何敖煒 宋旭光 孫慶

前列腺癌日漸成為危害中國男性健康的致命殺手,在臨床上,幾乎所有晚期前列腺癌患者均發(fā)展為轉(zhuǎn)移性去勢抵抗性前列腺癌[1]并產(chǎn)生化療耐藥性,難以治療且嚴(yán)重影響患者生存質(zhì)量。因此,尋求一種安全有效的藥物治療前列腺癌至關(guān)迫切。

中醫(yī)古籍并無針對前列腺癌的記載,但根據(jù)其臨床表現(xiàn),可歸于“癥瘕”“癃閉”“血尿”等疾病?，F(xiàn)代各派醫(yī)家對于前列腺癌有不同的看法,歸結(jié)起來主要病位在腎、脾、肺,病機傳變以虛實夾雜,本虛標(biāo)實為主。彭培初教授認(rèn)為本病應(yīng)當(dāng)從腎論治,老年男性正氣不足,發(fā)病于腎,傳變至肺脾,外感六淫、濕熱、疫毒、痰瘀互結(jié),或嗜食辛辣厚味,導(dǎo)致陰陽失調(diào),臟腑不用,氣血經(jīng)絡(luò)失其所養(yǎng)而發(fā)病[2]。因此在治療上,早期術(shù)后和放療后正氣虧虛,腎陰耗損,選用六味地黃湯滋補腎陰;中期激素依賴階段真陰耗損,傷及肺陰,虛火自生,基于“金水相生,虛則補其母”自擬“南北方”養(yǎng)陰清熱潤肺,軟堅解毒散結(jié);后期激素抵抗階段,陰損及陽,脾腎陽虛,氣血不足,經(jīng)脈虛寒,自擬“泉安方”溫腎補陽。徐福松教授認(rèn)為前列腺癌病因應(yīng)責(zé)之于正氣虧虛,情志內(nèi)傷,以及外感六淫病邪,痰濕瘀血等病理產(chǎn)物凝聚于下焦而發(fā)病,治療主張“脾腎同治,平衡陰陽”“條達肝木,調(diào)和氣血”“宣肺滋腎,通調(diào)水道”[3]。張亞強教授認(rèn)為前列腺癌病因病機主要是本虛標(biāo)實,虛實夾雜,而且病位深在,本虛主要在于“脾腎兩虛,陰陽失調(diào)”,標(biāo)實主要是“濕、痰、瘀、熱、毒”,并將前列腺癌分為濕熱下注、痰熱互結(jié)、氣滯血瘀、痰瘀毒結(jié)、脾腎陽虛、氣血虧虛、氣陰兩虛、陰陽失調(diào)等八個證型辨證論治[4]。賈英杰教授針對惡性腫瘤創(chuàng)立“黜濁培本”理論,認(rèn)為前列腺癌病機多為“正氣內(nèi)虛,毒瘀并存”,前列腺癌多為腎虛為主,癌邪首先損傷腎之正氣,滋生余濁,進而延及脾土乃至其他臟器,癌病全程都伴隨著脾胃虧虛,脾胃為后天之本,因此治療上把“解毒祛瘀,扶正抗癌”作為治則,補后天以養(yǎng)先天,自擬“健脾利濕化瘀方”健脾化濕[5]。

中藥白花蛇舌草是茜草科耳草屬的干燥全草,最早載于《廣西中藥志》,主要功效清熱利濕,解毒消癰,“主治癰腫瘡毒……胃癌、食管癌、直腸癌等癌腫”;《湖北中草藥志》“清熱解毒,抗癌消腫。用于癌腫等” ;《四川中藥志》“治胃癌、食管癌、直腸癌,白花蛇舌草75 g”?，F(xiàn)代研究已證明,白花蛇舌草具有治療前列腺癌的作用,其主要抗癌活性物質(zhì)為環(huán)烯醚萜類化合物、黃酮類化合物、蒽醌類化合物等化合物[6]。

1 影響腫瘤細胞增殖和凋亡

1.1 阻滯細胞分裂周期

馮懿賡等[7]發(fā)現(xiàn)白花蛇舌草提取物處理過的人前列腺癌細胞(DU-145)細胞增殖被顯著抑制,細胞凋亡率也隨著藥液濃度的提高而升高,定量PCR檢測環(huán)氧化酶(cyclooxygenase-2,COX-2)mRNA和PCNA mRNA的表達也隨藥液濃度的升高而下調(diào),免疫印記檢測相關(guān)蛋白發(fā)現(xiàn)CyclinD 1蛋白表達下調(diào),并且下調(diào)的程度與藥物劑量的變化而成正比。祁雷磊等[8]將DU-145細胞置于含白花蛇舌草的成方前列消癥湯的不同濃度藥液中,采用流式細胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)前列消癥湯可以通過抑制前列腺癌DU-145細胞從S期向G2期轉(zhuǎn)變而達到抑制腫瘤細胞分裂周期的作用。Su Su Thae Hnit等[9]人探究白花蛇舌草(H)—半枝蓮(S)藥對影響前列腺癌細胞的機制,首先使用SYBR Green比色法發(fā)現(xiàn)HS能夠減少LNCaP和PC-3細胞的克隆,這些細胞周期分析結(jié)果可能表明細胞被阻滯在G2/M期,因此進一步利用有絲分裂標(biāo)志物SER10和碘化丙啶進行DNA染色和免疫印跡方法以及諾考達唑捕捉有絲分裂細胞的方法,結(jié)果表明HS確實能夠?qū)⑶傲邢侔┘毎铚贕2/M期;為探究HS阻滯前列腺癌細胞周期的具體機理,設(shè)計電離輻射對比的實驗排除了HS對DNA的損傷,檢測細胞周期轉(zhuǎn)錄的相關(guān)調(diào)控因子發(fā)現(xiàn)被HS處理過的細胞調(diào)控因子的水平下調(diào),RT-PCR實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)HS并未降低相關(guān)mRNA的穩(wěn)定性,染色質(zhì)免疫沉淀實驗發(fā)現(xiàn)HS能夠降低表觀遺傳修飾程度,這是HS使前列腺癌細胞阻滯于G2/M期的機制;進一步的前列腺癌荷瘤小鼠模型研究也發(fā)現(xiàn)HS能夠減輕腫瘤的重量。

齊墩果酸是白花蛇舌草內(nèi)含的具有抗腫瘤作用的萜類化合物[10], Gyeong-Ji Kim等[11]將DU-145細胞放入不同濃度的齊墩果酸中處理24小時,隨后評估細胞增殖和凋亡狀況,發(fā)現(xiàn)齊墩果酸能夠抑制DU-145細胞的增殖并促進其凋亡,進一步使用免疫印跡法檢測其凋亡蛋白,用流式細胞儀分析細胞周期,發(fā)現(xiàn)齊墩果酸通過上調(diào)促凋亡蛋白p53、細胞色素c、Bax、Caspase-3和PARP-1的表達來發(fā)揮抑制DU-145細胞生長的作用;并上調(diào)p-ERK和p21/W AF-1蛋白表達,下調(diào)Cyclin B1蛋白水平使DU-145細胞周期阻滯在G2期,進而抑制癌細胞分裂周期。此外還建立DU-145荷瘤小鼠模型,獲得了與體外細胞實驗一致的結(jié)果。

1.2 調(diào)節(jié)相關(guān)靶基因

劉明[12]分析發(fā)現(xiàn),前列消癥湯干預(yù)前列腺癌的核心靶點主要包括調(diào)節(jié)雌激素硫酸轉(zhuǎn)移酶抗原(estrogen sulfotranferase,SULT1E1)、毒蕈堿型膽堿受體M3重組蛋白(recombinant cholinergic receptor,muscarinic 3,CHRM3)和己糖激酶(hexokinase2,HK2)等、SULT1E1與雄激素合成和代謝、類固醇受體和核受體的激活以及甾類激素合成通路有關(guān),CHRM3與前列腺癌組織血液循環(huán)和血管收縮有關(guān),HK2與前列腺癌糖酵解/糖質(zhì)新生信號通路有關(guān)。進而設(shè)計實驗觀察到前列消癥湯干預(yù)的人前列腺癌細胞(human prostate cancer cell,PC-3)細胞增殖受到明顯抑制,凋亡率顯著高于對照組,反轉(zhuǎn)錄·聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)實驗發(fā)現(xiàn)實驗組的靶基因SULT1E1 mRNA擴增率上升,而CHRM3和HK2 mRNA擴增率下降,免疫印跡實驗發(fā)現(xiàn)實驗組的SULT1E1蛋白表達上調(diào),而CHRM3和HK2蛋白表達下調(diào),因此分析認(rèn)為前列消癥湯通過干預(yù)SULT1E1、CHRM3和HK2等靶基因,影響腫瘤組織的血供、代謝以及相關(guān)激素,達到抑制癌細胞增殖和促進凋亡的作用。

1.3 調(diào)控PI3K/Akt/mTOR信號通路

槲皮素是白花蛇舌草內(nèi)含的黃酮類化合物[13],研究表明,槲皮素對于前列腺癌細胞有很強的促細胞凋亡、抑制腫瘤細胞轉(zhuǎn)移以及抵抗化療耐藥性的功能[14]。宋靜等[15]將不同濃度的槲皮素作用于PC-3細胞后發(fā)現(xiàn),經(jīng)過CCK-8(Cell Counting Kit-8)實驗檢測的PC-3細胞的活力隨著槲皮素濃度的增高而降低,TUNEL染色顯示槲皮素誘導(dǎo)PC-3細胞凋亡,使用吖啶橙染色發(fā)現(xiàn)槲皮素處理過的PC-3細胞自噬小泡水平增高,GFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染分析表明自噬小體水平也增加,在免疫印跡法檢測自噬相關(guān)蛋白和PI3K/Akt/mTOR信號通路蛋白之后發(fā)現(xiàn)實驗組的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值明顯高于對照組,實驗組的p-PI3K、磷酸化蛋白激酶(p-Akt)和哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)明顯低于對照組,這表明抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路可能是槲皮素誘導(dǎo)PC-3細胞自噬的機制。

2 抑制腫瘤細胞侵襲及遷移

2.1 調(diào)控JAK2/STAT3信號通路

相關(guān)研究表明,腫瘤細胞侵襲、遷移的能力與上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)密切相關(guān)[16-17]。EMT過程的主要影響是降低腫瘤細胞極性和上皮細胞表型,并使其轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂懈咔忠u和遷移功能的間質(zhì)細胞表型[18]。秦瑞等[19]將從白花蛇舌草中提取的總黃酮作用于PC-3細胞,通過Transwell實驗、細胞劃痕實驗發(fā)現(xiàn)白花蛇舌草總黃酮能夠降低PC-3細胞的侵襲和遷移能力,并通過免疫印跡實驗檢測相關(guān)EMT標(biāo)志蛋白結(jié)果顯示實驗組E-cadherin蛋白表達增加而Vimentin蛋白減少,檢測NADPH氧化酶4(NOX4)蛋白及JAK2/STAT3信號通路發(fā)現(xiàn)實驗組能夠降低其表達,因此認(rèn)為白花蛇舌草總黃酮能夠抑制前列腺癌細胞的遷移,其機制主要是通過抑制NOX4的表達以下調(diào)JAK2/STAT3信號通路進而抑制EMT的發(fā)生。

2.2 調(diào)控VEGF/PI3K/Akt信號通路

肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄子1(metastasis-associated lung adenocarcinoma tran 1,MALAT1)是一種與包括前列腺癌在內(nèi)的各種癌癥有關(guān)的IncRNA[20],通過下調(diào)MALAT1可以促進前列腺癌細胞凋亡,抑制前列腺癌細胞的增殖、侵襲和遷移。Lu等[21]在MALAT1與槲皮素治療前列腺癌的研究中發(fā)現(xiàn),被槲皮素處理過的PC-3細胞MALAT1確實有劑量和時間依賴性的下調(diào);于是通過靶向MALAT1、CCK-8以及細胞克隆形成實驗檢測PC-3細胞的增殖情況發(fā)現(xiàn)MALAT1組的細胞增殖率顯著高于槲皮素組;transwell實驗和細胞劃痕實驗檢測細胞侵襲、遷移能力發(fā)現(xiàn),高MALAT1組的細胞較槲皮素組侵襲能力恢復(fù)、細胞劃痕傷口近乎閉合;使用TUNEL染色和免疫印跡實驗檢測細胞凋亡情況發(fā)現(xiàn)高MALAT1組的細胞凋亡較槲皮素組細胞凋亡明顯減少,進一步檢測促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2發(fā)現(xiàn)被槲皮素處理的高MALAT1組的細胞Bax/Bcl-2與對照組相差無幾,以上結(jié)果說明MALAT1是槲皮素抑制前列腺癌細胞增殖、侵襲和遷移以及促進細胞凋亡的重要靶點,在接下來的小鼠模型中也得到了相同的結(jié)果,進一步檢測PI3K/Akt信號通路及EMT相關(guān)蛋白發(fā)現(xiàn),較槲皮素組而言,MALAT1組的Akt磷酸化顯著升高,E-cadherin表達減少,N-cadherin表達上調(diào),這意味著槲皮素可能通過抑制MALAT1的表達而抑制PI3K/Akt信號通路及EMT。

二甲雙胍與槲皮素都具有從不同的途徑抑制前列腺腫瘤的能力[22-24],于是Shuben Sun等[25]通過聯(lián)合二甲雙胍與槲皮素作用于PC-3和LNCaP細胞,發(fā)現(xiàn)聯(lián)用二甲雙胍和槲皮素比單一用藥的組別抑制細胞增殖效果更加顯著,而且兩者是協(xié)同效應(yīng)而非拮抗或相加效應(yīng),transwell實驗和細胞劃痕實驗發(fā)現(xiàn)對細胞的侵襲和遷移能力也幾乎完全抑制,二者聯(lián)合也能獲得更高的前列腺癌細胞凋亡率,使用免疫印跡檢測相關(guān)血管內(nèi)皮生長因子發(fā)現(xiàn)p-Akt、p-PI3K、VEGFR2和VEGF蛋白的表達都受到了顯著抑制,荷瘤小鼠模型也得到了相同的結(jié)果,這表明二甲雙胍聯(lián)合槲皮素可能協(xié)同起到抑制腫瘤血管生成,進而發(fā)揮抑制前列腺癌侵襲和遷移的作用。

3 逆轉(zhuǎn)化療耐藥及提高化療藥物療效

3.1 調(diào)控雄激素受體和PI3K/Akt信號通路

多西他賽是目前前列腺癌的一線化療藥物,但大多數(shù)患者在長期應(yīng)用后會出現(xiàn)耐藥性。Lu等[26]通過逐步增加多西他賽的濃度而建立的對多西他賽耐藥的LNCaP/R和PC-3/R細胞株模型,使用多西他賽聯(lián)合槲皮素干預(yù)治療,發(fā)現(xiàn)聯(lián)合治療之后,耐藥細胞株的遷移和侵襲能力都大大下降,且Bax表達上調(diào)、Bcl2表達下調(diào),還抑制了Akt的磷酸化和PI3K的表達,P-糖蛋白水平也顯著下降,干細胞標(biāo)記物EpCAM、間充質(zhì)細胞標(biāo)記物Twist2表達下調(diào),上皮細胞標(biāo)記物E-cadherin表達上調(diào),AR和PSA表達顯著降低,p-Akt的表達也明顯下降,這提示槲皮素主要是通過干預(yù)雄激素受體通路、逆轉(zhuǎn)EMT和干細胞表型以及降低P-糖蛋白的表達和下調(diào)PI3K/Akt信號通路這幾個方面來提高多西他賽的療效和逆轉(zhuǎn)前列腺癌對多西他賽的耐藥。

3.2 調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和ROS生成

Zhang等[27]將槲皮素和紫杉醇聯(lián)合作用于PC-3細胞,檢測對PC-3細胞的生長抑制、細胞凋亡、細胞周期、活性氧(reactive oxygen species,ROS)的生成和幾種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic Reticulum,ER)應(yīng)激信號通路相關(guān)基因的表達的影響。觀察到,相較于單獨使用紫杉醇而言,槲皮素聯(lián)合紫杉醇能夠顯著抑制PC-3細胞增殖,使細胞周期阻滯在G2/M期,顯著增加ROS的含量和ER應(yīng)激以及與之相關(guān)的GRP78和CHOP基因表達、降低了hnRNPA1基因表達;在小鼠模型中,也得到相同效果,并且減少副作用的發(fā)生。因此認(rèn)為,槲皮素聯(lián)合紫杉醇通過下調(diào)hnRNPA1的表達,抑制腫瘤EMT,上調(diào)Caspase-3、CHOP、GRP78表達,增強紫杉醇對PC-3細胞抑制作用,并影響ROS生成和ER應(yīng)激促進癌細胞凋亡,進而逆轉(zhuǎn)紫杉醇耐藥的不良影響。

3.3 調(diào)控hnRNPA1剪接因子

前列腺癌剪接因子hnRNPA1的異常表達,產(chǎn)生AR-V7等AR突變體,逃避抗雄激素的結(jié)合,也是前列腺癌產(chǎn)生耐藥的主要機制之一。Ramakumar Tummala等[28]在槲皮素對hnRNPA1的影響研究中發(fā)現(xiàn),隨著槲皮素濃度的提升,hnRNPA1在基因和蛋白上的水平都受到抑制,AR和AR-V7的水平降低,這提示槲皮素能夠拮抗hnRNPA1、AR和AR-V7而發(fā)揮抗雄激素的作用;聯(lián)合恩雜魯胺后也發(fā)現(xiàn)能夠降低hnRNPA1、AR和AR-V7的水平,這提示槲皮素能夠與恩雜魯胺協(xié)同發(fā)揮抗雄激素的作用,使用熒光素酶測試發(fā)現(xiàn)聯(lián)合槲皮素和恩雜魯胺能使AR的轉(zhuǎn)錄活性降低,并抑制AR向靶基因啟動子募集。因此認(rèn)為槲皮素能夠通過抑制hnRNPA1、AR-V7的表達,下調(diào)AR信號,使對恩雜魯胺耐藥的前列腺癌細胞重新敏感。

3.4 調(diào)控C-met/PI3K/Akt信號通路

C-met與癌細胞的增殖、侵襲和遷移密切相關(guān)。SHU等[29]構(gòu)建的對阿霉素耐藥的PC/3R細胞株模型中發(fā)現(xiàn),隨著耐藥性的增加,C-met水平也隨之上調(diào),這提示C-met與前列腺癌的耐藥相關(guān)。槲皮素聯(lián)合阿霉素能夠誘導(dǎo)耐藥細胞株Caspase-3和Caspase-9的表達,并且下調(diào)了C-met以及下游的PI3K/Akt信號通路,這表明槲皮素聯(lián)合阿霉素能夠靶向下調(diào)C-met/PI3K/Akt信號通路實現(xiàn)逆轉(zhuǎn)前列腺癌對阿霉素的耐藥性。

4 調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)

惡性腫瘤的免疫治療近年來取得了相當(dāng)大的突破,免疫治療能夠抵消CD8+細胞毒性T細胞的抑制,能夠為患者提供長效的治療效果。但是對于前列腺癌這樣“冷”腫瘤,T細胞浸潤率最低,免疫治療效果不盡人意[30],目前Sipuleucel-T作為免疫治療藥物獲得了FDA的批準(zhǔn),使得前列腺癌的免疫治療初見曙光。近來有研究表明[31],前列腺癌組織內(nèi)高CD8+細胞毒性T細胞的浸潤也會對前列腺癌根治術(shù)后生存率有幫助并有機會提高前列腺癌對于免疫治療的敏感性。Young-Ok Son等[32]研究發(fā)現(xiàn),喂服白花蛇舌草提取物后,白花蛇舌草的糖蛋白和多糖能夠顯著提高小鼠血清的總IgG水平并誘導(dǎo)抗原特異性體液免疫應(yīng)答,大大激活了小鼠體內(nèi)的B淋巴細胞和Th1型T細胞,從而可以對癌細胞產(chǎn)生治療效果。這可能成為未來研究白花蛇舌草通過免疫治療前列腺癌的潛在方向。

5 抑制炎癥反應(yīng)

目前認(rèn)為前列腺癌的發(fā)生與前列腺炎密切相關(guān)[33],并且在前列腺癌的進展中也有不同程度的炎性浸潤[34-35]。韓國學(xué)者Sung Han Kim等[36]對自2009年至2017年為止五百五十萬余名二十歲以上的韓國男性隨訪,建立Cox回歸模型分析表明患有前列腺炎的人群比不患有前列腺炎的人群發(fā)生前列腺癌的風(fēng)險高1.56倍。李忠等[37]通過建立慢性非細菌性前列腺炎大鼠模型,觀察到白花蛇舌草提取物干預(yù)的模型組前列腺組織損傷較對比組下降,認(rèn)為白花蛇舌草提取物對于慢性非細菌性前列腺炎大鼠的炎癥反應(yīng)和損傷程度有昭著的遏制能力,其機制主要是下調(diào)Toll樣受體4/核因子κB(toll-likereceptor4/nuclear factor-κB,TLR4/NF-κB)通路。高慶和[38]納入120例濕熱瘀滯證前列腺炎患者的隨機對照實驗表明含有白花蛇舌草的歸黃方能夠顯著改善患者的臨床癥狀、提高患者生活質(zhì)量,并且較服用鹽酸坦索羅欣緩釋膠囊的對照組也有較好的療效;將CFA與前列腺蛋白提純液按1∶1配比注射于大鼠前列腺組織,建立自身免疫型Ⅲ型前列腺炎大鼠模型,用歸黃方灌胃,結(jié)果顯示歸黃方能夠減輕氧化應(yīng)激損傷,并且抑制NLRP3炎癥小體進而減少促炎細胞因子白細胞介素1β(interleukin-1β, IL-1β)和IL-18引起的炎癥級聯(lián)反應(yīng);此外還使用LPS和ATP刺激RWPE-1細胞凋亡細胞模型,使用含歸黃方的血清作用于實驗組,發(fā)現(xiàn)含藥血清可以抑制NLRP3炎癥小體活化,產(chǎn)生抑制RWPE-1細胞焦化的作用。因此,抑制炎癥反應(yīng)可能也是白花蛇舌草防治前列腺癌的途徑。

6 小結(jié)與展望

白花蛇舌草作為中醫(yī)常用的抗腫瘤藥物,能夠抑制前列腺癌細胞增殖、促進前列腺癌細胞凋亡、抑制前列腺癌的侵襲和遷移,并且具有逆轉(zhuǎn)化療耐藥和增強化療療效以及調(diào)節(jié)免疫功能、抗炎癥反應(yīng)的作用。在臨床上,白花蛇舌草已經(jīng)顯露出良好的治療效果,配合手術(shù)治療、化療、放療、內(nèi)分泌以及免疫聯(lián)合治療能夠緩解患者相關(guān)并發(fā)癥、提高生存率。

盡管白花蛇舌草對前列腺癌具有治療作用,但是現(xiàn)今的研究大多限于小鼠實驗以及體外細胞實驗,對其主要的作用機制及藥理機制還未能明確的闡釋,白花蛇舌草治療前列腺癌的作用靶點繁多,作用通路復(fù)雜,還需要進一步系統(tǒng)探討,其安全性和有效性仍缺乏大樣本臨床數(shù)據(jù)。此外,對于前列腺癌的多種轉(zhuǎn)移抵抗類型、前列腺癌的各個階段以及不同的中醫(yī)辨證分型,可能對應(yīng)著不同的腫瘤靶點和微環(huán)境,較少有研究展開詳細分類的研究。因此還需要對白花蛇舌草治療前列腺癌的機制進一步系統(tǒng)研究,對前列腺癌不同的時期以及不同的中醫(yī)辨證分型運用白花蛇舌草提供更加合理有效的依據(jù)。