吳丹，楊苗苗，杜小平，祁蒙，楊水云

(1.陜西學(xué)前師范學(xué)院 生命科學(xué)與食品工程學(xué)院,西安 710100；2.安康市富硒產(chǎn)品研發(fā)中心，陜西 安康 725000；3.西安交通大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，西安 710049)

納豆激酶(NK)是納豆中最具開發(fā)價(jià)值的成分，該酶為枯草蛋白酶類第一個(gè)具有纖溶作用的酶，可以應(yīng)用于臨床的溶栓治療過程中[1]。納豆激酶是一種由納豆芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)生的堿性胞外絲氨酸蛋白酶，具有良好的溶栓作用[2]，可有效預(yù)防或治療心腦血管疾病[3-4]。該酶與目前溶栓藥物如尿激酶(urokinase，UK)和鏈激酶(streptokinase，SK)相比，具有pH廣[5]、溫度耐受性強(qiáng)及溶栓特異性等優(yōu)點(diǎn)[6—7]。

Chandrasekaran等[8]發(fā)酵生產(chǎn)的NK可溶解94%的人工血栓；Janh等[9]研究表明NK在小鼠體內(nèi)有一定的溶栓效果；Hsia等[10]和Yuko等[11]研究證實(shí)口服NK后，NK在體內(nèi)有良好的溶栓效果。NK的優(yōu)勢(shì)在于其對(duì)纖維蛋白，尤其是對(duì)交聯(lián)的纖維蛋白特別敏感，可直接作用于血栓中的纖維蛋白,將其溶解為小肽和氨基酸[12—13]。這一特性使得NK更偏好溶解血栓中的纖維蛋白而不易溶解血漿纖維蛋白原，因而不會(huì)破壞正常凝血機(jī)制而引發(fā)出血，且目前臨床現(xiàn)用的溶栓劑無此特點(diǎn)，但目前NK產(chǎn)品純度較低，因此，提高NK純度意義重大。

工業(yè)上生產(chǎn)NK都是從納豆桿菌的發(fā)酵液中提取純化的。報(bào)道的NK純化方案，常集多種手段聯(lián)合使用。但在總結(jié)前人純化結(jié)果后發(fā)現(xiàn)[14—19]，使用柱層析法，NK的酶活回收率普遍不高，不僅如此，柱層析法也具有成本高、方法繁瑣、步驟較多、耗時(shí)且難以規(guī)?；a(chǎn)的缺點(diǎn)[20]。超濾法可以有效地去除料液中相對(duì)分子質(zhì)量較大和較小的組分，避免了鹽析方法中高滲作用所造成的酶活性降低，但純化倍數(shù)很低。利用親和吸附法對(duì)NK純化，例如用大豆顆粒對(duì)NK進(jìn)行特異性吸附，吸附的配體結(jié)構(gòu)不清楚[21]，操作較為復(fù)雜，不適合工業(yè)化生產(chǎn)。

在納豆桿菌發(fā)酵豆類制作的納豆表面，可以看見很長(zhǎng)的拉絲狀黏液。在納豆桿菌發(fā)酵黃豆粉產(chǎn)生NK的液體發(fā)酵中，也總是伴隨著大量黏液的產(chǎn)生，其產(chǎn)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于NK，現(xiàn)已研究清楚，該黏液的主要成分為γ-聚谷氨酸(γ-polyglutamic acid，γ-pGA)[22—25]，分子量為100～1 000 kDa，等電點(diǎn)為2.5，屬于典型的酸性高聚物，而NK的分子量?jī)H為27.7 kDa，等電點(diǎn)為8.7。在pH 7.0～7.5的發(fā)酵液中，NK帶正電而γ-pGA帶負(fù)電，二者通過靜電力以“偶聯(lián)狀態(tài)”結(jié)合，形成以大分子量的γ-pGA為載體的多分子納豆激酶聯(lián)合物，從而大大降低了NK的表觀活性[26]。目前，基于以上工藝的NK產(chǎn)品無法實(shí)現(xiàn)微劑量服用目標(biāo)，更不能滿足注射針劑的要求，因此要獲得高純度的NK，需要將大量γ-pGA從粗產(chǎn)品中去除。

本研究在建立可行的液體發(fā)酵法生產(chǎn)NK工藝的基礎(chǔ)上，提出了從發(fā)酵液純化NK的下游方案，該方案大幅度提高了NK的純度。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和供試樣品

納豆芽孢桿菌N5：西安交通大學(xué)生命學(xué)院基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)室分離純化所得；供試樣品為市售的脫脂豆粕及黃豆。

1.1.2 試劑及培養(yǎng)基

試劑：纖維蛋白原、凝血酶、尿激酶和γ-聚谷氨酸，購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；瓊脂糖，購(gòu)自Amresco公司；十六烷基三甲基溴化銨，購(gòu)自Alfa Aesar公司；BCA蛋白定量試劑盒，購(gòu)自碧云天生物技術(shù)。其余化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

LB培養(yǎng)基：用于菌種的活化及種子液的配制。1%胰蛋白胨，0.5%酵母提取物，1% NaCl。

天然發(fā)酵培養(yǎng)基：用于納豆激酶的發(fā)酵。3%脫脂豆粕勻漿攪拌，用1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH為7.4左右，121 ℃高壓滅菌20 min。

1.1.3 主要儀器設(shè)備

THA-3560C立式滅菌鍋 Tsao Hsin公司；酶標(biāo)儀 Molecular Devices公司；BSA124S 電子天平 德國(guó)Sartorius公司；PYX-DHS-40X50電熱恒溫培養(yǎng)箱 廣州滬瑞明儀器有限公司；LYZ-Z00B恒溫?fù)u床 上海龍躍儀器設(shè)備有限公司；Centrifuge 5810R離心機(jī) Eppendorf公司；SW-CJ-1FD潔凈工作臺(tái) 蘇凈安泰公司；冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 納豆芽孢桿菌N5的培養(yǎng)及發(fā)酵方法

將納豆芽孢桿菌N5接種于LB液體培養(yǎng)基中，在37 ℃條件下，在轉(zhuǎn)速200 r/min的恒溫?fù)u床中振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期測(cè)定其吸光度，計(jì)算接種量。

3%的脫脂豆粕勻漿攪拌，用1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH為7.4左右，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。冷卻至室溫后接種。納豆芽孢桿菌種子液的接種量為0.05 OD/mL，恒溫37 ℃，搖床轉(zhuǎn)速200 r/min，發(fā)酵時(shí)間36 h。發(fā)酵完成后，發(fā)酵液于2 000 g條件下離心10 min，上清液為液體發(fā)酵的納豆激酶溶液，利用纖維蛋白原平板法測(cè)定NK產(chǎn)量(Fu/g豆粕)。

1.2.2 納豆激酶活力的測(cè)定

納豆激酶的活力采用纖維蛋白原平板法[27]。根據(jù)樣品的數(shù)量，用直徑為2 mm的打孔器進(jìn)行打孔。

1.2.3γ-聚谷氨酸的定量檢測(cè)方法

在已有檢測(cè)方法[28]的基礎(chǔ)上進(jìn)行如下改良：在350 nm的波長(zhǎng)條件下，采用CTAB的NaOH溶液(10 g/L)檢測(cè)γ-pGA。

1.2.4 納豆激酶發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

1.2.4.1 單因素條件優(yōu)化

根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在確定發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源為1%的甘油的基礎(chǔ)上，以納豆激酶的活力為指標(biāo)，采用單因素實(shí)驗(yàn)研究豆粕、谷氨酸鈉及無機(jī)鹽含量對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響。發(fā)酵培養(yǎng)基的豆粕含量為1%、3%、5%、7%、9%；谷氨酸鈉的質(zhì)量濃度為0.5%、1%、1.5%、2%、3%；MgSO4·7H2O的質(zhì)量濃度為0.1%、0.3%、0.5%、0.7%。以天然發(fā)酵培養(yǎng)基為對(duì)照。按0.05 OD/mL接種納豆桿菌種子液，在37 ℃、200 r/min的條件下發(fā)酵36 h，測(cè)定纖溶圈直徑，選取適宜的單因素條件。

1.2.4.2 多因素正交優(yōu)化

在以上描述的各個(gè)單因素優(yōu)化的基礎(chǔ)上，根據(jù)正交表設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化最優(yōu)碳氮源質(zhì)量濃度、谷氨酸鈉及硫酸鎂含量等。測(cè)定并比較培養(yǎng)基優(yōu)化前后的NK產(chǎn)量(Fu/mL)。

1.2.5 納豆激酶與γ-聚谷氨酸解離及收集

在培養(yǎng)基中接種0.05 OD/mL的納豆芽孢桿菌N5，37 ℃下200 r/min發(fā)酵36 h。用pH 10、10倍的Gly-NaOH緩沖液調(diào)節(jié)發(fā)酵液的pH至10，使得NK和γ-pGA均帶負(fù)電，不再緊密結(jié)合。充分振蕩混勻后，在2 000 g條件下離心10 min，收集上清液，沉淀用pH為10的Gly-NaOH緩沖液洗滌1次，2 000 g條件下再離心10 min，合并上清液待用。

1.2.6 不同pH值下NK產(chǎn)量的測(cè)定

發(fā)酵完成后，取原始發(fā)酵液1 mL，用pH為10的Gly-NaOH緩沖液調(diào)節(jié)pH至10，稀釋至 2 mL，在渦旋儀上激烈振蕩后，2 000 g條件下離心10 min后取上清液，采用纖維蛋白原平板法測(cè)定上清液的NK產(chǎn)量；以原始發(fā)酵液稀釋1倍作對(duì)照。

1.2.7 十六烷基三甲基溴化銨沉淀γ-聚谷氨酸條件優(yōu)化

將不同濃度的CTAB水溶液與“1.2.1”中得到的NK溶液等比例混合，用力搖勻后在1 000 g下離心10 min。收集含有NK的上清液，并分別測(cè)定上清液中殘留的γ-pGA含量和NK的效價(jià)，得到去除γ-pGA的方案。

1.2.8 三相法濃縮提取納豆激酶

采用三相法濃縮含有NK的上清液，具體參考張慶慶等[28-31]的方法進(jìn)行。

1.2.9 納豆激酶凍干粉效價(jià)測(cè)定

磁力攪拌條件下，在pH 8.7、0.05 mol/L的Tris-HCl緩沖液中，對(duì)三相法收集的中間NK相進(jìn)行透析，每隔2 h換液，2～3次后，于4 ℃進(jìn)行透析過夜。透析液置入培養(yǎng)皿中，厚度在1 cm左右，放入-80 ℃冰箱中預(yù)凍，取出后放入冷凍干燥機(jī)中干燥24 h，即為高純NK凍干粉。取NK凍干品5 mg，溶于0.5 mL 0.05 mol/L的Gly-NaOH緩沖液中(pH 10)(NK的最適pH為9～10)，充分振蕩混勻后，采用纖維蛋白原平板法測(cè)定對(duì)應(yīng)產(chǎn)品的效價(jià)。

1.2.10 計(jì)算公式

NK回收率的計(jì)算方法：回收率(%)=(離心后單位體積酶活×離心后酶溶液體積)/(離心前單位體積酶活×離心前酶溶液體積)。

NK比活力的計(jì)算方法：比活力(Fu/mg)=總活力/總蛋白。

NK純化倍數(shù)的計(jì)算方法：純化倍數(shù)=離心后的比活力/離心前的比活力。

2 結(jié)果與分析

2.1 尿激酶標(biāo)定的納豆激酶酶活工作曲線

采用已知的不同效價(jià)標(biāo)準(zhǔn)尿激酶溶液，測(cè)定其在人工血栓平板上形成的纖溶圈直徑，纖溶酶可以使乳白色的纖維蛋白原降解為無色透明的片段和小肽，從而形成透明圈?？筛鶕?jù)圖1中纖維蛋白原平板上透明纖溶圈的大小和圖2中標(biāo)準(zhǔn)曲線來表征尿激酶的纖溶活性。由圖2可知，在尿激酶酶活為200～1 000 U/mL的區(qū)間內(nèi)R2=0.996 6，酶活和直徑的平方值有很強(qiáng)的線性相關(guān)性。因此，可以利用此標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)定NK的酶活。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)尿激酶纖溶圈

圖2 尿激酶標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 豆粕含量對(duì)納豆激酶活力的影響

在天然培養(yǎng)基中，豆粕的含量決定了納豆芽孢桿菌生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)條件。在5種豆粕粉濃度下，發(fā)酵36 h后于2 000 g條件下離心10 min，取上清液，利用纖維蛋白原平板法測(cè)定上清液NK產(chǎn)量，結(jié)果見圖3。

圖3 豆粕含量對(duì)NK產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of soybean meal content on NK yield

由圖3可知，豆粕含量為1%時(shí)，NK產(chǎn)量為808 Fu/mL，豆粕含量為3%時(shí)，NK產(chǎn)量為1 009 Fu/mL，豆粕含量大于5%時(shí)，NK產(chǎn)量緩慢降低。可見當(dāng)豆粕含量較低時(shí)，NK產(chǎn)量也低，原因是可供納豆芽孢桿菌生長(zhǎng)發(fā)酵的營(yíng)養(yǎng)不足；當(dāng)豆粕含量升高時(shí)，營(yíng)養(yǎng)充足，NK產(chǎn)量緩慢降低，原因可能是豆粕濃度較大，導(dǎo)致溶氧量較低，不利于納豆桿菌的生長(zhǎng)及發(fā)酵。后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選擇的豆粕含量為3%。

2.3 谷氨酸鈉含量對(duì)納豆激酶活力的影響

研究報(bào)道發(fā)現(xiàn)添加谷氨酸鈉可以提高NK的分泌[32]，本研究對(duì)谷氨酸鈉含量進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果見圖4。

圖4 谷氨酸鈉含量對(duì)NK產(chǎn)量的影響

由圖4可知，谷氨酸鈉的添加可以提升NK的產(chǎn)量，當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基中谷氨酸鈉從0.5%增加到2%時(shí)，NK的產(chǎn)量逐漸上升到1 309 Fu/mL；當(dāng)谷氨酸鈉含量超過2%時(shí)，NK的產(chǎn)量會(huì)降低，所以選擇谷氨酸鈉的最佳含量為2%。

在實(shí)驗(yàn)中我們還發(fā)現(xiàn)，隨著谷氨酸鈉含量的升高，發(fā)酵液會(huì)更黏稠，說明谷氨酸鈉濃度越高，納豆桿菌分泌的γ-pGA就越多，這是因?yàn)楣劝彼徕c是γ-pGA分泌的前體物質(zhì)[33]。由于γ-pGA和NK等電點(diǎn)的巨大差異，在發(fā)酵液中二者會(huì)結(jié)合在一起。NK一旦被γ-pGA結(jié)合，就變成束縛型的NK，使其表觀活性下降，不利于其作用于大豆蛋白供給菌體以充足氮源。此時(shí)γ-pGA就相當(dāng)于NK的“代償陷阱”[34]，致使菌體以代償方式不斷合成NK，最終提高了NK的產(chǎn)量?；谝陨戏治?，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表現(xiàn)為NK的產(chǎn)量與γ-pGA的含量呈正相關(guān)。所以通過添加谷氨酸鈉，可提升NK產(chǎn)量。但當(dāng)谷氨酸鈉添加過量時(shí)，溶液過于黏稠，導(dǎo)致發(fā)酵液溶氧降低，影響了納豆桿菌的好氧生長(zhǎng)，生長(zhǎng)量下降，需要的氮源下降，因而NK產(chǎn)量也隨之降低。

2.4 Mg2+含量對(duì)NK產(chǎn)量的影響

Mg2+在蛋白質(zhì)包括NK的合成中起著非常重要的作用，因而實(shí)驗(yàn)對(duì)發(fā)酵體系中Mg2+的濃度進(jìn)行了優(yōu)化。Mg2+對(duì)NK產(chǎn)量的影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖5。

圖5 MgSO4·7H2O含量對(duì)NK產(chǎn)量的影響

由圖5可知，NK產(chǎn)量隨著MgSO4·7H2O含量的升高出現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)，當(dāng)MgSO4·7H2O含量為0.3%時(shí)，NK產(chǎn)量最高。

2.5 正交法優(yōu)化天然培養(yǎng)基

根據(jù)以上單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，研究通過多因素正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)化天然培養(yǎng)基中甘油、谷氨酸鈉和硫酸鎂的含量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 不同添加物正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析Table 1 Results and analysis of orthogonal experiment of different additives

由表1中R值可知，在目前設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)條件下，谷氨酸鈉對(duì)NK產(chǎn)量的影響最大，因此我們需進(jìn)一步優(yōu)化谷氨酸鈉的濃度。由k值可知，降低谷氨酸鈉濃度更合理。

分析各k值可知，在本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)條件下，最適培養(yǎng)基添加物為甘油0.5%、谷氨酸鈉1%、MgSO4·7H2O 0.5%。在此培養(yǎng)基條件下重復(fù)進(jìn)行NK發(fā)酵和產(chǎn)量測(cè)定，結(jié)果見圖6。

圖6 培養(yǎng)基優(yōu)化前后NK產(chǎn)量對(duì)比Fig.6 Comparison of NK yield before and after the optimization of medium

由圖6可知，當(dāng)培養(yǎng)基的組成為豆粕3%、甘油0.5%、谷氨酸鈉1%、MgSO4·7H2O 0.5%時(shí)，NK產(chǎn)量為1 486.6 Fu/mL，比優(yōu)化前提高了48%。在此培養(yǎng)基條件下重復(fù)進(jìn)行NK發(fā)酵和產(chǎn)量測(cè)定，結(jié)果穩(wěn)定，重復(fù)性良好。

2.6 不同pH下所獲納豆激酶的產(chǎn)量

原始發(fā)酵液(pH為7)和調(diào)節(jié)pH為10后的發(fā)酵液NK的效價(jià)測(cè)定結(jié)果見圖7。

圖7 pH對(duì)NK產(chǎn)量的影響

由圖7可知，pH為7的條件下所獲粗酶液中NK效價(jià)為1 526 Fu/g，調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH為10，即大于NK的等電點(diǎn)時(shí)，所獲NK效價(jià)為2 123 Fu/mL，提高了39%。pH為7的條件下獲得的NK凍干粉效價(jià)為1.88×104Fu/g，調(diào)節(jié)pH為10后，所獲NK凍干粉效價(jià)為2.55×104Fu/g，比堿法解離前提高了41%。

2.7 CTAB沉淀γ-聚谷氨酸

十六烷基三甲基溴化胺(CTAB)在水溶液中以聚陰離子形式存在，CTAB的氮原子可與γ-pGA中的羧基氧原子配對(duì)形成不溶于水的γ-pGA-CTAB絡(luò)合物，反應(yīng)后溶液變渾濁[28]，離心沉淀可去除γ-pGA。優(yōu)化CTAB的濃度，使γ-pGA的沉降量最大，且最大程度地保持NK活性穩(wěn)定。CTAB濃度對(duì)γ-pGA含量的影響見圖8，CTAB濃度對(duì)NK活性的影響見圖9。

圖8 CTAB濃度對(duì)殘留γ-pGA含量的影響Fig.8 Effect of CTAB concentration on residual γ-pGA content

圖9 CTAB濃度對(duì)NK活力的影響Fig.9 Effect of CTAB concentration on NK activity

對(duì)NK活性以及殘留γ-pGA含量進(jìn)行綜合分析，逐漸提高CTAB濃度，上清液中γ-pGA的殘留量變化不大，但是NK的纖溶活性逐步降低。結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果及成本考慮，選擇最佳沉降的CTAB濃度為0.2 mol/L。

2.8 三相法濃縮提取納豆激酶效果

固定叔丁醇 ∶料液(體積比)為1∶1，且保證叔丁醇的高度大于0.5 cm，通過改變?nèi)萜髦睆絹砀淖兿嘟缑婷娣e，可發(fā)現(xiàn)相面積越大，越有利于傳質(zhì)，因而提取率和回收率隨之增大，當(dāng)硫酸銨終飽和度為50%時(shí)，結(jié)果見圖10。

圖10 不同大小接觸面積下的NK純化效果Fig.10 Purification effect of NK under different contact areas

實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，叔丁醇相與水相的相界面越大，NK回收率越高，純化倍數(shù)基本不變。這意味著當(dāng)相界面面積不足時(shí)，夾層中NK分子達(dá)到飽和造成分子擁堆，難以將水相中的NK一次性全部提取到夾層。因此在實(shí)際應(yīng)用中，可以通過增加提取次數(shù)來減少NK的損失。

三相法中，若只進(jìn)行一次提取，水相中的蛋白質(zhì)不能完全分布到中間相，水相中的大部分NK很有可能并不能完全分布到夾層。在首次吸取夾層后，對(duì)剩余水相再次進(jìn)行提取，如此反復(fù)使水相中的NK基本全部被萃取完全。在硫酸銨終飽和度為50%、接觸面積直徑為7.1 cm時(shí)，對(duì)NK進(jìn)行多次提取，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖11。

圖11 不同提取次數(shù)下的NK純化效果Fig.11 Purification effect of NK under different extraction times

實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著提取次數(shù)的增加，NK的活力回收率和純化倍數(shù)逐漸增加，提取3次時(shí)，NK活力回收率為87%，純化倍數(shù)為35.3，提取4次時(shí)，NK活力回收率為91%，純化倍數(shù)為35.7，基本不再增加，說明提取4次可基本把水相中的NK提取到中間沉淀相。因此在利用三相法濃縮純化NK時(shí)，選擇提取4次。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，蛋白的回收率隨著體系中料液與叔丁醇接觸面積的增大而升高，在叔丁醇與料液的體積比為1的條件下，若可保證叔丁醇在上相中的高度不小于0.5 cm，則接觸面積越大越好。在本實(shí)驗(yàn)的體系中，提取4次可基本把水相的NK提取完，若體系不同，還需對(duì)提取次數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，理論上提取次數(shù)越多，NK提取越完全。

利用沉淀劑CTAB對(duì)粗酶液中的γ-pGA進(jìn)行沉降，對(duì)沉降后的上清液采用三相法進(jìn)行濃縮，回收效果好。NK活力回收率為91%，純化倍數(shù)為35.7。

2.9 高純納豆激酶凍干粉的效價(jià)

通過沉淀法及三相夾心法獲得的NK凍干粉，其效價(jià)高達(dá)(7.88±0.76)×105Fu/g，獲得的高純NK凍干粉形態(tài)見圖12。

圖12 高純NK凍干粉形態(tài)Fig.12 Morphology of high-purity NK lyophilized powder

由圖12中A可知，獲得的高純NK凍干粉蓬松細(xì)膩，呈乳白色。由圖12中B可知，高純NK品相好，滿足商品要求。若作為口服制劑，可制備成微膠囊(2.5～7.6 mg裝量)，大大減少消費(fèi)者的口服劑量，還為注射針劑的進(jìn)一步研發(fā)打下良好基礎(chǔ)。

3 結(jié)論與討論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，當(dāng)pH為10時(shí)，NK與γ-pGA均帶負(fù)電，相互排斥，解離結(jié)合，與γ-pGA偶聯(lián)的NK會(huì)游離至上清液中，從而提高了NK效價(jià)或產(chǎn)量。高pH有利于NK從γ-pGA上解離，提高NK回收率?？紤]到過高pH對(duì)NK酶活的影響，后續(xù)純化工藝中采用pH為10的條件。

堿法解離后在2 000 g條件下離心去除大分子的γ-pGA，經(jīng)凍干，檢測(cè)初純NK效價(jià)為2.55×104Fu/g，與現(xiàn)有產(chǎn)品相比，其效價(jià)屬于中等偏上水平，可作為保健品原料，但還是無法滿足微劑量服用的要求。若利用CTAB對(duì)粗酶液中剩余的γ-pGA進(jìn)行沉淀，再對(duì)沉淀后的上清液采用三相法進(jìn)行濃縮純化，可大幅度提高納豆激酶的效價(jià)，獲得的高純NK效價(jià)為(7.88±0.76)×105Fu/g，超過了目前所能了解到的所有產(chǎn)品的純度，使?jié)饪s型微量NK口服制劑的制備成為可能，也為注射針劑的研發(fā)打下良好基礎(chǔ)。