楊文清，李夢茹，李西西，付瑋琦，李佳瑩，趙雪如，李風娟

(天津科技大學 食品科學與工程學院，省部共建食品營養(yǎng)與安全國家重點實驗室，食品營養(yǎng)與安全教育部重點實驗室，天津 300457)

玫瑰在我國山東、云南、甘肅等地均有種植，含有氨基酸、脂類、糖類、多種維生素和礦物質(zhì)，以及酶類、多酚、黃酮等生物活性物質(zhì)[1]。玫瑰花瓣中提取的酚類物質(zhì)有顯著抗自由基能力和抑菌活性，有助于改善心血管疾病，其多糖成分也顯示出抑制促炎癥酶的能力[2]。玫瑰醬是由新鮮玫瑰花瓣與白糖、紅糖等混合發(fā)酵制成的產(chǎn)品，具有獨特風味，可直接食用，也可作為輔料加入到玫瑰酥、曲奇餅干等食品中。

Liu等[3]發(fā)現(xiàn)苦水玫瑰抗氧化應激能力強，能夠調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白，減少活性氧，還有益于抗癌。Xie等[4]發(fā)現(xiàn)，玫瑰水提物和95%醇提物具有血管緊張素轉(zhuǎn)化酶Ⅰ(ACE)抑制活性，也表現(xiàn)出對自發(fā)性高血壓大鼠的降壓效果。Rahimi等[5]發(fā)現(xiàn)，大馬士革玫瑰水提物對血管緊張素Ⅱ誘導的急性高血壓具有治療效果。另外，玫瑰花香氣濃郁，是重要的香水原料。Wu等[6]發(fā)現(xiàn)加鹽與不加鹽的玫瑰精油成分，均含有高含量的醇類，如香茅醇、香葉醇等。Zhao等[7]對3種食用玫瑰產(chǎn)品進行主要香氣成分分析，檢測出苯乙醇、香茅醇、香葉醇和丁香酚等成分。目前對玫瑰醬的研究主要在制作方法、工藝技術(shù)層面，深入的功能特性探討及風味成分分析有限。鑒于此，本文對市售玫瑰醬的抗氧化活性及ACE抑制活性進行了探討，分析了總酚、總黃酮含量，由于玫瑰花的特殊氣味，制成玫瑰醬后風味發(fā)生了顯著改變，因此進一步對香氣成分進行了研究，以期為食用玫瑰產(chǎn)品的開發(fā)提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 實驗材料

3種市售玫瑰醬產(chǎn)品：紅糖玫瑰醬(HT)、滇西小哥玫瑰醬(DXXG)、老塘子玫瑰醬(LTZ)，分別購自大理市阿達暇食品有限公司、云南赤莧商貿(mào)有限公司、云南后稷生物科技有限公司。墨紅玫瑰花：購自云南溪水潺潺種植廠；血管緊張素轉(zhuǎn)化酶Ⅰ、兒茶素、沒食子酸、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、三吡啶基三嗪(TPTZ)：購自美國Sigma-Aldrich公司；Trolox：購自美國MCE公司；2-甲基-3-庚酮：購自上海阿拉丁公司；Folin-Ciocalteu顯色劑：購自北京索萊寶公司。

1.1.2 實驗設備

Model 1680酶標儀 瑞士Tecan公司；Flx-800熒光酶標儀 美國BioTek公司；GCMS-QP 2010氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 日本島津公司；固相微萃取頭 上海安譜科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 玫瑰醬的制備

稱取墨紅玫瑰與白糖各20 g混合，揉搓，封裝于罐內(nèi)，30 ℃發(fā)酵29 d，冷藏4 ℃保存?zhèn)溆?，標記為樣品ZZ。

1.2.2 樣品提取液的制備

稱取5 g樣品于研缽內(nèi)，加5 mL蒸餾水研磨，將混合液在搖床振蕩提取1 h后超聲提取30 min，于3 800 r/min離心20 min，上清液過0.45 μm膜，獲得樣品提取液，濃度標記為100 mg/mL。

1.2.3 DPPH清除能力的測定

測定方法參照Brand-Williams等[8]的方法，取5 μL稀釋至一定濃度的樣液，與250 μL 0.08 mg/mL DPPH溶液混合，暗處反應30 min，測定517 nm處的吸光值，以Trolox為標準對照，結(jié)果表示為Trolox的毫克當量數(shù)(mg TE/g FW)。

1.2.4 ABTS清除能力的測定

測定方法參照Loizzo等[9]的方法，取25 μL稀釋至一定濃度的樣液，加入提前配制的2 mL ABTS溶液，反應30 min，測定732 nm處的吸光值，以Trolox為標準對照，結(jié)果表示為Trolox的毫克當量數(shù)(mg TE/g FW)。

1.2.5 鐵離子還原能力(FRAP)的測定

測定方法參照Loizzo等的方法，取10 μL稀釋至一定濃度的樣液，加入1 mL蒸餾水和1.8 mL TPTZ工作液混勻，37 ℃恒溫10 min，測定593 nm處的吸光值，以Trolox為標準對照，結(jié)果表示為Trolox的毫克當量數(shù)(mg TE/g FW)。

1.2.6 ACE抑制活性的測定

參照李風娟等[10]的測定方法。取15 μL稀釋至一定濃度的提取樣液、30 μL 4.66 mmol/L的HHL溶液，加入30 μL 12.5 mmol/L的ACE酶液，混勻，于37 ℃反應1 h，加入120 μL 6 mol/L的NaOH溶液，再加入30 μL 2%的OPA溶液，室溫靜置20 min，加入30 μL的HCl溶液終止衍生反應。測定熒光強度，激發(fā)波長340 nm，發(fā)射波長455 nm，狹縫寬度5 nm，同時設置空白，計算方法如下：

式中：I1表示加提取樣液和ACE酶液測定的熒光吸收強度；I2表示加提取樣液而不加ACE酶液測定的熒光吸收強度；I3表示加樣液空白和ACE酶液測定的熒光吸收強度；I4表示加樣液空白而不加ACE酶液測定的熒光吸收強度。

1.2.7 總酚和總黃酮含量的測定

參照高一芳等[11]的方法，采用福林-酚顯色方法測定總酚含量。取100 μL稀釋樣液、100 μL Folin-Ciocalteu顯色劑和100 μL 10% Na2CO3溶液，于37 ℃保溫1 h后測定750 nm處的吸光值，以沒食子酸為標準對照，結(jié)果表示為沒食子酸的毫克當量數(shù)(mg GAE/g FW)。

采用硝酸鋁顯色法測定總黃酮含量，取30 μL稀釋樣液和132 μL蒸餾水混勻，加入9 μL 5% NaNO2溶液，反應6 min，再加入9 μL 10% Al2(NO2)3溶液，靜置5 min后加120 μL 4% NaOH溶液，測定510 nm處的吸光值，以兒茶素為標準對照，結(jié)果表示為兒茶素的毫克當量數(shù)(mg CE/g FW)。

1.2.8 揮發(fā)性風味物質(zhì)的測定

采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)測定風味物質(zhì)含量，參考江偉等[12]的實驗方法，采用頂空固相微萃取技術(shù)(HS-SPME)提取玫瑰醬中揮發(fā)性成分。稱取樣品3 g裝入20 mL頂空固相小瓶中，并加入1 μL 2-甲基-3-庚酮內(nèi)標稀釋樣品，在50 ℃平衡10 min，將老化后的萃取頭(50/30 μm DVB/CAR/PDWS)插入距樣品1 cm處，提取30 min后進樣，解吸時間15 min。

進樣口溫度230 ℃；載氣為氦氣，流速1.0 mL/min，流速比20∶1；毛細管色譜柱：SH-RT-WAX(30 m×0.25 nm，0.25 μm)；程序升溫：初溫40 ℃，保持3 min，然后以28 ℃/min升至180 ℃，保持3 min，之后以10 ℃/min升至250 ℃，總運行時間50 min。

電離方式為電子離子(EI)源，離子源溫度200 ℃，傳輸線溫度250 ℃，電離電壓70 eV，掃描范圍30～500 amu。

1.2.9 分析方法

將GC-MS結(jié)果與標準質(zhì)譜庫NIST 11進行對照，結(jié)合質(zhì)譜(MS)和保留指數(shù)(RI)進行定性分析，采用內(nèi)標定量法定量。結(jié)合定量分析結(jié)果與各化合物嗅覺閾值，計算風味物質(zhì)氣味活性值(odor activity value，OAV)。

所有試驗均重復3次，利用SPSS 24、SIMCA軟件進行數(shù)據(jù)分析，Origin、TBtools等軟件進行圖表繪制、圖譜分析等。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗氧化活性分析

抗氧化能力測定結(jié)果見圖1。所試樣品表現(xiàn)出較好的抗氧化活性，其中HT、DXXG、LTZ樣品對DPPH的清除能力均高于對ABTS的清除能力和鐵離子還原能力，ZZ樣品的鐵離子還原能力最高?？傮w抗氧化活性最高的為ZZ樣品，抗氧化活性較低的為DXXG樣品。

圖1 玫瑰醬的抗氧化能力Fig.1 Antioxidant capacity of rose sauce

2.2 ACE抑制活性分析

在30 mg/mL濃度條件下，玫瑰醬樣品對ACE的抑制率見圖2。結(jié)果顯示，DXXG樣品的ACE抑制率最高，達到95.17%，其他3個樣品的ACE抑制率范圍為35.89%～49.29%。González-García等[13]發(fā)現(xiàn)梅子中的多肽對ACE具有較強的抑制活性，DXXG樣品中含有青梅汁，這對于其突出的ACE抑制活性具有一定的貢獻。其他樣品的ACE抑制活性比較接近，其趨勢與抗氧化能力相似，均為ZZ樣品較高。

圖2 玫瑰醬的ACE抑制率Fig.2 ACE inhibition rate of rose sauce

2.3 總酚和總黃酮含量分析

4種玫瑰醬樣品水提物的總酚含量見圖3中a，在0.81～3.86 mg GAE/g FW范圍內(nèi)?？傸S酮含量見圖3中b，在0.17～0.81 mg CE/g FW之間。其中，ZZ樣品的總酚及總黃酮含量最高，這在一定程度上體現(xiàn)了該自制樣品中玫瑰花添加比例較高。Moreira等[14]在研制玫瑰花與蘋果混合果醬時發(fā)現(xiàn)，玫瑰花瓣添加越多，總酚含量越高，抗氧化活性越強。同時，總酚及總黃酮含量也與制作過程相關(guān)，例如發(fā)酵或存放時間會對酚類含量產(chǎn)生影響，另外，清洗浸泡過程會造成酚類物質(zhì)的損失，F(xiàn)ederico等[15]發(fā)現(xiàn)葡萄酒制造時，延長葡萄浸漬時間會使花青素濃度降低，Zielinski等[16]則發(fā)現(xiàn)通過冷凍濃縮工藝，蘋果汁中的酚類化合物含量顯著升高。此外，研究發(fā)現(xiàn)，無論是花卉還是混合果醬，其總酚含量與抗氧化能力相關(guān)性均很強[17]。本研究通過相關(guān)性分析(見表1)，進一步發(fā)現(xiàn)DPPH清除能力與總酚、總黃酮含量呈強正相關(guān)，ABTS清除能力、鐵離子還原能力與總酚、總黃酮含量呈極強正相關(guān)，表明玫瑰醬的抗氧化能力與酚類物質(zhì)相關(guān)。

圖3 玫瑰醬的總酚(a)和總黃酮(b)含量Fig.3 Content of total phenols (a) and total flavonoids (b) of rose sauce

表1 玫瑰醬的抗氧化能力與總酚和總黃酮的相關(guān)性Table 1 Correlation of antioxidant capacity with total phenols and total flavonoids of rose sauce

續(xù) 表

2.4 風味物質(zhì)輪廓分析

通過GC-MS分析，得到4種玫瑰醬樣品以及新鮮玫瑰花(XH)的總離子流色譜圖，見圖4。風味物質(zhì)種類數(shù)量分析見圖5。

圖4 4種玫瑰醬樣品及鮮花的揮發(fā)性成分總離子流色譜圖Fig.4 Total ion current chromatogram of volatile components of the four rose sauce samples and fresh flowers

圖5 玫瑰醬的風味物質(zhì)種類數(shù)量分析Fig.5 Quantitative analysis of flavor substance types of rose sauce

HT樣品共檢出80種風味物質(zhì)，DXXG樣品共檢出67種，LTZ樣品共檢出73種，ZZ樣品共檢出73種。HT樣品中種類數(shù)量最突出的是醇類、酯類；DXXG樣品中酯類物質(zhì)最多；LTZ樣品中醇類最多，種類相對較多的是炔烴類、醛類；ZZ樣品中醇類物質(zhì)最多，其次是烯類。綜合分析，醇類屬于最主要的風味物質(zhì)成分，其次是酯類，烯類、酸類、醚類種類均較少。采用不同的工藝和原料制作出的玫瑰花醬風味差異較大。

對照組XH樣品共檢出46種風味物質(zhì)，檢出種類最少，炔烴類物質(zhì)種類最多，醇類檢出少，沒有檢測到酸類物質(zhì)。因此，發(fā)酵可以在很大程度上改變產(chǎn)品的風味，使得烯類、醇類、醛類物質(zhì)增加，促進芳香類物質(zhì)的釋放，并通過酚酸的降解或酶促反應產(chǎn)生酸類物質(zhì)。

2.5 風味物質(zhì)差異性分析

從醇類風味物質(zhì)及含量分析上看，(R)-(+)-β-香茅醇、香葉醇、苯乙醇、橙花醇等可被視為玫瑰醬的特有醇香物質(zhì)，在各品種中含量均較高。本實驗HT樣品中(R)-(+)-β-香茅醇的含量相對較少，含特有成分2-庚醇、2-壬醇等多種物質(zhì)；DXXG樣品中的(R)-(+)-β-香茅醇、香葉醇、苯乙醇、乙醇、橙花醇含量均較高，并含有特有物質(zhì)α-松油醇；LTZ樣品中乙醇含量相對較低，含特有成分2-乙基-1-己醇、反式-2-己烯-1-醇等；ZZ樣品中(R)-(+)-β-香茅醇的含量最高，其次為橙花醇，并含有多種特有成分，如仲丁醇、(-)-異蒲勒醇等。楊秦等[18]、朱建設[19]在云南不同品種玫瑰中也檢測到較高濃度的橙花醇，應為云南玫瑰特有香氣。

從酯類風味物質(zhì)及含量分析上看，每種產(chǎn)品均含特有芳香成分。HT樣品中苯甲酸乙酯濃度最高，并且是其特有成分，另外還含有棕櫚酸乙酯、橙花乙酸酯等特有成分；DXXG樣品苯乙酸乙酯濃度最高，并含有苯乙酸異丁酯、丁酸葉醇酯等特有成分；LTZ樣品中乙酸香茅酯濃度最高，并含有乙酸芐酯等特有成分，另外，在多篇文獻中均發(fā)現(xiàn)玫瑰花和其飲品含較高含量的乙酸香茅酯[20]；ZZ樣品酯類種類相對較少、濃度較低，但含特有成分乙酸甲酯、己酸甲酯等。

從醛類風味物質(zhì)及含量分析上看，苯甲醛、苯乙醛、檸檬醛可視為玫瑰醬的特征醛類物質(zhì)，在各產(chǎn)品中均存在。ZZ樣品中苯甲醛濃度最高，其次為檸檬醛、苯乙醛，而HT樣品中苯甲醛濃度次高；HT、LTZ樣品中糠醛濃度均最高，且糠醛為其特有成分；DXXG樣品中檸檬醛濃度最高。

酸類、醚類、炔烴類、烯類檢出及相似成分均較少。其中3-甲基-4-氧代戊酸、玫瑰醚可視為玫瑰醬的特征酸類、醚類物質(zhì)，另外，DXXG與LTZ樣品酸類物質(zhì)較多且相似。4種玫瑰醬樣品所含炔烴類物質(zhì)相似性較小，只于各樣品中檢出相同成分十六烷。1-石竹烯、萜品油烯可視為玫瑰醬特有萜烯物質(zhì)。

2.6 風味物質(zhì)主成分分析

篩選出24種在3種樣品中均被檢測到的風味物質(zhì)，進行主成分分析，見圖6。使用PCA-X來可視化樣本之間的關(guān)系，PC1和PC2占總方差的98.2%(分別為83.7%和14.5%)。從整體上看，不同玫瑰醬樣品分散，HT與LTZ樣品聚在一起，相似性較大，DXXG和ZZ樣品與其相似性小。

圖6 玫瑰醬主要風味物質(zhì)主成分分析Fig.6 Principal component analysis of main flavor substances of rose sauce

2.7 風味物質(zhì)特征香氣分析

計算出各風味物質(zhì)的氣味活性值(OAV)，得出OAV≥1的物質(zhì)集合，其均對食品風味有一定貢獻。OAV≥1的風味物質(zhì)中有醇類31種、酯類27種，占比最多。HT樣品中具有氣味活性的風味物質(zhì)有56種，其中苯乙醇、芳樟醇、(R)-(+)-β-香茅醇的OAV均較高，特有物質(zhì)異戊酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、苯甲酸乙酯、苯甲酸甲酯的OAV較高，其產(chǎn)生的蘋果、菠蘿皮、未成熟李子皮、桑葚等強烈水果氣味，濃郁的冬青油和尤南迦油香氣等是形成差異風味的關(guān)鍵；DXXG樣品中具有氣味活性的風味物質(zhì)有42種，其中苯乙酸乙酯的OAV最大，顯著高于其他樣品，且ZZ樣品中沒有檢出，因此苯乙酸乙酯濃烈而甜的蜂蜜香氣是形成此種玫瑰醬風味的關(guān)鍵；LTZ樣品中具有氣味活性的風味物質(zhì)有43種，其中芳樟醇、(R)-(+)-β-香茅醇、葉醇的OAV均較高，特有物質(zhì)有2-(4-甲基-3-環(huán)己烯基)-2-丙醇、二氫-β-紫羅蘭酮等，以上產(chǎn)生的類似丁香花香、木香、果香等香氣是形成差異風味的關(guān)鍵；ZZ樣品中具有氣味活性的風味物質(zhì)有42種，檢出的芳樟醇、(R)-(+)-β-香茅醇、橙花醇、苯乙醛、雙戊烯、檸檬醛的OAV均顯著高于其他樣品，體現(xiàn)為甜玫瑰香、木青氣息、橙花香氣、檸檬果香等，差異性物質(zhì)3-甲基戊酸乙酯的閾值較低，對此樣品的風味貢獻較大，呈現(xiàn)菠蘿和藍莓香氣。

篩選出26種OAV較高的物質(zhì)(在3種玫瑰醬中均有檢出)，得到熱圖，見圖7。其中芳樟醇、(R)-(+)-β-香茅醇的OAV在各產(chǎn)品中均較高，另外，橙花醇、香葉醇、苯乙醛、雙戊烯、1-石竹烯、苯甲醇、檸檬醛、萜品油烯在各樣品中均有檢出，且OAV相對較高，可以稱為玫瑰醬的特征性風味物質(zhì)。Ulusoy等[21]發(fā)現(xiàn)，玫瑰水的主要成分是苯乙醇。雖然在部分樣品中苯乙醇的OAV較高，但在LTZ樣品中未檢測到，即苯乙醇的存在并不普遍。另外，聚類分析發(fā)現(xiàn)HT樣品和DXXG樣品的相似性較大，其次是LTZ樣品，另外，XH和ZZ樣品的相似性較大。因ZZ樣品是由XH樣品發(fā)酵而來，故而其存在較大的相似性。

圖7 玫瑰醬中高氣味活性值(OAV)香氣物質(zhì)熱圖Fig.7 Thermogram of aroma substances with high odor activity value (OAV) in rose sauce

3 結(jié)論

所試玫瑰醬樣品表現(xiàn)出良好的抗氧化活性和ACE抑制活性，且總酚和總黃酮含量對樣品的功能特性起著重要作用。樣品中最主要的風味物質(zhì)是醇類，其次是酯類，其中芳樟醇、(R)-(+)-β-香茅醇、橙花醇、香葉醇、苯乙醛、雙戊烯、1-石竹烯、苯甲醇、檸檬醛、萜品油烯被視為玫瑰醬的關(guān)鍵風味物質(zhì)，且每種樣品有其各自的特異性風味。這為玫瑰醬的深入開發(fā)提供了重要的理論指導，后續(xù)將進一步考察發(fā)酵菌種、原輔材料等加工工藝的改良對產(chǎn)品功能特性及風味的影響，探究玫瑰產(chǎn)品中的關(guān)鍵活性成分及香氣的可能性變化，推動食用玫瑰衍生產(chǎn)品的多樣化開發(fā)及相關(guān)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。