薛志遠(yuǎn)，岳宇嬌，黃琴，徐源，周雪，向桃，程明，徐平

作者單位1.成都市金牛區(qū)人民醫(yī)院 成都 610032

2.遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 貴州遵義 563099

阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征（obstructive sleep apnea syndrome，OSAS）是一種以全部或局部上呼吸道阻塞為特征的睡眠呼吸障礙性疾病[1]。缺氧后復(fù)氧是OSAS最主要的病理生理過程，OSAS可導(dǎo)致認(rèn)知功能衰退，表現(xiàn)為學(xué)習(xí)記憶力差、警惕性下降等[2]。有影像學(xué)報道，OSAS患者大腦左側(cè)海馬內(nèi)側(cè)皮質(zhì)、左后頂葉皮質(zhì)、右側(cè)額上回的灰質(zhì)體積減少，這些腦區(qū)域結(jié)構(gòu)變化誘發(fā)腦功能變化，最終導(dǎo)致認(rèn)知受損[3]。轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）/Smad 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與神經(jīng)發(fā)育及損傷修復(fù)，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中高度活躍，如腦腫瘤、腦積水等，損害神經(jīng)元，使疾病惡化[4,5]。我們提出科學(xué)假想，TGF-β1/Smad3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是否參與OSAS大鼠認(rèn)知功能障礙？對認(rèn)知功能到底起保護(hù)作用還是損害作用？基于以上思考，本實(shí)驗(yàn)擬經(jīng)慢性間斷性缺氧（chronic intermittent hypoxia，CIH），建造OSAS 大鼠模型，并采用TGF-β1抑制劑選擇Disitertid（別名P144）進(jìn)行阻斷通路，從行為學(xué)、病理學(xué)等角度出發(fā)，探索TGF-β1/Smad3 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑與認(rèn)知功能之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 成年健康雄性SD 大鼠42 只，SPF級，體質(zhì)量170～200 g，購于長沙市天勤生物技術(shù)有限公司[許可證號：SCXK（湘）2014-0011]。

1.1.2 主要試劑TGF-β1 抗體、Smad3 抗體、pSmad3 抗體、GAPDH抗體購于Abcom公司；尼氏染色試劑盒購于北京雷根生物技術(shù)有限公司；兔抗二抗購于萬類生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及處理 SD 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后隨機(jī)分為7組：正常對照組（N組）、CIH 1W組、CIH 2W組、CIH 3W 組、CIH 4W 組、CIH 4W+ P144 組、CIH 4W+DMSO組，每組6只。在借鑒Fletcher、Li等[6]建模方法的基礎(chǔ)上，改進(jìn)CIH 并建造OSAS 大鼠模型。將各CIH 各組大鼠置于動物低氧倉內(nèi)，氧氣濃度（8.0±0.5）%，維持90 s 后將大鼠從低氧艙內(nèi)取出復(fù)氧，90 s后再次放入低氧艙中，重復(fù)循環(huán)，8 h/d，持續(xù)4周，記錄大鼠尾動脈血氧飽和度。其中CIH 4W+P144 組、CIH 4W+DMSO 組大鼠于建模前30 min 分別腹腔內(nèi)注射P144（70μg/kg）或DMSO（1 mL/kg），隔日1次。第5周行水迷宮實(shí)驗(yàn)，檢測大鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力。水迷宮實(shí)驗(yàn)后灌注處死大鼠，取出海馬組織。

1.2.2 Morris 水迷宮行為學(xué)測試 適應(yīng)性訓(xùn)練1 d 避免大鼠應(yīng)激。隱蔽平臺實(shí)驗(yàn)5 d，統(tǒng)計(jì)120 s 內(nèi)大鼠找到水池內(nèi)隱蔽平臺的時間；找不到平臺的大鼠，將其引領(lǐng)至平臺停留10 s，找尋平臺時間記做120 s?？臻g探索實(shí)驗(yàn)：第7天拆除水池內(nèi)平臺，統(tǒng)計(jì)120 s內(nèi)每只大鼠穿過平臺位置的次數(shù)。

1.2.3 尼氏染色法 取大鼠海馬組織后切片（5 μm）、脫蠟（二甲苯溶液及梯度酒精各3 min）、清洗、染色（暗房，亞甲藍(lán)約30μL，56 ℃恒溫箱60 min）、清洗、分化（暗房，滴加Nissl Differentiation約30μL）、清洗、脫水、干燥、中性樹脂封片、光學(xué)顯微鏡下采圖。

1.2.4 蛋白免疫印跡法 取大鼠海馬組織后蛋白提取、定性及變性、電泳、電轉(zhuǎn)、封閉及一、二抗孵育、曝光、圖像結(jié)果分析，其中一抗?jié)舛萒GF-β1 1∶100、Smad3 1∶100、pSmad3 1∶500，二抗IGg濃度1∶5000。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 18.0 軟件處理數(shù)據(jù)。符合正態(tài)分布以及方差齊性的計(jì)量資料以（±s）表示，采用配對t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析鼠尾動脈血氧飽和度值，重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析水迷宮數(shù)據(jù)計(jì)，單因素方差分析蛋白表達(dá)水平；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 OSAS大鼠模型的評定

CIH 各時間點(diǎn)組、CIH 4W+P144 組、CIH 4W+DMSO組大鼠在低氧處理期間均有煩躁、白天嗜睡、憋醒等癥狀，缺氧期間大鼠尾動脈血壓飽和度為（67.61±7.03）%，自然空氣環(huán)境復(fù)氧期間（95.44±2.71）%，缺氧相與復(fù)氧相間相比大鼠平均血氧飽和度下降＞4%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），建模成功。

2.2 大鼠學(xué)習(xí)和記憶能力改變

水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)中，各組大鼠逃避潛伏期見表1；N組、CIH 1W組、CIH 2W組、CIH 3W組、CIH 4W組、CIH 4W+DMSO組及CIH 4W+P144組空間探索時穿越平臺次數(shù)分別為（4.10±0.85）次、（3.65±0.98）次、（2.70±1.08）次、（2.15±0.74）次、（1.00±0.72）次、（1.05±0.82）次及（3.05±0.68）次。分析顯示，與N 組相比，CIH 1W 組大鼠的逃避潛伏期及穿越平臺次數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而2W、3W、4W 時間點(diǎn)組大鼠逃避潛伏期延長，穿越平臺次數(shù)減少（均P＜0.05）；與CIH 4W+DMSO 組相比，CIH 4W+P144 組大鼠逃避潛伏期縮短，穿越平臺次數(shù)增加（均P＜0.05）。

表1 各組大鼠逃避潛伏期比較（s,±s）

表1 各組大鼠逃避潛伏期比較（s,±s）

注：與N組比較，①P＜0.05；與CIH 4W+DMSO組比較，②P＜0.05

組別N組CIH 1W組CIH 2W組CIH 3W組CIH 4W組CIH 4W+DMSO組CIH 4W+P144組只數(shù)6666666第1天56.48±11.30 57.93±8.82 74.71±9.68①90.24±7.57①105.87±4.81①107.93±6.36 56.78±5.79②第2天40.79±3.26 36.37±5.47 50.61±8.24①61.14±7.07①81.40±4.14①79.55±4.23 39.71±6.66②第3天33.40±5.20 33.89±2.92 43.04±7.79①47.48±4.14①69.07±3.93①68.12±3.24 35.30±2.94②第4天13.61±2.23 13.99±2.72 25.25±3.29①35.56±3.42①57.54±4.71①54.72±3.84 24.52±2.87②第5天5.99±1.83 6.93±2.18 14.94±3.82①24.08±2.57①48.67±3.91①46.86±5.06 16.11±2.23②

2.3 尼氏染色光鏡觀察結(jié)果

尼氏染色光鏡觀察結(jié)果顯示，N 組大鼠海馬CA1和CA3區(qū)尼氏小體數(shù)量多，結(jié)構(gòu)完好，胞漿顏色深，胞核居中；CIH 4W 組及CIH 4W+DMSO 組部分細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞、尼氏小體數(shù)量減少溶解、胞漿著色淺、細(xì)胞由多極形變?yōu)閳A形、尼氏小體消失；CIH 4W+P144 組尼氏小體數(shù)量多，細(xì)胞漿著色較深，且結(jié)構(gòu)較完整，細(xì)胞受損程度相對輕，見圖1、圖2。

圖1 大鼠海馬組織CA1區(qū)尼氏染色圖（40×，標(biāo)尺=1 mm）

圖2 大鼠海馬組織CA3區(qū)尼氏染色圖（40×，標(biāo)尺=1 mm）

2.4 TGF-β1、tSmad3、pSmad3蛋白的表達(dá)變化

各組大鼠海馬組織中均檢測到TGF-β1、Smad3及pSmad3 蛋白的表達(dá)，與N 組比較，TGF-β1、pSmad3 在CIH 1W、2W、3W、4W 時間點(diǎn)的蛋白表達(dá)量遞增（均P＜0.05）；而Smad3 無明顯變化（P＞0.05）；與CIH 4W+DMSO組比較，CIH 4W+P144組TGF-β1、pSmad3蛋白表達(dá)量表達(dá)下降（均P＜0.05），而Smad3無明顯變化（P＞0.05），見表2、圖3。

圖3 大鼠海馬區(qū)TGF-β1、tSmad3、pSmad3蛋白表水平（免疫印跡法）

表2 各組大鼠海馬TGF-β1、tSmad3、pSmad3蛋白IOD值比較（±s）

表2 各組大鼠海馬TGF-β1、tSmad3、pSmad3蛋白IOD值比較（±s）

注：與N組比較，①P＜0.05；與CIH 4W+DMSO組比較，②P＜0.05

組別N組CIH 1W組CIH 2W組CIH 3W組CIH 4W組CIH 4W+DMSO組CIH 4W+P144組只數(shù)666666 6 TGF-β1 1.00±0.00 1.43±0.51①1.60±0.11①2.15±0.12①2.31±0.51①2.32±0.35 tSmad3 1.00±0.00 0.98±0.15 1.01±0.15 0.98±0.00 1.03±0.00 0.98±0.00 pSmad3 1.00±0.00 1.36±0.20①1.53±0.23①1.65±0.20①2.12±0.23①2.09±0.55 1.81±0.15②1.02±0.11 0.75±0.51②

3 討論

3.1 OSAS損害大鼠認(rèn)知功能

OSAS 常由夜間睡眠期間反復(fù)氣道塌陷所引起，睡眠期間歇性缺氧是其最主要的病理生理特征，導(dǎo)致大腦區(qū)域中參與學(xué)習(xí)和記憶的細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞，并降低海馬CA1、CA3區(qū)神經(jīng)元興奮性及海馬長時程增強(qiáng)，影響學(xué)習(xí)、記憶能力等[7]。關(guān)于OSAS動物模型構(gòu)建尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，國外OSAS 模型需滿足以下3 個條件之一：同質(zhì)性（發(fā)病因素與人體相同）、同形性（臨床癥狀與人體相似）、可預(yù)測（對治療反應(yīng)似與人體相似），而大多數(shù)OSAS模型只能部分同形；本研究采用的模型，是在睡眠期間發(fā)生阻塞性呼吸暫停，伴SpO2下降至90%以下，伴上氣道解剖結(jié)構(gòu)異常，是最接近人類OSAS的動物模型[8]。本次造模將各組大鼠置于艙內(nèi)反復(fù)進(jìn)行缺氧后再復(fù)氧，建模過程中各組大鼠煩躁、嗜睡等癥狀均表現(xiàn)于缺氧期間，鼠尾動脈血氧飽和度波動在（67.61±7.03）%，與OSAS 患者臨床癥狀相似，符合OSAS 模型標(biāo)準(zhǔn)。與人類相似，OSAS 大鼠白天嗜睡可能與低氧血癥相關(guān)[9]。最接近OSAS 的試驗(yàn)?zāi)Ｐ褪菍Υ笫筮M(jìn)行氣道阻塞并使用多導(dǎo)睡眠檢測儀器進(jìn)行呼吸暫停指數(shù)、微覺醒指數(shù)等檢測，課題組既往曾使用透明質(zhì)酸鈉凝膠阻塞大鼠氣道，雖能較好地阻塞氣道，但大鼠死亡率高，故課題組參考國內(nèi)外造模方法進(jìn)行改造，該問題也是實(shí)驗(yàn)不足之處。

與身體其他部位相比，大腦需要更多的能量和氧氣消耗，并且對缺氧更加敏感[10]，在慢性CIH 條件下，OSAS 大鼠海馬CA1 和CA3 區(qū)細(xì)胞水腫、部分尼氏小體溶解，海馬神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞漸進(jìn)性地?fù)p害認(rèn)知功能。水迷宮實(shí)驗(yàn)顯示，CIH 1W 大鼠學(xué)習(xí)、空間聯(lián)想能力強(qiáng)，這可能因?yàn)镃IH早期，大鼠海馬功能處于代償階段，認(rèn)知障礙發(fā)生的超早期。隨CIH時間延長，海馬功能結(jié)構(gòu)及功能損害加重，由代償期過度到失代償期，損害學(xué)習(xí)、空間聯(lián)想能力。已有研究發(fā)現(xiàn)CIH 誘發(fā)神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)的證據(jù)：在CIH狀態(tài)下，機(jī)體釋放IL6、IL8、TNF-α等[11]多種炎癥因子進(jìn)入血液，中斷內(nèi)皮細(xì)胞之間的緊密銜接，使炎癥因子更容易穿過血腦屏障進(jìn)入大腦，加速促炎細(xì)胞因子的趨化及釋放，活化的小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞放大炎癥反應(yīng)。在長期慢性炎癥狀態(tài)下，小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的突觸吞噬作用增強(qiáng)，Tau過度磷酸化，β-淀粉樣蛋白集聚，觸發(fā)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡及壞死[12-15]。這一系列的調(diào)控可能發(fā)生在OSAS 大鼠大腦內(nèi)，造成大鼠海馬細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞，學(xué)習(xí)記憶及空間聯(lián)想能力受損，最終導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙。

3.2 OSAS認(rèn)知障礙大鼠激活TGF-β1/Smad3信號通路

TGF-β家族包含許多在胚胎發(fā)育和成體組織穩(wěn)態(tài)期間具有不同功能的細(xì)胞因子，參與細(xì)胞增殖、分化及死亡，TGF-β1 是TGF-β家族中的最重要成員之一。SMAD 家族是目前已知的唯一TGF-β受體底物和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)媒介，是TGF-β家族發(fā)揮多種生物學(xué)效應(yīng)的核心[16]。據(jù)報道，TGF-β1/Smad 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與神經(jīng)系統(tǒng)多種難治性疾病，如：亨廷頓舞蹈癥、肌萎縮性側(cè)索硬化癥等[17,18]。本實(shí)驗(yàn)中，隨缺氧時間延長，TGF-β1、pSmad3 蛋白表達(dá)含量逐漸上調(diào)，OSAS 認(rèn)知障礙大鼠大腦內(nèi)TGF-β1/Smad3信號通路處于開放狀態(tài)，且伴有Smad3質(zhì)核穿梭。TGF-β家族受體屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶家族，其中Ⅱ型受體通過磷酸化Ⅰ型受體的GS區(qū)而激活Ⅰ型受體的激酶活性，TGF-β1/Smad3信號通路能夠調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞影響絲氨酸激酶活性[19]。同樣，下游Smad 蛋白的活性及蛋白穩(wěn)定性受到多種激酶的調(diào)控，R-Smad的linker區(qū)富含絲氨酸與蘇氨酸，其中很多位點(diǎn)都是脯氨酸導(dǎo)向激酶的靶點(diǎn)，Smad3 在核孔蛋白和輸入蛋白介導(dǎo)下結(jié)合輸入蛋白β被轉(zhuǎn)運(yùn)至核內(nèi)，承載生物學(xué)信息，調(diào)節(jié)受體的活性[20,21]。本實(shí)驗(yàn)中OSAS大鼠體內(nèi)炎癥反應(yīng)存在局部或全身，小膠質(zhì)細(xì)胞作為免疫反應(yīng)的第一道防線，成熟及分化受TGF-β1 調(diào)控，活化狀態(tài)下的小膠質(zhì)細(xì)胞可能會通過影響絲氨酸激酶活性促使TGF-β1/Smad3 信號通路異常開放，使TGF-β1蛋白表達(dá)上調(diào)，損害認(rèn)知功能，小膠質(zhì)細(xì)胞可能是缺氧、神經(jīng)炎癥、TGF-β1/Smad3 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑異常激活的重要媒介[22,23]。

3.3 抑制TGF-β1可改善OSAS大鼠認(rèn)知功能障礙

P144 是TGF-β1 受體特異性抑制劑，能顯著降低TGF-β1 與其受體的結(jié)合率[24]。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用P144 干預(yù)后，OSAS組大鼠海馬CA1、CA3區(qū)細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞減輕，尼氏小體數(shù)量相對較多，水迷宮行為學(xué)表現(xiàn)為空間學(xué)習(xí)能力及記憶能力改善，且免疫印跡檢測可見TGF-β1、pSmad3 蛋白表達(dá)水平下調(diào)。說明抑制TGF-β1 后TGF-β1/Smad3 信號通路活化受抑制，OSAS 大鼠的學(xué)習(xí)及記憶能力一定程度上得到改善。國外有類似的研究報道，在阿爾茨海默病和血管性認(rèn)知障礙中，TGF-β1可通過與血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）1型受體（AT1R）信號傳導(dǎo)途徑的相互作用發(fā)揮損害作用[25]；在亨廷頓舞蹈病中，海馬區(qū)TGF-β1 水平升高會損害神經(jīng)祖細(xì)胞增殖，導(dǎo)致海馬功能障礙，最終導(dǎo)致學(xué)習(xí)及記憶能力下降[17]。當(dāng)然，也有研究報道，TGF-β1 通過調(diào)節(jié)突觸重塑誘導(dǎo)海馬長時程增強(qiáng)而改善認(rèn)知功能[26,27]。TGF-β1可能是導(dǎo)致認(rèn)知障礙的原因之一，但具體機(jī)制仍需更多的科學(xué)研究。

然而，本實(shí)驗(yàn)亦有不足之處。首先，模型建造沒有在夜晚進(jìn)行，無法模擬人類的睡眠，沒有使用TGF-β1/Smad3 信號通路特異性激動劑，無法研究該信號通路激活后大鼠認(rèn)知功能及目的蛋白變化情況。其次，水迷宮實(shí)驗(yàn)中沒有對各組大鼠進(jìn)行視力障礙及運(yùn)動障礙的排查。最后，沒有行小膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)炎癥因子的相關(guān)檢測。在下一步實(shí)驗(yàn)中，將課題組將完善本實(shí)驗(yàn)的不足，深究TGF-β1/Smad3信號通路導(dǎo)致OSAS大鼠認(rèn)知障礙的機(jī)制。