樂 薇,崔 昂,段鳳琪,劉詩詩,胡 玥

(武漢工商學(xué)院 環(huán)境與生物工程學(xué)院,武漢 430065)

蘆丁又稱為蕓香苷,是一種黃酮類化合物,廣泛存在于植物中,具有抗炎癥、抗病毒、抗輻射、抗自由基、保持及恢復(fù)毛細(xì)血管正常彈性等功效,是很多中草藥的有效成分之一[1]。目前,蘆丁含量的測定方法有化學(xué)發(fā)光法[2]、高效液相色譜法[3]、毛細(xì)管電泳法[4]和電化學(xué)法[5]等,這些方法具有靈敏度高和選擇性好的優(yōu)點(diǎn),但大多存在成本高,檢測過程復(fù)雜,對操作人員有一定專業(yè)技能要求等缺點(diǎn),不適合現(xiàn)場快速測定。

微流控紙基分析芯片(簡稱紙芯片)是以紙或和紙相似的薄層纖維材料作為芯片基質(zhì),通過噴蠟打印、絲網(wǎng)印刷等技術(shù)在紙基上建立試劑流動及檢測區(qū)域,具有成本低、易于操作、攜帶方便、檢測迅速等優(yōu)點(diǎn),是快速測定裝置的發(fā)展趨勢[6-8]。分子印跡技術(shù)是指為獲得在空間結(jié)構(gòu)和結(jié)合位點(diǎn)上與某一分子(模板分子)完全匹配的聚合物的試驗(yàn)制備技術(shù)[9]。該技術(shù)以目標(biāo)分子為模板,通過氫鍵等作用,使其與功能單體形成復(fù)合物[5],在交聯(lián)劑的作用下引發(fā)聚合,在交聯(lián)聚合物網(wǎng)絡(luò)中,產(chǎn)生預(yù)定的特異性識別位點(diǎn),這些位點(diǎn)在形態(tài)、尺寸上與目標(biāo)分子相匹配,具有較好的選擇性和特異性[10-12]?；被ㄊ翘J丁的主要來源,通常以蘆丁含量作為槐花質(zhì)量控制的標(biāo)準(zhǔn)[13]。鑒于此,本工作基于數(shù)碼成像法,結(jié)合分子印跡技術(shù)和紙芯片,制備出對蘆丁有高選擇性的分子印跡紙芯片,為槐花中蘆丁的快速檢測分析提供方法參考。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

KQ-50E型超聲波清洗器;JYO2S型紫外分析儀;9 SE型智能手機(jī);HP LaserJet 1020plus型激光打印機(jī)。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液:0.200 0 g·L-1,稱取10 mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品,用沸水溶解、冷卻后定容至50 mL,配制成質(zhì)量濃度為0.200 0 g·L-1的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液系列:移取0,0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0,4.0,5.0 mL 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液,用水稀釋至10 mL,配制成質(zhì)量濃度分別為0,0.010 0,0.020 0,0.030 0,0.040 0,0.050 0,0.060 0,0.080 0,0.100 0 g·L-1的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液系列。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的純度不小于98%;偶氮二異丁腈、丙烯酰胺、乙二醇二甲基丙烯酸酯、乙醇、甲醇、乙酸、氯化鋁、氫氧化鈉、氨水均為分析純;試驗(yàn)用水為蒸餾水。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 蘆丁分子印跡紙芯片的制備

由繪圖軟件Auto CAD 設(shè)計(jì)直徑為6 mm 的圓形陣列式微流控圖案,用激光打印機(jī)將其打印在A4大小的濾紙上,置于170 ℃烘箱中加熱固化1.5 h[14],墨粉中的無色聚合物可形成疏水墻,從而獲得白色的親水區(qū)和黑色的疏水區(qū),如圖1所示。

圖1 親水、疏水區(qū)的制備Fig.1 Preparation of the hydrophilic and hydrophobic areas

稱取0.030 2 g(0.05 mmol)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品,加入5 mL 20%(體積分?jǐn)?shù))甲醇溶液,超聲溶解10 min;然后加入0.106 6 g(1.5 mmol)丙烯酰胺,超聲30 min;再加入0.991 1 g(5 mmol)乙二醇二甲基丙烯酸酯和0.01 g偶氮二異丁腈,超聲聚合45 min,充分混勻后得到預(yù)聚液[15]。在親水區(qū)中滴加14μL預(yù)聚液,置于60 ℃烘箱中干燥2 min,取出,接著將其浸泡于水中,振蕩3 min,再浸泡于0.01 mol·L-1氫氧化鈉溶液中,洗去模板分子,直至洗脫液在365 nm 處無紫外吸收。最后用水將濾紙洗至中性,干燥備用,得到蘆丁分子印跡紙芯片,圓形親水區(qū)即為蘆丁的檢測區(qū)。按照相同的方法,不加蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品,制備非分子印跡紙芯片。

1.2.2 槐花中蘆丁含量的測定

稱取2.00 g槐花,壓碎,加入10 mL 4 g·L-1沸騰的硼砂溶液,在攪拌下以飽和氫氧化鈣溶液調(diào)節(jié)pH 至8～9,加熱微沸30 min,過濾,重復(fù)提取一次,合并濾液,加水定容至25 mL。分取1.0 mL,加水定容至100 mL,得到蘆丁待測液。在蘆丁分子印跡紙芯片檢測區(qū)中滴加5μL蘆丁待測液(或蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液系列)和5μL 10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鋁溶液,室溫下反應(yīng)40 min。然后將紙芯片水平放置于紫外分析儀的暗箱中,于365 nm 波長下用手機(jī)進(jìn)行拍照,獲得熒光圖片,每次拍攝均采用2倍焦距拍照模式。用Adobe Photoshop軟件對圖片進(jìn)行處理,讀取檢測區(qū)R(紅)、G(綠)、B(藍(lán))值,以R、G、B 值之和計(jì)算蘆丁的質(zhì)量濃度,并按照公式(1)計(jì)算槐花中蘆丁的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(w)。

式中:ρ為蘆丁的質(zhì)量濃度,g·L-1;V為蘆丁待測液的體積,0.1 L;n為稀釋倍數(shù),100;m為槐花的質(zhì)量,2.00 g。

2 結(jié)果與討論

2.1 方法可行性研究

分別在蘆丁分子印跡紙芯片和非分子印跡紙芯片的檢測區(qū)依次滴加5μL 0,0.100 0,0.200 0 g·L-1蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。結(jié)果表明:紙芯片上顯色斑點(diǎn)的熒光顏色為綠色,并且隨著蘆丁質(zhì)量濃度的增加,顏色逐漸變亮;而非分子印跡紙芯片上顯色斑點(diǎn)的熒光顏色為暗藍(lán)色,且?guī)缀鯚o變化。據(jù)此,可提出分子印跡紙芯片檢測蘆丁含量的方法。推測其檢測原理為蘆丁能被紙芯片上的印跡孔穴特異性吸附,吸附的蘆丁與氧化鋁反應(yīng),生成熒光顯色物質(zhì)。

2.2 蘆丁分子印跡紙芯片制備條件的優(yōu)化

2.2.1 預(yù)聚液滴加量

分別在檢測區(qū)滴加5,8,10,14,16,18μL 預(yù)聚液,于60 ℃烘干2 min。結(jié)果發(fā)現(xiàn):預(yù)聚液滴加量太多時(shí)會導(dǎo)致印跡膜太厚,易脫落;預(yù)聚液滴加量太少時(shí)則無法完全覆蓋檢測區(qū);預(yù)聚液滴加量為14μL時(shí)剛好完全覆蓋檢測區(qū)且不溢出。因此,試驗(yàn)選擇的預(yù)聚液滴加量為14μL。

2.2.2 超聲聚合時(shí)間

試驗(yàn)考察了超聲聚合時(shí)間分別為10,15,20,25,30,35,40,45,60,90 min時(shí)蘆丁顯色斑點(diǎn)R、G、B值的變化情況,平行測定3次,分別計(jì)算R、G、B值的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差(s)。

結(jié)果表明:當(dāng)超聲聚合時(shí)間在10～40 min時(shí),顯色斑點(diǎn)R、G、B值的s分別為2.0～4.1,1.6～2.4,2.6～4.5,出現(xiàn)明顯波動;超聲聚合45 min后,R、G、B值的s分別為1.6～2.0,0.8～1.6,1.6～2.1,結(jié)果穩(wěn)定性變好。這是由于超聲聚合時(shí)間較短,印跡聚合物聚合不充分,重現(xiàn)性不好。因此,試驗(yàn)選擇的超聲聚合時(shí)間為45 min。

2.2.3 洗脫劑

試驗(yàn)考察了分別以水、60%(體積分?jǐn)?shù),下同)乙醇溶液、體積比為9∶1 的甲醇-乙酸混合溶液、0.01 mol·L-1氫氧化鈉溶液為洗脫劑時(shí)對模板分子的洗脫效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn):在365 nm 紫外燈下,水洗脫后的紙芯片上可觀察到明顯的顯色斑點(diǎn);60%乙醇溶液洗脫后,紙芯片上殘留少量顯色斑點(diǎn);體積比為9∶1的甲醇-乙酸混合溶液和0.01 mol·L-1氫氧化鈉溶液洗脫后,紙芯片上未觀察到顯色斑點(diǎn)。這與蘆丁在洗脫劑中的溶解度有關(guān),溶解度越大,洗脫效果越好。蘆丁易溶于甲醇和氫氧化鈉溶液,因此這兩種洗脫劑的洗脫效果較好。考慮到甲醇為有毒試劑,而且乙酸濃度較高,后續(xù)紙芯片洗至中性所需水量較大,而0.01 mol·L-1氫氧化鈉溶液洗脫后,紙芯片洗至中性所需水量少;并且試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)隨著氫氧化鈉濃度的增大,蘆丁越容易被洗脫,但濃度不能過高,否則會腐蝕濾紙。綜上分析,試驗(yàn)選擇的洗脫劑為0.01 mol·L-1氫氧化鈉溶液。

2.3 顯色條件的優(yōu)化

2.3.1 點(diǎn)樣體積

分別在制備好的蘆丁分子印跡紙芯片上滴加0,2,4,5,6,8,10μL 的0.100 0 g·L-1蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液,考察了顯色斑點(diǎn)R、G、B 值的變化情況,平行測定3次,分別計(jì)算R、G、B值的平均值和s。

結(jié)果表明,當(dāng)點(diǎn)樣體積為4～6μL 時(shí),R、G、B值的s均不大于2.0,變化小,結(jié)果重現(xiàn)性好。這是由于點(diǎn)樣體積過少時(shí),溶液未完全浸沒檢測區(qū),而當(dāng)點(diǎn)樣體積過大時(shí),會造成邊界的顯色物質(zhì)濃度水平增大,說明點(diǎn)樣體積過小或過大都會造成斑點(diǎn)顯色不均勻,重現(xiàn)性差。綜合考慮,試驗(yàn)選擇的點(diǎn)樣體積為5μL。

2.3.2 反應(yīng)時(shí)間

試驗(yàn)考察了反應(yīng)時(shí)間分別為8,10,15,20,25,30,40,60,120 min時(shí)顯色斑點(diǎn)R、G、B值的變化情況,平行測定3次,分別計(jì)算R、G、B 值的平均值和s,結(jié)果見圖2。

圖2 反應(yīng)時(shí)間對顯色斑點(diǎn)R、G、B值的影響Fig.2 Effect of the reaction time on R,G and B values of the chromogenic spot

由圖2可知:當(dāng)反應(yīng)時(shí)間在8～30 min時(shí),R、G、B 值波動較大;反應(yīng)40 min后,顯色斑點(diǎn)的R、G、B值趨于穩(wěn)定,并且反應(yīng)120 min時(shí)仍較穩(wěn)定,說明該熒光體系穩(wěn)定性較好。因此,試驗(yàn)選擇的顯色反應(yīng)時(shí)間為40 min。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

按照試驗(yàn)方法,在蘆丁分子印跡紙芯片檢測區(qū)滴 加0,0.010 0,0.020 0,0.030 0,0.040 0,0.050 0 g·L-1蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液,拍照,獲得R、G、B值。以0 g·L-1蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液為空白,以蘆丁質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),不同數(shù)學(xué)模型(其中ΔR＝R-R空白,ΔG＝G-G空白,ΔB＝B-B空白)為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。對于相關(guān)系數(shù)大于0.995 0 的標(biāo)準(zhǔn)曲線,以11次空白測定值的3倍s與線性回歸方程斜率(k)的比值計(jì)算檢出限(3s/k),結(jié)果如表1所示。

表1 不同數(shù)學(xué)模型下的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限Tab.1 Linear regression equations,correlation coefficients and detection limits under different mathematical models

通過比較各標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)和檢出限,發(fā)現(xiàn)數(shù)學(xué)模型R＋G＋B 和R＋G 的相關(guān)系數(shù)均大于0.998 0,說明這兩個(gè)模型的回歸方程線性較好,并且R＋G＋B模型所得檢出限遠(yuǎn)低于R＋G 的,說明前者的靈敏度更高。因此,試驗(yàn)選擇以R、G、B 值之和為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。繼續(xù)梯度增加蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度,發(fā)現(xiàn)當(dāng)蘆丁質(zhì)量濃度為0.010 0～0.200 0 g·L-1時(shí),R、G、B 值之和與蘆丁質(zhì)量濃度依舊呈線性關(guān)系,線性回歸方程為y＝1 100x＋489.2,檢出限為0.007 9 g·L-1。

2.5 回收試驗(yàn)

按照試驗(yàn)方法對蘆丁待測液進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn),結(jié)果如表2所示。

表2 回收試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Results of test for recovery

由表2可知,蘆丁的回收率為82.6%～105%。

2.6 樣品分析

按照試驗(yàn)方法對某產(chǎn)地不同批次的槐花樣品平行測定5次,計(jì)算測定值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),結(jié)果如表3所示。

表3 樣品分析結(jié)果(n＝5)Tab.3 Analytical results of the samples(n＝5)

本工作將分子印跡技術(shù)與紙芯片結(jié)合,基于智能手機(jī)數(shù)碼成像的功能,提出了分子印跡紙芯片快速測定槐花中蘆丁含量的方法。在優(yōu)化的試驗(yàn)條件下,蘆丁的質(zhì)量濃度在0.010 0～0.200 0 g·L-1內(nèi)與其熒光顯色圖片的R、G、B 值之和呈線性關(guān)系。該方法所需試劑量少、成本低廉、簡便快速,能滿足現(xiàn)場快速分析的需求。

致謝:感謝湖北省優(yōu)勢特色學(xué)科群“資源環(huán)境與智能化工程”項(xiàng)目對本工作的資助。