續(xù)釗 ，張?jiān)?，盧前明

(1.鄭州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，鄭州 450121；2.河南工程學(xué)院 資源與安全工程學(xué)院，鄭州 451191)

玫瑰屬于薔薇科植物[1]，多年生常綠灌木，生長在陽光充足的地方，在全球各地尤其是在北半球地區(qū)被廣泛栽培[2]。我國的玫瑰花栽培已經(jīng)有近2000年的歷史，主要栽培在甘肅、新疆、云南和山東等地，玫瑰屬于我國重要的經(jīng)濟(jì)作物[3-5]。

玫瑰花除了具有特殊的香味外，還富含多種營養(yǎng)物質(zhì)[6]，其中維生素、脂肪酸和多種礦物質(zhì)化合物含量最為豐富[7]。已有研究表明[8]，在云南地區(qū)可食用玫瑰中主要的營養(yǎng)成分有維生素C、粗纖維和蛋白質(zhì)[9]。而食用玫瑰中的營養(yǎng)成分和礦物質(zhì)元素也多于普通的蔬菜，此外，食用玫瑰還可以作為補(bǔ)充人體微量元素和膳食纖維的食物[10-11]。

隨著蔬菜、水果、種子和植物的根基不斷被開發(fā)利用，消費(fèi)者開始將眼光投向了食用花卉[12]。在一些亞洲國家，花卉也成為了藥物和傳統(tǒng)食物。將花卉加入食物中，不僅可以改善食物的外觀，也能提高食物的營養(yǎng)價(jià)值[13-14]。玫瑰花在食品行業(yè)中可以用于制作果醬、果汁、醋、酒、奶油蛋糕和糖漿等[15-16]。玫瑰醬在發(fā)酵過程中，產(chǎn)生氨基酸、酚類和黃酮等風(fēng)味物質(zhì)，使得玫瑰醬不僅具有特殊的香味，也具有藥用和保健功效[17]。

微生物是玫瑰醬發(fā)酵的核心，能夠?qū)⒚倒寤ㄖ械囊恍I養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)化為營養(yǎng)因子[18]。經(jīng)過微生物發(fā)酵的玫瑰通常都具有微生物功能特性，從而提高食物本身的營養(yǎng)價(jià)值[19]。微生物群落結(jié)構(gòu)在玫瑰醬發(fā)酵過程中有著至關(guān)重要的作用，對玫瑰醬的產(chǎn)品質(zhì)量和口感均會(huì)產(chǎn)生明顯影響。目前關(guān)于玫瑰醬中微生物的種類研究較少，玫瑰醬中的微生物群落結(jié)構(gòu)也尚不清晰。所以，本研究基于此，對玫瑰醬中的微生物群落和結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究。

1 試驗(yàn)材料及方法

1.1 試驗(yàn)材料

選取3個(gè)國內(nèi)較為傳統(tǒng)的玫瑰醬產(chǎn)區(qū)，a1，a2為云南大理，a3，a4為山東平陰，a5為貴州貴陽。所有的樣品在2020年采集，每個(gè)樣品被平均分成4份，均保存在-21 ℃的冰箱中。

1.2 儀器和設(shè)備

高速離心機(jī)、高壓蒸汽滅菌鍋、電子天平、PCR儀 上海儀器科技有限公司；電泳儀、1 000 mL移液槍、恒溫水浴鍋 杭州旌斐儀器科技有限公司。

1.3 玫瑰醬制作工藝流程

1.3.1 工藝流程

烘干的玫瑰花→加入蒸餾水復(fù)原→加入檸檬水→打漿→調(diào)配→熬制→裝罐→密封→殺菌→冷卻→成品。

1.3.2 操作要點(diǎn)

1.3.2.1 原材料選擇

選擇花瓣飽滿、色澤鮮艷、香氣濃郁的玫瑰花。將外層變黃的花瓣、花蕊和花萼去除之后用清水洗凈備用。

1.3.2.2 復(fù)原

原材料整理結(jié)束之后，按料液比例為1∶4加入蒸餾水，在45 ℃的條件下加熱使干玫瑰花復(fù)原20 min，冷卻至室溫，加入一定比例的檸檬水，混勻，調(diào)節(jié)溶液的pH為5.0。

1.3.2.3 打漿

用磨碎機(jī)將配好的玫瑰花瓣打漿處理，磨碎之后再使用膠體磨對原料進(jìn)一步處理，使玫瑰花漿均勻細(xì)膩。

1.3.2.4 調(diào)配

將玫瑰花醬、甲基纖維素鈉和瓊脂混合均勻，用小火熬制，不斷攪拌，攪拌期間不斷加入蔗糖溶液，一直熬至玫瑰醬中40%為固形物，之后裝罐密封。

1.3.2.5 殺菌

裝罐密封之后，將玫瑰醬放入滅菌鍋中，在100 ℃條件下加熱5 min，之后將玫瑰醬取出，在自然條件下冷卻，即制成玫瑰醬成品。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 玫瑰醬中微生物DNA的提取

采用宏基因組DNA試劑盒從玫瑰醬中提取1 mL樣品，之后用濃度1%的瓊脂糖凝膠，在電泳儀上對DNA質(zhì)量進(jìn)行測定。

1.4.2 PCR擴(kuò)增與高通量測序

以提取的DNA作為模板，用引物341F和引物805R擴(kuò)增DNA中的細(xì)菌，PCR條件：94 ℃預(yù)熱4 min，94 ℃變性30 s，50 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸10 min。采用真菌的正向引物ITS1和反向引物ITS4擴(kuò)增，PCR條件：94 ℃預(yù)熱4 min，94 ℃變性30 s，50 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸 10 min。PCR產(chǎn)物由生工生物工程(上海)股份有限公司測序完成。

2 結(jié)果與討論

2.1 玫瑰醬中微生物多樣性分析

為了研究玫瑰醬中微生物的多樣性，把玫瑰醬中進(jìn)行宏基因組分析所獲得的序列按照99%的相似性進(jìn)行OTU分類，對玫瑰醬中微生物進(jìn)行篩選之后，發(fā)現(xiàn)玫瑰醬中的細(xì)菌序列為32 122～120 312，一共有1 657個(gè)OTU，玫瑰醬中一共有真菌序列34 122～110 021，一共有2 109個(gè)OTU。

圖1中A和B為玫瑰醬中的微生物稀疏性分析，5種發(fā)酵的玫瑰醬中真菌和細(xì)菌的稀疏性都比較平坦，結(jié)果表明，玫瑰醬中宏基因組測序數(shù)據(jù)較為合理。

圖1 玫瑰醬中細(xì)菌稀疏性曲線(A)和真菌稀疏性曲線(B)Fig.1 Bacterial sparsity curve (A) and fungal sparsity curve (B) in rose sauce

玫瑰醬中的微生物多樣性用Shannon指數(shù)、ACE指數(shù)、Chaol指數(shù)和Simpson指數(shù)進(jìn)行分析，表示真菌和細(xì)菌在玫瑰醬中的多樣性和豐富度見表1和表2。

表1 細(xì)菌在玫瑰醬中的操作分類學(xué)單元(OTUs)Table 1 Operational taxonomic units (OTUs) of bacteria in rose sauce

表2 真菌在玫瑰醬中的操作分類學(xué)單元(OTUs)Table 2 Operational taxonomic units (OTUs) of fungi in rose sauce

由表1可知，樣本a2的ACE指數(shù)和Chaol指數(shù)相比于其他樣本較高，分別為1 623.167和391.19，說明a2玫瑰醬樣本中的細(xì)菌豐富度較高。在表2中，a1樣本的ACE指數(shù)和Chaol指數(shù)比其他樣本高，表明a1中的真菌多樣性比其他樣本高。

在表1中，a4樣本的Simpson指數(shù)最低，為0.27，Shannon指數(shù)最高，為7.124，表明a4是玫瑰醬樣本中細(xì)菌多樣性最高的。在表2中，a2樣本的Simpson指數(shù)最低，Shannon指數(shù)最高，分別為0.18和2.867，表明a2樣本中真菌的多樣性最高。

2.2 玫瑰醬中微生物群落結(jié)構(gòu)分析

采用宏基因組對玫瑰醬中細(xì)菌多樣性進(jìn)行分析，玫瑰醬在門和屬水平上的細(xì)菌多樣性見圖2，只有相對豐度值大于0.01%的細(xì)菌群落被展示在圖2中。

圖2 細(xì)菌群落在玫瑰醬中門(A)和屬(B)水平上相對豐度基于99%的序列相似性Fig.2 Relative abundance of bacterial communities of rose sauce at the phylum (A) and genus (B) levels based on 99% sequence similarity

由圖2中A可知，在自然發(fā)酵的5種玫瑰醬中，一共有31個(gè)門的細(xì)菌被檢測出來，其中變形菌門、厚壁菌門和擬桿菌門3個(gè)菌門為優(yōu)勢菌。在5個(gè)不同的樣本中，細(xì)菌優(yōu)勢群落存在一定的差異，a3樣本中擬桿菌門的細(xì)菌明顯多于其他4個(gè)樣本，變形菌門的微生物量明顯少于其他4個(gè)樣本。先前的一些研究結(jié)果也表明[19]，發(fā)酵食品中優(yōu)勢細(xì)菌主要為變形菌門和擬桿菌門，這些結(jié)論與我們的研究結(jié)果也相近。

由圖2中B可知，在屬水平上，5種發(fā)酵產(chǎn)品中的假單胞屬、泛菌屬、羅森伯氏菌屬、伯克氏菌屬和勞爾氏菌屬是明顯的優(yōu)勢屬，但是不同的樣本中，優(yōu)勢屬所占的比例有所差異。在5個(gè)樣本中，假單胞屬相比于其他菌群明顯占有優(yōu)勢。這主要是由于玫瑰醬在發(fā)酵過程中，不同樣本的發(fā)酵環(huán)境存在一定差異。

采用現(xiàn)代分類學(xué)，對玫瑰醬中的真菌多樣性進(jìn)行分析，結(jié)果表明，玫瑰醬中的真菌一共有10個(gè)門，38個(gè)綱，79個(gè)目，130個(gè)科和319個(gè)屬。由圖3可知，5個(gè)樣本的玫瑰醬中，優(yōu)勢的真菌門為擔(dān)子菌門、子囊菌門和其他未分類的真菌。在a5樣品中，樣品中的真菌基本都為擔(dān)子菌類，a1樣品中其他未分類的真菌所占的比例相對于其他類型較大。

圖3 真菌群落在玫瑰醬中門(A)和屬(B)水平上相對豐度基于99%的序列相似性Fig.3 Relative abundance of fungal communities of rose sauce at the phylum (A) and genus (B) levels based on 99% sequence similarity

從屬水平可以看出，5種玫瑰醬中，最多的是酵母菌屬，其次是葡萄菌屬和間座殼屬。雖然不同的樣本中，真菌在屬水平上存在一定的差異，但是不同樣本屬多樣性存在的差異并不明顯。研究人員采用高通量測序?qū)Χ拱赆u中微生物多樣性進(jìn)行研究，研究結(jié)果表明，豆瓣醬中結(jié)合菌門、擔(dān)子菌門和子囊菌門是優(yōu)勢真菌門，而屬水平上的曲霉屬和酵母菌屬是郫縣豆瓣醬的優(yōu)勢屬。與真菌多樣性相比，玫瑰醬中的細(xì)菌多樣性更加均勻，從5種玫瑰醬中，可以得出，不同的玫瑰醬中存在的真菌和細(xì)菌具有一定差異，此外，我們的研究結(jié)果表明，玫瑰醬中也包含一些分類地位尚不清晰的物種。

3 小結(jié)

玫瑰醬的生產(chǎn)一般情況是在開放環(huán)境中進(jìn)行的，在加工過程中不需要?dú)⒕?，所以玫瑰醬中微生物種類豐富。我國的玫瑰醬產(chǎn)地眾多，但是玫瑰醬的生產(chǎn)沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，導(dǎo)致不同的區(qū)域，甚至同一區(qū)域不同的生產(chǎn)時(shí)間，玫瑰醬的口感、風(fēng)味和品質(zhì)存在較大的差異[20]。另外，玫瑰醬中由微生物病原體造成的污染而引起的安全問題被社會(huì)廣泛關(guān)注。

采用宏基因組的方法，對5種玫瑰醬中的微生物多樣性進(jìn)行研究和分析，研究結(jié)果表明，玫瑰醬中優(yōu)勢的細(xì)菌菌門包括變形菌門、厚壁菌門和擬桿菌門，優(yōu)勢的細(xì)菌屬包括假單胞屬、泛菌屬、羅森伯氏菌屬、伯克氏菌屬和勞爾氏菌屬；優(yōu)勢的真菌門包括擔(dān)子菌門、子囊菌門，優(yōu)勢的真菌屬包括酵母菌屬，其次是葡萄菌屬和間座殼屬。