許小艷，孔 寧，甸子芩，楊景暉，田云粉，蘇麗娜，米弘瑛△

(1.云南省第一人民醫(yī)院兒科，昆明 650032；2.云南省昆明市兒童醫(yī)院檢驗科 650034；3.云南省第一人民醫(yī)院檢驗科，昆明 650032)

輪狀病毒(rotavirus，RV)是世界范圍內(nèi)引起兒童非細(xì)菌腹瀉的最主要病原體，也是5歲以下兒童腹瀉死亡的首要原因[1]。新生兒感染RV的臨床表現(xiàn)及基因型有一定的特殊性[2]，但目前RV相關(guān)研究對象大多數(shù)為5歲以下的嬰幼兒，針對新生兒RV感染研究資料較少。本研究對2018-2019年昆明某三級甲等醫(yī)院住院新生兒進(jìn)行糞便RV抗原檢測，收集臨床資料，進(jìn)行RV基因型分析，旨在了解昆明地區(qū)新生兒RV感染的臨床及分子流行病學(xué)特征，為RV感染的防治提供依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年1月至2019年12月在昆明某三級甲等醫(yī)院新生兒病房住院的5 092例新生兒為研究對象。本研究獲醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號：2017YYLH039)。

1.2 方法

1.2.1標(biāo)本及臨床資料收集

所有患兒入院48 h內(nèi)檢測糞便RV抗原，入院48 h后出現(xiàn)腹瀉、嘔吐、腹脹、喂養(yǎng)不耐受等消化道癥狀體征時復(fù)測糞便RV抗原。RV抗原陽性病例收集糞便標(biāo)本經(jīng)離心處理后凍于-80 ℃冰箱，用于RV基因分型。同時收集RV陽性新生兒的臨床資料，包括胎齡、日齡、性別、分娩方式、出生體重、住院日期、住院病房類型、喂養(yǎng)方式、RV檢查時間和臨床表現(xiàn)等。

1.2.2RV抗原檢測

采用艾博生物醫(yī)藥(杭州)有限公司RV抗原檢測試劑盒(乳膠法)檢測糞便標(biāo)本中RV抗原，操作方法嚴(yán)格按說明書進(jìn)行。

1.2.3RV基因分型

1.2.3.1提取病毒RNA

取200 μL 10%的糞便懸液，采用TIANamp Virus RNA Kit提取試劑盒(天根生化科技有限公司)提取病毒RNA，操作方法嚴(yán)格按說明書進(jìn)行。

1.2.3.2逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)檢測

提取病毒RNA的陽性標(biāo)本，以病毒的VP4和VP7核苷酸序列為模板，運用巢式RT-PCR方法(日本TaKaRa公司Prime ScriptTMOne Step RT-PCR Kit)對RV進(jìn)行基因分型。參照文獻(xiàn)[3]設(shè)計VP7和VP4基因特異性引物及反應(yīng)體系。第1輪PCR反應(yīng)條件：50 ℃ 30 min；94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個循環(huán)；72 ℃ 5 min，4 ℃,無限循環(huán)。第2輪PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 290 s；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)；72 ℃ 5 min，4 ℃,無限循環(huán)。

1.2.3.3基因測序與序列分析

標(biāo)本的基因測序由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成，以VP4(P分型)和VP7(G分型)內(nèi)圍擴(kuò)增引物為測序引物，正反向雙向測序。將測序得到的基因序列提交至互聯(lián)網(wǎng)(http://www.ncbi.ulm.nih.gov)，運用 BLAST工具進(jìn)行堿基比對分析，確定G/P 基因型。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料以頻數(shù)或百分率表示，比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 住院新生兒RV感染情況及季節(jié)分布

5 092例住院新生兒中共檢出糞便RV抗原陽性136例，總檢出率為2.67%。社區(qū)感染占總感染人數(shù)的64.71%(88/136)，醫(yī)院感染占35.29%(48/136)。新生兒RV感染全年均可發(fā)生，12月至次年2月為流行高峰季節(jié)，檢出率為3.32%～5.53%；其次為3-5月，檢出率為2.48%～3.10%；9月檢出率最低(1.45%)。社區(qū)感染及院內(nèi)感染高峰期基本一致，但3-5月社區(qū)感染檢出率明顯下降，院內(nèi)感染檢出率仍較高。

2.2 住院新生兒RV感染的臨床表現(xiàn)

136例RV感染的新生兒中，41例(30.15%)為無癥狀感染，95例(69.85%)有腹瀉、嘔吐和發(fā)熱等RV感染相關(guān)臨床癥狀。最常見的臨床癥狀為腹瀉，腹瀉發(fā)生率為60.29%(82/136)，大便多為黃色或黃綠色稀糊便或水樣便，每日4～11次，部分伴輕度脫水、腹脹、吃奶差、精神差及哭鬧等表現(xiàn)，但多為3～7 d 恢復(fù)正常。其次為發(fā)熱，20例(14.71%)出現(xiàn)發(fā)熱，體溫在37.5～39.0 ℃，6例(4.41%)以發(fā)熱為唯一或首發(fā)癥狀。7例(5.15%)有嘔吐表現(xiàn)，還有13例(9.56%)表現(xiàn)為便血、喂養(yǎng)不耐受及新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎(necrotizing enterocolitis，NEC)等其他癥狀，其中NEC 2例。

比較RV感染的早產(chǎn)兒及足月兒臨床癥狀發(fā)現(xiàn)，早產(chǎn)兒無癥狀感染發(fā)生率略高于足月兒，但兩組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。足月兒腹瀉發(fā)生率高于早產(chǎn)兒，而早產(chǎn)兒其他癥狀的發(fā)生率高于足月兒，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 RV感染早產(chǎn)兒與足月兒臨床癥狀比較[n(%)]

2.3 新生兒RV感染基因型特征

2.3.1RV的基因多樣性

本研究共收集2018-2019年RV感染新生兒糞便標(biāo)本101例，擴(kuò)增并測序成功的VP7及VP4基因有89例(88.12%)。G分型中分出3種已知基因型，依次為G9、G2、G8。P分型中分出2種已知基因型P[8]和P[4]，最后確定本研究標(biāo)本中共檢出4種基因型，主要基因型為G9P[8]，其次為G2P[4]、G2P[8] 及G8P[8]，見表2。

表2 昆明地區(qū)新生兒RV基因型分布[n(%)]

2.3.2RV主要基因型在不同分類新生兒中的分布

G9P[8]、G2P[4]基因型RV在不同胎齡、住院病房、日齡、感染方式及有無癥狀的新生兒中分布比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

表3 RV主要基因型在不同分類新生兒中分布[n(%)]

2.3.3RV主要基因型在不同癥狀新生兒中的分布

G9P[8]、G2P[4]基因型RV在腹瀉和無腹瀉、發(fā)熱和無發(fā)熱新生兒中分布比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表4。

表4 RV主要基因型在不同癥狀新生兒中的分布[n(%)]

3 討 論

3.1 昆明地區(qū)住院新生兒RV感染率及季節(jié)性分布

新生兒RV感染主要來源于孕產(chǎn)婦感染、產(chǎn)道感染及醫(yī)院內(nèi)感染，醫(yī)院里可通過醫(yī)護(hù)人員造成RV的傳播。文獻(xiàn)報道NICU的新生兒RV檢出率為25.2%～43.9%，且醫(yī)院內(nèi)感染占較大比例[2,4]。新疆地區(qū)新生兒病房RV感染的總檢出率為14.22%，院內(nèi)感染占60.07%[5]。袁嬌等[6]報道NICU中RV檢出率為5.91%。本研究結(jié)果顯示昆明地區(qū)2018-2019年住院新生兒RV檢出率為2.67%，其中社區(qū)感染占總感染人數(shù)的64.71%，醫(yī)院感染占35.29%，總檢出率及院內(nèi)感染占比均低于上述文獻(xiàn)?？紤]為各地區(qū)氣候環(huán)境不同，RV感染檢測力度及醫(yī)院內(nèi)感染的防治措施也不同，造成RV感染率地區(qū)差異。流行病學(xué)調(diào)查顯示，2005-2018年中國5歲以下兒童RV感染自9月開始上升至次年2月或4月回落，發(fā)病高峰季節(jié)為11月至次年2月[7]。昆明地區(qū)5歲以下兒童RV感染發(fā)病高峰期為每年的1-3月和10-12月[8]。本研究中新生兒RV感染的高峰期為12月至次年2月，與上述報道的5歲以下兒童RV感染流行季節(jié)高峰相符。但3-5月仍維持較高的感染率，9月感染率最低，與嬰幼兒流行季節(jié)特點不完全相同。本研究中新生兒RV醫(yī)院內(nèi)感染與社區(qū)感染的季節(jié)分布基本一致，不同的是3-5月社區(qū)感染率已明顯下降，但醫(yī)院內(nèi)感染率仍高，說明醫(yī)院內(nèi)感染在RV流行高峰期后仍會持續(xù)一段時間，臨床需重視新生兒病房RV醫(yī)院內(nèi)感染的防控。

3.2 新生兒RV感染的臨床表現(xiàn)

新生兒感染RV后可表現(xiàn)為無癥狀或輕型感染，也可表現(xiàn)為典型急性胃腸炎，還可表現(xiàn)為生命體征不穩(wěn)定、喂養(yǎng)困難、NEC等嚴(yán)重癥狀[2,9]。本研究中30.15%的新生兒表現(xiàn)為無癥狀感染，69.85%的患兒有臨床癥狀，最常見的臨床癥狀為腹瀉，發(fā)生率為60.29%，部分伴輕度脫水、腹脹、吃奶差、精神差及哭鬧等表現(xiàn)，但多于3～7 d恢復(fù)正常。其次為發(fā)熱及嘔吐，另有9.56%的患兒以便血、喂養(yǎng)不耐受及NEC等為主要表現(xiàn)。所以臨床應(yīng)給予及時有效的補(bǔ)液治療以緩解腹瀉相關(guān)癥狀，同時應(yīng)注意患兒的其他表現(xiàn)，避免并發(fā)癥發(fā)生。有研究報道，新生兒感染RV后最常見癥狀是發(fā)熱而不是腹瀉或嘔吐[10]。本研究中新生兒RV感染后發(fā)熱的發(fā)生率為14.71%，且有4.41%的患兒以發(fā)熱為首發(fā)或唯一癥狀，說明有必要對發(fā)熱的新生兒進(jìn)行糞便RV檢測。本研究還發(fā)現(xiàn)足月兒感染RV后腹瀉發(fā)生率高于早產(chǎn)兒，與鄭靈玲等[5]研究結(jié)論一致。早產(chǎn)兒喂養(yǎng)不耐受、便血及NEC等其他癥狀的發(fā)生率高于足月兒，但早產(chǎn)兒因胃腸功能不成熟及并發(fā)癥多等原因，即使不感染RV發(fā)生上述癥狀的風(fēng)險也高于足月兒，且本研究為單中心研究，早產(chǎn)兒RV感染例數(shù)較少，不足以說明RV感染與早產(chǎn)兒喂養(yǎng)不耐受及NEC相關(guān)，尚需開展多中心研究，并排除干擾因素后進(jìn)一步分析。

3.3 昆明地區(qū)新生兒RV基因型特征

RV基因型分布存在明顯地區(qū)及時間差異。G9P[8]型于1983年最初在美國發(fā)現(xiàn)，此后的10年關(guān)于G9型RV的報道較為少見，2000年以后G9P[8]型RV開始在世界各地零星暴發(fā)。在中國，G9型病毒最早于1998年在云南發(fā)現(xiàn)，此后該型病毒僅作為少見基因型偶然被報道。直至2011年，G9P[8]型RV快速取代了G1P[8]和G3P[8]型RV成為南京和武漢等地的優(yōu)勢基因型。2009-2015年中國5歲以下腹瀉兒童RV流行監(jiān)測顯示，RV優(yōu)勢株從G3P[8]和G1P[8]迅速演變?yōu)镚9P[8]，其中G9P[8]的比例從2009年的3.4%明顯增加到2015年的60.9%[11]。薈萃分析顯示，2011-2018年中國5歲以下兒童RV最普遍基因型是G9P[8]，占20.9%[12]。說明該型RV已經(jīng)成為中國的優(yōu)勢株。

昆明作為云南省會，是連接省內(nèi)外的經(jīng)濟(jì)和交通樞紐，建立以昆明為中心，輻射全省的RV感染和基因多樣性篩查網(wǎng)具有重要意義。昆明地區(qū)2006年以前嬰幼兒流行的RV以G1和G3P[8]為主。但由于此后近10年未對本地區(qū)流行的RV基因型進(jìn)行監(jiān)測，缺乏該時間段內(nèi)RV的分子流行病學(xué)數(shù)據(jù)。而甸子芩等[8]對本地區(qū)2015-2017年RV流行病學(xué)調(diào)查顯示，G9P[8]型已成為本地區(qū)的優(yōu)勢流行株，其次為G2P[4]型，G1P[8]和G3P[8]型明顯減少。本研究中新生兒最主要流行的基因型為G9P[8]型，占76.41%，與本地區(qū)嬰幼兒優(yōu)勢流行株一致。近年在實施 RV 疫苗接種的國家中觀察到G2P[4]型RV毒株的流行率暫時增加[13-14]。文獻(xiàn)報道，昆明地區(qū)感染該基因型的兒童中年齡在2歲以下的占46.7%[3]。本研究中，G2P[4]型占21.35%，為本地區(qū)新生兒流行次要優(yōu)勢株，說明該基因型已在昆明地區(qū)嬰幼兒及新生兒中流行。遺憾的是，之前的研究均是針對嬰幼兒或年齡更大的兒童，昆明地區(qū)新生兒RV基因型監(jiān)測一直處在空白狀態(tài)，無法確定這兩種基因型在新生兒這一群體中的具體流行時間。

另外，新生兒感染的G9P[8]和G2P[4]兩個主要基因型在不同胎齡、住院病房、日齡、感染方式及有無癥狀的新生兒中分布比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。在腹瀉和無腹瀉，發(fā)熱和無發(fā)熱等不同癥狀的新生兒中分布亦無差異(P>0.05)。表明感染RV的基因型與胎齡、住院病房、日齡、感染方式與感染基因型無相關(guān)性，不同臨床癥狀與感染基因型也無相關(guān)性。但本研究鑒定基因型的RV例數(shù)較少，可擴(kuò)大樣本量或開展多中心研究進(jìn)一步探討RV基因型與臨床特征是否相關(guān)。

G1P[8]是韓國兒童中最常見的基因型，G4P[6]是新生兒中最常見的基因型，但2017-2018在新生兒中首次高頻率檢測到G8P[6]型的RV株[15]。在印度南部，G10P[11]型是新生兒感染RV的主要基因型，而這一基因型在其他年齡兒童中少見[16]。以上研究提示新生兒RV流行基因型與嬰幼兒可能不同，且有少見病毒株在新生兒群體中流行。本研究中新生兒RV流行的主要基因型與本地區(qū)嬰幼兒一致，但分別檢測到1株G2P[8]及1株G8P[8]型，這兩種基因型此前未在本地區(qū)兒童中檢出，表明需動態(tài)監(jiān)測新生兒RV流行基因型變化趨勢，警惕少見基因型在新生兒中流行。

綜上所述，昆明地區(qū)住院新生兒RV感染率較低，流行季節(jié)特征與嬰幼兒不盡相同，醫(yī)院感染在流行高峰期后仍會持續(xù)一段時間，新生兒感染RV后以腹瀉癥狀最常見，足月兒更容易出現(xiàn)腹瀉癥狀，無癥狀感染及發(fā)熱在RV感染的新生兒中占一定比例。需重視無癥狀感染及醫(yī)院內(nèi)感染，并開展發(fā)熱新生兒的RV檢測。新生兒RV主要流行基因型為G9P[8]、其次為G2P[4]，有少見的G8P[8]及G2P[8]檢出，需動態(tài)監(jiān)測本地區(qū)新生兒RV流行基因型變化趨勢，并警惕少見基因型在新生兒中流行。