量要求,方法精密度良好,回收率高,操作簡便,適用于發(fā)酵乳中赤蘚紅含量的測定,可為發(fā)酵乳中赤蘚紅的檢測及風險監(jiān)控提供技術支持。