馬小雨，羅彩萍，劉 悅,2 （.海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院, 上海 200433；2.上海市藥物(中藥)代謝產(chǎn)物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 200433）

我國的綠茶資源十分豐富，茶多酚系指綠茶中富含的多種酚類化合物，在綠茶中含量約為15%～30%[1]，具有降低血壓、調(diào)血脂、抗菌消炎、治療放射損傷、預(yù)防骨質(zhì)疏松、減肥、抗癌、抗氧衰老等廣泛的藥理作用[2-7]。

隨著大眾對(duì)天然健康產(chǎn)品需求日益增長(zhǎng)，茶多酚市場(chǎng)展現(xiàn)出強(qiáng)勁的發(fā)展動(dòng)力，茶多酚的提取工藝仍是影響茶多酚制品深加工和跨界開發(fā)利用的重要環(huán)節(jié)[8]。溶劑萃取法、超聲提取法、微波提取法、生物酶提取法和超臨界萃取法(SFE)等是業(yè)內(nèi)常用的茶多酚提取方式[9]。傳統(tǒng)有機(jī)溶劑萃取操作簡(jiǎn)便但存在提取得率及純度低、溶劑殘留、耗時(shí)長(zhǎng)等缺點(diǎn)；超臨界萃取法效率高但設(shè)備投資高因而推廣性不強(qiáng)；酶輔助提取條件溫和、環(huán)境友好，但成本較高，酶制劑易殘留；超聲提取法具有高效、快速的優(yōu)點(diǎn)，常與溶劑萃取法結(jié)合，以提高茶多酚得率并提升企業(yè)經(jīng)濟(jì)效益，但提取時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)影響提取效果[9-12]；微波提取法以穿透力強(qiáng)、可供選擇溶劑較多且用量少、產(chǎn)物活性優(yōu)良等為優(yōu)勢(shì)，適用于耐熱成分的提取[13-16]。常見的提取工藝優(yōu)化方法有均勻試驗(yàn)、正交試驗(yàn)(OED)、響應(yīng)面優(yōu)化(RSM)等[17]，均勻試驗(yàn)適用于多因素、多水平情況但追求最大化均勻性、忽略部分正交性導(dǎo)致了結(jié)果的不穩(wěn)定性[18-20]，正交試驗(yàn)具有試驗(yàn)量少的優(yōu)點(diǎn)但最佳參數(shù)僅局限于已設(shè)水平的組合[21]，在更加廣泛的范圍內(nèi)考察各因素間的交互作用并希望得到高精確度的回歸方程則多采用響應(yīng)面優(yōu)化法[22]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

高級(jí)綠茶，實(shí)驗(yàn)前置于50 ℃烘箱干燥，研磨至細(xì)粉；茶多酚標(biāo)準(zhǔn)品(含量≥98%，樂美天醫(yī)藥科技有限公司)。

試 劑: 無 水 乙 醇、KH2PO4、FeSO4·7H2O、Na2HPO4·12H2O (分析純，中國醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司)；沒食子酸(純度≥ 98%)、四水合酒石酸鈉鉀（分析純，德國Ehrenstorfer公司）。

1.2 儀器

儀器: IS09001電子分析天平(德國Sartorius公司)；G70D20CN1P-D2(S0)微波爐(廣東格蘭仕有限公司)；ANPEL 2300TH超聲波清洗器(上海安譜有限公司)；UV2310 紫外-可見分光光度計(jì)[天美(中國)科學(xué)儀器有限公司]；DHG-9240A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 溶液的配制

⑴精密稱取0.252 5 g FeSO4·7H2O、1.251 3 g四水合酒石酸鈉鉀，置于250 ml容量瓶中，加入適量的蒸餾水充分溶解后稀釋定容，搖勻即得酒石酸亞鐵溶液。

⑵精密稱取2.268 2 g KH2PO4置于250 ml容量瓶中，加入適量的蒸餾水并用超聲波輔助溶解，蒸餾水稀釋定容，搖勻即得0.066 67 mol/L Na2HPO4水溶液；精密稱取23.876 0 g Na2HPO4·12H2O置于1 000 ml容量瓶中，加入適量的蒸餾水并用超聲波輔助溶解，蒸餾水稀釋定容，搖勻即得0.066 67 mol/L KH2PO4水溶液。將上述磷酸二氫鉀水溶液和磷酸氫二鈉水溶液以3∶17的配比混合，攪勻，即得pH=7.5的磷酸鹽緩沖液[16]。

⑶精密稱取沒食子酸0.050 0 g于50 ml容量瓶，加入適量的蒸餾水充分溶解后，蒸餾水稀釋定容，搖勻即得1.0 mg/ml的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。

⑷精密稱取茶多酚標(biāo)準(zhǔn)品0.015 0 g于10 ml容量瓶，加入適量的蒸餾水充分溶解后，蒸餾水稀釋定容，搖勻即得1.5 mg/ml茶多酚標(biāo)準(zhǔn)品母液。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制: 取25 ml棕色容量瓶，分別加入0.00、0.25、0.50、0.75、1.0、1.25ml的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，再加入4.00 ml蒸餾水和5.00 ml酒石酸亞鐵溶液，最后加入磷酸鹽緩沖液稀釋定容，搖勻即得0.00、10.00、20.00、30.00、40.00、50.00 μg/ml沒食子酸系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。以0.00 μg/ml沒食子酸溶液作為參比溶液，測(cè)定波長(zhǎng)為540 nm對(duì)應(yīng)的吸光度，繪制沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算線性回歸方程[23,24]。

茶多酚標(biāo)準(zhǔn)品校正因子f測(cè)定: 精密量取茶多酚標(biāo)準(zhǔn)品母液0.50 ml于25 ml容量瓶，照上述沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制中的溶液配制方法，即得30.00 μg/ml茶多酚標(biāo)準(zhǔn)品溶液。測(cè)定540 nm波長(zhǎng)對(duì)應(yīng)吸光度，將此數(shù)據(jù)代入沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程求算ρ沒食子酸，按下列公式即可求得f。

1.3.3 綠茶中茶多酚提取及提取得率測(cè)定

準(zhǔn)確稱取1.0 g高級(jí)綠茶粉末于250 ml錐形瓶，以不同提取條件微波輔助提取，提取液減壓抽濾并棄去茶餅，準(zhǔn)確量取澄清提取液的體積后保存適量提取液，精密量取0.30 ml于25 ml棕色容量瓶，再加入4.00 ml蒸餾水和5.00 ml酒石酸亞鐵溶液，最后加入磷酸鹽緩沖液稀釋定容，搖勻即得提取液樣品溶液。在波長(zhǎng)540 nm處測(cè)定吸光度，茶多酚提取得率按下列公式計(jì)算:

式中：n為稀釋倍數(shù)；f為校正因子；ρ為沒食子酸質(zhì)量濃度( μg/ml)；m為茶葉質(zhì)量(g)；V為提取液體積( ml)[24]。

1.3.4 單因素實(shí)驗(yàn)

以提取時(shí)間、微波輸出功率、乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比為4項(xiàng)考察因素，設(shè)計(jì)相應(yīng)的5個(gè)適宜水平進(jìn)行茶多酚提取(見表1)，按“1.3.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行吸光度測(cè)定，計(jì)算茶多酚提取得率。

表1 單因素實(shí)驗(yàn)條件

1.3.5 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

依據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，選定各單因素的適宜水平，使用Design Expert 12.0.3.0統(tǒng)計(jì)軟件下Box-Behnken方法[25]，把茶多酚提取得率作為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)四個(gè)因素三種水平優(yōu)化提取工藝進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，得到各因素與響應(yīng)值的二次多項(xiàng)回歸方程及方差分析模型，預(yù)測(cè)最佳提取工藝并進(jìn)行驗(yàn)證。

2 結(jié)果與分析

2.1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

如圖1，在沒食子酸0.00 ～50.00 μg/ml濃度范圍內(nèi)，沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:A=0.015 9ρ+0.003 7(r=0.999 7)，吸光度A和沒食子酸濃度ρ線性關(guān)系良好。

圖1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 單因素對(duì)茶多酚提取得率的影響

2.2.1 提取時(shí)間對(duì)茶多酚提取得率的影響

如圖2所示，固定微波輸出功率、料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)，提取時(shí)間在10～90 s范圍內(nèi)，隨著提取時(shí)間延長(zhǎng)，茶多酚提取得率先增大后減小，提取時(shí)間為50 s時(shí)，茶多酚提取得率最大值為24.93%。原因推測(cè)由于時(shí)間過長(zhǎng)，茶葉中除了茶多酚的其他易溶于乙醇的成分被提取出來，導(dǎo)致茶多酚的醇提液飽和[26]。因此最佳提取時(shí)間為50 s。

圖2 提取時(shí)間對(duì)茶多酚提取得率的影響

2.2.2 微波功率對(duì)茶多酚提取得率的影響

如圖3所示，固定提取時(shí)間、料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)，微波輸出功率在70～630 w范圍內(nèi)，茶多酚提取得率隨微波功率的增加先上升后小幅降低，在提取時(shí)間為350 w時(shí)，茶多酚提取得率達(dá)到24.27%，為70～630 w范圍內(nèi)的最大值。原因推測(cè)為微波輸出功率過低無法有效破碎細(xì)胞使其釋放茶多酚，過高導(dǎo)致茶多酚被氧化破壞[27]。因此最佳微波輸出功率為350 w。同時(shí)，當(dāng)微波輸出功率為210 w和490 w時(shí)，茶多酚提取得率相對(duì)于其他功率下較高，提示我們考察微波輸出功率影響時(shí)，其范圍可適當(dāng)拓寬。

圖3 微波輸出功率對(duì)茶多酚提取得率的影響

2.2.3 料液比對(duì)茶多酚提取得率的影響

如圖4所示，固定提取時(shí)間、微波輸出功率、乙醇體積分?jǐn)?shù)的條件下，料液比在1∶20 (g/ml) ～1∶100 (g/ml)范圍內(nèi)，茶多酚提取得率隨料液比增加先增加，后逐漸穩(wěn)定，在料液比為 1∶40 (g/ml)和1∶60 (g/ml)時(shí)，茶多酚提取得率分別達(dá)到24.95%和24.96%（最大值）。原因推測(cè)為料液比過低時(shí)溶劑量不足，導(dǎo)致提取不完全，由于料液比過高，茶多酚已經(jīng)達(dá)到了較大溶出度、其他雜質(zhì)溶出部分競(jìng)爭(zhēng)茶多酚溶出空間[28]。因此最佳料液比為1∶60 (g/ml)。

圖4 料液比對(duì)茶多酚提取得率的影響

2.2.4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)茶多酚提取得率的影響

如圖5所示，固定提取時(shí)間、微波輸出功率、料液比，乙醇體積分?jǐn)?shù)在0%～80%范圍內(nèi)，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增加，茶多酚提取得率先增大后減小，乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí)，茶多酚提取得率最大值24.59%。因此，最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%。同時(shí)，把乙醇體積分?jǐn)?shù)為0%與其他水平時(shí)對(duì)應(yīng)的提取得率做對(duì)比，我們可以發(fā)現(xiàn)乙醇提取茶多酚效率遠(yuǎn)高于純水提取。

圖5 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)茶多酚提取得率的影響

2.3 茶多酚提取得率的響應(yīng)面分析

2.3.1 茶多酚提取得率的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)中各因素水平對(duì)茶多酚提取得率的影響結(jié)果，按照表2的響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表3所示。

表2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)各因素及水平

表3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)條件及結(jié)果

2.3.2 茶多酚提取得率的響應(yīng)面數(shù)據(jù)回歸方程擬合和方差分析:

把提取時(shí)間(A)、微波輸出功率(B)、料液比(C)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(D)作為自變量，茶多酚提取得率(%)Y作為因變量，進(jìn)行回歸方程擬合和方差分析，得回歸方程如下:

回歸模型極顯著(P＜0.000 1)，失擬項(xiàng)不顯著(P＞0.05)，r=0.967 0，結(jié)果表明優(yōu)化條件下茶多酚提取得率的實(shí)際值與二次回歸方程的預(yù)測(cè)值吻合良好（表4），說明該數(shù)學(xué)模型適用于高級(jí)綠茶中茶多酚提取工藝的預(yù)測(cè)。其中，A、C、D、AB、B2、C2、D2對(duì)響應(yīng)值茶多酚提取得率的影響極顯著(P＜0.01)，B、A2對(duì)響應(yīng)值茶多酚提取得率的影響顯著(P＜0.05)。

表4 回歸方程模型顯著性分析表

2.4 響應(yīng)面可視化分析

將提取時(shí)間A、微波輸出功率B、料液比C、乙醇體積分?jǐn)?shù)D中任意兩個(gè)因素作為X1、X2，將茶多酚提取得率設(shè)為響應(yīng)值Z，創(chuàng)建兩個(gè)因素相互作用的響應(yīng)平面圖。3D曲線單因素方向坡度越陡即斜率越大，反映出該單因素對(duì)茶多酚提取得率的影響越具顯著性； 3D曲線越陡、等高線輪廓呈橢圓形，反映兩個(gè)因素交互作用對(duì)茶多酚的提取得率有更顯著的影響[29-32]。結(jié)合方差分析表，各因素對(duì)茶多酚提取得率的影響如下: 料液比(C)＞提取時(shí)間(A)＞乙醇體積分?jǐn)?shù)(D)＞微波輸出功率(B)。同時(shí)，圖6直觀顯示提取時(shí)間A和微波輸出功率B交互作用對(duì)茶多酚提取得率的影響極為顯著，其余因素間交互作用不顯著，各交互作用對(duì)茶多酚提取得率的影響如下: AB＞BD＞BC＞AD＞CD＞AC。

圖6 各因素交互作用對(duì)茶多酚提取得率響應(yīng)面和等高線圖

2.5 茶多酚最佳提取工藝及驗(yàn)證

利用所得二次回歸方程模型預(yù)測(cè)綠茶中茶多酚的最佳提取工藝為: 提取時(shí)間37.41 s、微波輸出功率369.28 w、料液比1∶45.13 (g/ml)、乙醇體積分?jǐn)?shù)55.44%，該優(yōu)化條件下茶多酚預(yù)測(cè)提取得率為26.42%。從實(shí)際實(shí)驗(yàn)條件出發(fā)，將最佳提取條件修改為: 微波提取時(shí)間37s、微波輸出功率350 w、料液比1∶45 (g/ml)、乙醇體積分?jǐn)?shù)55%，并進(jìn)行三次平行重復(fù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，茶多酚平均提取得率為25.56%。

3 討論與結(jié)論

茶多酚是綠茶中的一類多酚活性物質(zhì)，本實(shí)驗(yàn)通過建立沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線、引入校正因子測(cè)算茶多酚提取得率。從支持綠色工藝和溶劑常用性角度，本實(shí)驗(yàn)采用常見的食品級(jí)溶劑乙醇萃取技術(shù)取代傳統(tǒng)的有害有機(jī)溶劑萃取技術(shù)[12]?；陧憫?yīng)面優(yōu)化法試驗(yàn)次數(shù)少、周期短優(yōu)勢(shì)[14]，為解決前期文獻(xiàn)中有關(guān)微波提取茶多酚的報(bào)道大多局限于單因素實(shí)驗(yàn)研究而缺乏優(yōu)化的系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)方案[33]、各因素水平選取范圍參差不齊[13,34]以及其他工藝優(yōu)化方法低精度、預(yù)測(cè)差等問題，本實(shí)驗(yàn)考察了微波提取時(shí)間、微波輸出功率、料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)4個(gè)單因素對(duì)茶多酚提取得率的影響，并確定各單因素適宜范圍，在此基礎(chǔ)上采用響應(yīng)面優(yōu)化方法預(yù)測(cè)了最佳提取條件，考慮到實(shí)際生產(chǎn)所需調(diào)整茶多酚最佳提取條件，并進(jìn)行三次平行重復(fù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明響應(yīng)面設(shè)計(jì)茶多酚提取得率實(shí)際值與理論值相差不大，證明響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)在優(yōu)化茶多酚提取工藝方面具有可靠性。綜上，響應(yīng)面優(yōu)化微波輔助茶多酚的提取工藝具有操作性強(qiáng)、生產(chǎn)周期短、生產(chǎn)成本較低、準(zhǔn)確度高、穩(wěn)定性強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)，能同步考察較多因素對(duì)工藝的綜合影響，為茶多酚的實(shí)際生產(chǎn)領(lǐng)域提供技術(shù)支撐，在茶多酚大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)方面具有較大的應(yīng)用潛力[35,36]。