彭麗娟 ,何聲寶 ,劉宇晨 ,袁 源 ,盧 釩 ,李 苓 ,王春瓊,張 威*

(1.云南省煙草質(zhì)量監(jiān)督檢測(cè)站,昆明 650106;2.國家煙草質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心,鄭州 450001;3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所,青島 266000;4.武漢大學(xué),武漢 430072)

煙草中的水溶性還原糖以葡萄糖和果糖為主,還有少量的蔗糖和麥芽糖。在卷煙燃燒過程中,水溶性還原糖可以與堿性燃燒物質(zhì)發(fā)生中和反應(yīng),進(jìn)而協(xié)調(diào)煙氣的酸堿平衡,減少氣味刺激性。當(dāng)燃燒溫度超過300 ℃時(shí),這些糖類物質(zhì)熱解生成的呋喃衍生物、酮類以及醛類等羰基化合物與卷煙中的氨基化合物發(fā)生美拉德反應(yīng),產(chǎn)生烤煙特有的香氣,進(jìn)而改善抽吸口感[1]。目前,我國煙草行業(yè)測(cè)定煙葉中水溶性還原糖和總糖的方法主要有芒森·沃克法[2]和連續(xù)流動(dòng)分析法[3],但是這兩種方法都無法測(cè)定單糖組分的含量。文獻(xiàn)[4]研究了煙草成分中的葡萄糖對(duì)煙氣的影響,結(jié)果表明葡萄糖是良好的香味成分載體,其酯化和苷化反應(yīng)能夠豐富卷煙香氣,提高煙氣的圓潤性;文獻(xiàn)[5]研究了煙葉中果糖含量對(duì)評(píng)吸質(zhì)量的影響,結(jié)果表明果糖含量增加有利于提高煙葉的綿延性和甜度,減少雜氣。顯然,不同種類的糖在卷煙燃燒過程中具有不同的吃味影響。因此,準(zhǔn)確測(cè)定煙草及其制品中的水溶性還原糖,尤其是含量較多的葡萄糖和果糖,具有很重要的意義。

目前,報(bào)道過的單糖檢測(cè)方法主要有近紅外光譜法(NIR)[6]和離子色譜-脈沖安培檢測(cè)法(ICPAD)[7-10]。NIR 利用不同單糖的羥基基團(tuán)在近紅外波段的吸收譜圖的細(xì)微變化來實(shí)現(xiàn)定性和定量分析,具有快捷、無損、無污染、前處理簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn),但是樣品中的水分會(huì)產(chǎn)生干擾,且儀器設(shè)備成本較高,需要較多的樣品數(shù)據(jù)庫建立預(yù)測(cè)模型。IC-PAD 基于糖類物質(zhì)在堿性條件下具有陰離子化的特性,聯(lián)用脈沖安培檢測(cè)器檢測(cè)被分離的羥基在電極表面發(fā)生氧化還原反應(yīng)所產(chǎn)生的電流來確定單糖含量,具有靈敏度高、分析快速、干擾較小等優(yōu)點(diǎn),但儀器設(shè)備成本較高。此外,還有高效液相色譜法[11-15]和衍生化-氣相色譜法[16]等也被用于單糖含量的測(cè)定。然而,這些方法都存在前處理步驟復(fù)雜、靈敏度低、檢測(cè)成本高等缺點(diǎn)。因此,開發(fā)簡(jiǎn)單、快速的單糖分析方法仍然是本行業(yè)所需解決的關(guān)鍵問題。

基于酶聯(lián)免疫法檢測(cè)葡萄糖在醫(yī)療領(lǐng)域已得到廣泛應(yīng)用[17],其檢測(cè)原理是利用葡萄糖氧化酶特異性氧化葡萄糖產(chǎn)生H2O2,然后利用類過氧化物酶催化H2O2氧化顯色底物產(chǎn)生可見的顏色,通過檢測(cè)顏色信號(hào)變化從而對(duì)葡萄糖進(jìn)行定量。該方法具有靈敏度高、專一性強(qiáng)、效率快等優(yōu)點(diǎn),但是該方法需要專門的檢測(cè)儀器,操作不便。近年來,隨著智能手機(jī)的普及和圖像處理技術(shù)的發(fā)展,用智能手機(jī)和圖像轉(zhuǎn)化軟件進(jìn)行定量的灰度法逐漸受到各領(lǐng)域研究者的關(guān)注[18-20]。該方法簡(jiǎn)單、快捷、精確度高且不需要專門的儀器輔助,逐漸被用于替代基于顯色法的光度分析技術(shù)?；诿复俜磻?yīng)處理后,顯色液的顏色深淺會(huì)隨著產(chǎn)物含量的不同發(fā)生變化,結(jié)合灰度法,可以實(shí)現(xiàn)煙草及其制品中葡萄糖含量的簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確的測(cè)定。

因此,本工作首先利用葡萄糖氧化酶和過氧化氫酶將葡萄糖轉(zhuǎn)化為醌類化合物,經(jīng)過37℃水浴顯色后,將含有不同濃度葡萄糖的顯色液通過Image軟件轉(zhuǎn)化為灰度值,以水為參比,建立灰度值比值和葡萄糖濃度的對(duì)數(shù)之間的線性關(guān)系,并通過優(yōu)化樣品萃取劑和反應(yīng)時(shí)間,實(shí)現(xiàn)煙草及其制品中葡萄糖含量的快速分析,以期為煙草行業(yè)檢測(cè)葡萄糖含量提供一種有效、便捷的分析方法。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

HP4896型紫外可見分光光度計(jì);Waters e2695型高效液相色譜儀;5810R 型離心機(jī)。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液:50.0 mmol·L-1,稱取9.008 gD-(＋)-葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品,用水溶解,并定容至1 L,得到50.0 mmol·L-1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液系列:移取適量的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液于10 mL 容量瓶中,用水定容,配制成濃度 為0.100,0.500,1.000,1.500,2.000,2.500,3.000,3.500,4.000 mmol·L-1的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液系列。

葡萄糖氧化酶-過氧化物酶試劑盒:R1 為1.06 g·L-1苯酚;R2為含0.102 g·L-14-氨基安替比林、1 k U·L-1過氧化物酶和36 k U·L-1葡萄糖氧化酶的混合溶液(pH 7.0)。

D-(＋)-葡萄糖、甘露糖、木糖、一水合鼠李糖、果糖、阿拉伯糖、半乳糖標(biāo)準(zhǔn)品的純度均不小于99%,葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)品的純度不小于98%,一水合半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)品的純度不小于97%;試驗(yàn)用水為純水。

樣品A、B、C、D 為2017年云南省煙草質(zhì)量監(jiān)督檢測(cè)站制備的全國煙草系統(tǒng)中連續(xù)流動(dòng)分析測(cè)試用標(biāo)準(zhǔn)烤煙樣品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

移取100μL 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液系列于裝有R1和R2試劑各450μL的2 mL 微量離心管中,混勻后置于(37±0.5)℃的恒溫水浴搖床中反應(yīng)5 min,得到顯色液。利用智能手機(jī)對(duì)顯色液拍照,然后用Image軟件將彩色圖片轉(zhuǎn)化為灰度模式,得到灰度值。以水為參比,對(duì)顯色液灰度值進(jìn)行歸一化處理,得到灰度值比值。以葡萄糖濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo),灰度值比值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2 樣品前處理

參考YC/T 31-1996《煙草及煙草制品 試樣的制備和水分測(cè)定 烘箱法》,將樣品置于烘箱中,于(40±1)℃干燥24 h。取出,用粉碎機(jī)研磨,再依次用孔徑為0.425 mm(40目)和0.250 mm(60目)的篩網(wǎng)篩分,將中間截留顆粒物置于密封袋中,常溫下平衡48 h 后測(cè)定其中水分的含量。稱取(0.1±0.000 1)g上述樣品于50 mL 具塞三角瓶中,加入20 mL水后蓋上塞子,在(30±0.5)℃的恒溫水浴振蕩器上以200 r·min-1轉(zhuǎn)速振蕩萃取30 min。萃取結(jié)束后,用快速定性濾紙過濾,棄去初始濾液,收集后續(xù)的2～3 mL濾液備用。

1.2.3 樣品測(cè)定

取100μL濾液,按照1.2.1節(jié)方法處理,將灰度值比值代入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線中,得到葡萄糖濃度,按照公式(1)計(jì)算待測(cè)樣品中葡萄糖的含量。

式中:w為待測(cè)樣品中葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù),%;K為換算系數(shù),0.180 16 g·mmol-1;c為葡萄糖濃度,mmol·L-1;V為萃取劑體積,L;m為待測(cè)樣品質(zhì)量,g;W為待測(cè)樣品中水分質(zhì)量分?jǐn)?shù),%。

以兩次平行測(cè)定的平均值作為最終的測(cè)定結(jié)果,兩次平行測(cè)定結(jié)果絕對(duì)值之差不應(yīng)超過5.0%。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和測(cè)定下限

按照1.2.1節(jié)試驗(yàn)方法對(duì)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液系列進(jìn)行分析。結(jié)果顯示,標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍為0.100～4.000 mmol·L-1,線性回歸方程為y＝0.446 5x＋0.547 1,相關(guān)系數(shù)為0.995 5。

按照試驗(yàn)方法對(duì)0.100 mmol·L-1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液重復(fù)測(cè)定10次,分別以3倍和10倍標(biāo)準(zhǔn)偏差(s)計(jì)算檢出限(3s)和測(cè)定下限(10s),結(jié)果得檢出限 為 0.021 6 mmol· L-1,測(cè)定下限為0.072 mmol·L-1。

2.2 萃取劑的選擇

一般來說,可直接用水將固體樣品中的水溶性還原糖提取出來。煙草分析中,也有采用5%(體積分?jǐn)?shù),下同)乙酸溶液浸提[3]。按照1.2.2節(jié)試驗(yàn)方法,分別用水和5%乙酸溶液對(duì)樣品A、B、C 進(jìn)行萃取。取100μL濾液于2 mL微量離心管中,分別加入R1和R2試劑各450μL,混勻后于37 ℃水浴中反應(yīng)5 min。反應(yīng)結(jié)束后,將顯色液轉(zhuǎn)移至1 cm 光程的比色皿中,以水為參比,測(cè)定其在波長505 nm處的吸光度。結(jié)果顯示,樣品A、B、C經(jīng)水萃取后的吸光度(3次測(cè)定平均值)均大于5%乙酸溶液的,表明用水即可將葡萄糖較好地萃取出來。因此,試驗(yàn)選擇以水為萃取劑。

2.3 反應(yīng)時(shí)間的選擇

試驗(yàn)采用過氧化氫酶催化H2O2氧化顯色底物來進(jìn)行顯色反應(yīng)。一般來說,過氧化氫酶的最佳使用溫度為37℃,超過或者低于此溫度都會(huì)影響酶的活性和催化速率,因此試驗(yàn)選擇反應(yīng)溫度為37 ℃。在此條件下,考察了反應(yīng)時(shí)間分別為2,5,10,15,20 min時(shí)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系,結(jié)果見圖1。

圖1 不同反應(yīng)時(shí)間下葡萄糖濃度對(duì)數(shù)與灰度值比值的關(guān)系曲線Fig.1 Relationship curves between logarithms of glucose concentration and ratios of gray value at different reaction times

結(jié)果顯示:在不同反應(yīng)時(shí)間下,顯色液的灰度值比值與葡萄糖濃度呈明顯的對(duì)數(shù)關(guān)系;當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為2,5,10,15,20 min時(shí),相關(guān)系數(shù)依次為0.971 5,0995 5,0.988 9,0.985 0,0.985 5,其中反應(yīng)時(shí)間為5 min時(shí)的相關(guān)系數(shù)較高。因此,試驗(yàn)選擇的反應(yīng)時(shí)間為5 min。

2.4 專一性試驗(yàn)

按照1.2.1節(jié)試驗(yàn)方法對(duì)2.000 mmol·L-1葡萄糖和與葡萄糖結(jié)構(gòu)類似的甘露糖、木糖、一水合鼠李糖、果糖、阿拉伯糖、半乳糖、一水合半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示,葡萄糖、甘露糖、木糖、一水合鼠李糖、果糖、阿拉伯糖、半乳糖、一水合半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸顯色液的灰度值比值依次 為0.444,1.052,1.020,1.025,0.994,0.985,1.019,1.016,1.012,除葡萄糖外,其余糖類顯色液的灰度值與空白溶液無明顯差別,并且通過裸眼比色觀察可以看到,葡萄糖顯色液顯示出明顯的紅色,而其余糖類顯色液均無紅色,說明該方法專一性好。這是由于葡萄糖氧化酶在有氧條件下專一性地催化β-D-葡萄糖生成葡萄糖酸和H2O2,而對(duì)其他糖類沒有影響。

2.5 精密度和回收試驗(yàn)

按照試驗(yàn)方法對(duì)樣品A、B、C 分別連續(xù)檢測(cè)6次,計(jì)算測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。結(jié)果顯示,樣品A、B、C 測(cè)定值 的RSD 依次為2.2%,0.84%,3.2%,表明該方法精密度較好。

按照試驗(yàn)方法對(duì)樣品D 進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn),每個(gè)濃度水平測(cè)定3次,計(jì)算回收率,結(jié)果見表1。

表1 回收試驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Results of test for recovery

結(jié)果顯示,葡萄糖的回收率為98.3%～103%,在95.0%～105%范圍內(nèi),說明該方法準(zhǔn)確度較高。

2.6 方法對(duì)比

按照本方法和常規(guī)的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)衍生-高效液相色譜法[21]對(duì)7個(gè)煙草樣品中的葡萄糖含量進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果見表2,并通過F檢驗(yàn)和t檢驗(yàn)計(jì)算95%置信度下兩種方法的P值。

表2 方法比對(duì)結(jié)果Tab.2 Comparison results of the methods

結(jié)果表明:本方法和高效液相色譜法測(cè)定結(jié)果基本一致;F檢驗(yàn)時(shí)的P值為0.46,t檢驗(yàn)時(shí)的P值為0.94,均大于0.05,說明在95%置信度下,兩種方法測(cè)定結(jié)果無顯著性差異。

本工作基于酶促反應(yīng)和灰度分析技術(shù),建立了一種通過顏色差異(灰度值)來測(cè)定煙草及其制品中葡萄糖含量的方法。結(jié)果表明,該方法不僅操作簡(jiǎn)便快速、分析效率高,而且精密度、準(zhǔn)確度和專一性良好,滿足行業(yè)對(duì)煙草和煙草制品中葡萄糖進(jìn)行大批量、快速、準(zhǔn)確檢測(cè)的需要,具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。